聚合酶鏈反應

1、1第九章第九章聚合酶鏈反應（聚合酶鏈反應（PCRPCR）參見教材第參見教材第137137頁頁2一.概 述 聚合酶鏈反應（ polymerase chain reaction,PCR),又稱無細胞克隆技術，是一種特定DNA片段在體外快速擴增的新方法。 數(shù)小時達107-108倍 1985年，Centus公司Kary Mullis 發(fā)明 1993年因此獲諾貝爾化學獎3PCR擴增儀4變性53533535引物復性35355335P1P25延伸35355335P1P2再變性6再復性P1P1P2P2再延伸7P1P1P2P2短片段以指數(shù)形式擴增短片段以指數(shù)形式擴增長片段以線性形式擴增長片段以線性形式擴增最終主

2、產(chǎn)物片段長度在最終主產(chǎn)物片段長度在P1-P2之間之間8PCR循環(huán)的主要參數(shù)：循環(huán)的主要參數(shù)：1. 預變性：預變性：92C-95 C， 2-5min2. 變性：變性： 92C-95 C，30s-1min3. 復性：復性： 40 C-60 C，20s-2min4. 延伸：延伸： 70 C-75 C，30s-3min5. 總延伸：總延伸：72 C， 7min9三、三、PCRPCR的基本反應步驟的基本反應步驟變性變性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C10PCR擴增條件擴增條件 94, 5min 94, 1min 30 55, 1min 72, 1min 72, 7min 1112DNA Marke

3、r NGF2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp13141516三. PCR反應體系 緩沖液提供所需的pH環(huán)境 DNA模板：欲擴增的DNA樣品 dNTP： 四種脫氧核苷酸 MgCl2： 提供Mg+離子 引物： 根據(jù)欲擴增的DNA樣品設計 耐熱的DNA聚合酶： 來源于喜熱的細菌17耐熱的DNA聚合酶 Taq聚合酶喜溫性細菌Thermus aquaticus BM53聚合活性53外切活性 Pwo聚合酶 喜溫性細菌Pyrococcys woesei53聚合活性35外切活性（校正）耐熱 1000C 2小時 Tth聚合酶 喜溫性細菌Thermus thermophilus53聚

4、合活性當錳離子存在時具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性 C.therm聚合酶 喜溫性細菌Thermus thermophilus35外切活性（校正）當鎂離子存在時具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性181.PCR buffer: 72C 時，反應體系的pH值下降1個單位，接近于7.2 MgCl2 濃度12mmol/L，過量引起非特異擴增，不足使酶活性顯著降低，導致產(chǎn)物量少；2. 三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）： 是合成的原料，四種的濃度應相等，濃度一般為50200molL。193.引物： 0.1-1umol/L 高濃度 引物二聚體、非特異產(chǎn)物 低濃度 產(chǎn)率低4. Taq酶： 來自于水生棲熱菌（Thermus aquaticus),

5、最適反應溫度為7075oC。 常用濃度為12.5U/100ul，濃度過高缺乏專一性，過低則產(chǎn)物產(chǎn)量低。205. DNA樣品 按照常用的分子生物學方法制備的DAN或RNA樣品，其純度應能達到實驗要求。 質(zhì)量100-500ng 不含有蛋白酶、核酸酶、DNA結合酶、 Taq酶抑制劑6 .石蠟油 減少反應液的蒸發(fā)21四.影響PCR的主要因素1 . 溫度參數(shù)： 模板變性溫度-低溫不產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR不啟動；超過95C，影響Taq酶活性 退火溫度 溫度高-特異性強，引物與模板結合不 牢，DNA擴增效率下降 溫度低-產(chǎn)量高，特異性差 Ta=Tm-5=4(G+C)+2(A+T)-5 22 引物延伸溫度

6、： 取決于Taq酶最適溫度 70-75C大于1Kb的DNA片段，1min以上，并加入明膠或牛血清白蛋白，15-20%甘油有助于2.5KbDNA片段擴增23PCR擴增平臺期 循環(huán)到一定次數(shù)后，擴增產(chǎn)物不再以指數(shù)關系增加，而是以線性關系增加或不增加，稱為平臺期。 提前進入平臺期的原因 1.引物量不足 2.dNTP量不足 3.Taq酶失活 4.原始模板數(shù)量太多24 循環(huán)次數(shù)： 25-35次 次數(shù)太多-核苷酸錯配、非特異擴增多 進入平臺期，增加次數(shù)效果不大 次數(shù)太少-產(chǎn)率低252.引物設計 引物 與待擴增的DNA序列互補的寡核苷 酸片段。 5引物又稱上游引物，其核苷酸序列與模板 5序列相同。 3引物又

7、稱下游引物，其核苷酸序列與模板 3序列互補。26引物長度 人類基因組有30億bp，按照統(tǒng)計學的計算，隨機組合的17 個堿基的核苷酸序列，在人類基因組中可能出現(xiàn)一次。 引物長度一般為20-24個堿基。有時也見50甚至更多的堿基。27 引物組成：堿基隨機分布，避免聚嘌呤或聚嘧啶的存 在，G、C含量一般在40-60%引物內(nèi)部避免形成次級結構如發(fā)卡結構兩個引物之間不應互補，避免形成引物 二聚體28兩條引物應避免有同源序列，以免兩條引物競爭模板的同一位點。引物5端： 可加上酶切位點或熒光素等引物3端：5-6個堿基與靶DNA嚴格配對293 TTCAAGCATCTCCAAGAGTTGGCATA CGGTAA

8、G5 引物 5 GTGAATTCTCTC AACCGTAT 3注：紅色部分為限制性內(nèi)切酶切割位點，堿基與模版鏈不完全互補。30逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR） 原理：提取組織細胞總原理：提取組織細胞總RNARNA，以其中的，以其中的mRNAmRNA為模為模板，采用板，采用需要的需要的引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成反轉(zhuǎn)錄成cDNAcDNA。再以再以cDNAcDNA作為模板，通過特作為模板，通過特異性引物，異性引物，PCRPCR擴增目的基因。擴增目的基因。應用：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；獲取目的基因；應用：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物

9、；獲取目的基因； 合成合成cDNAcDNA探針；探針；31選取適當?shù)慕M織，提取總RNA以mRNA做模版加入引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、合成cDNA的第一鏈逆轉(zhuǎn)錄酶水解mRNA鏈合成cDNA的第二鏈加入引物、Taq酶，做常規(guī)PCR 擴增出大量的cDNA分子32RT-PCR操作需注意的問題： 1.模版RNA應嚴格純化，； 2.避免RNA酶污染； 3.所用與實驗有關的物品，需用0.1的 焦炭酸二乙酯（DEPC)浸泡處理。33增效PCR（booster PCR） 當擴增少于1000拷貝的模板DNA時會遇到兩個問題：一是形成引物二聚體，一是非特異擴增，而特異擴增片段產(chǎn)量降低。對于這種情況，可設置二步PCR

10、，先用較低濃度的引物進行初級PCR，此時由于引物少，形成引物二聚體的可能減少，但它并不影響靶序列的擴增，只是由于引物少產(chǎn)物亦少。約經(jīng)1520個循環(huán)后補充引物量，以初級PCR產(chǎn)物為模板進行擴增，靶序列的產(chǎn)量將相應增加。342. 2. 巢式巢式PCRPCR（nest PCRnest PCR）此時也是進行二步PCR，與上面不同的是，第二級PCR需另行設置反應體系，并應用另外的PCR引物，此時引物的位置位于初級PCR引物的內(nèi)側，用初級PCR產(chǎn)物做模板，進行第二步PCR，這樣只有初級PCR中特異的擴增片段才能被二級引物擴增。除了達到增效PCR同樣的目的外，還提高了最終產(chǎn)物的特異性。35巢巢式式PCR采用

11、兩對引物進行采用兩對引物進行PCR，其中第二對引物位，其中第二對引物位于第一對引物內(nèi)于第一對引物內(nèi)。P1上P1下P2上P2下P1上上P2上上36First roundprimersFirst roundPCRSecond roundprimersSecond roundPCRGene of interest37 在同一PCR體系中加入數(shù)對PCR引物，如果這些引物的退火溫度相近，并且所覆蓋的區(qū)域不重疊，這樣的反應體系可同時擴增多個DNA片段。 多重PCR常用來檢測同一基因的多個外顯子的缺失，或在檢測缺失設置內(nèi)對照。38定量PCR測定靶基因的原始拷貝數(shù) 目前常用Taq man法.該法的原理是:反應底物中加入熒光探針,探針中的熒光基團與淬滅基團距離近,熒光基團發(fā)出的熒光被淬滅基團淬滅,隨著反應的進行,結合在靶序列上的熒光探針被Taq酶水解,熒光基團發(fā)射的熒光,被監(jiān)測系統(tǒng)接收。據(jù)熒光強度,計算靶基因的原始拷貝數(shù).39實時定量實時定量PCRPCR技術原理技術原理40 SYBR熒光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的游離的SYBR染料分子不會發(fā)射熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。41原位PCR 將組織或細胞固定于玻片上，經(jīng)消化處理后，在玻片