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認(rèn)證主體：孫**（實(shí)名認(rèn)證）

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IP屬地：天津 上傳時(shí)間：2022-02-05 格式：DOC 頁(yè)數(shù)：8 大?。?19KB 積分：15 舉報(bào) 版權(quán)申訴

1、分子機(jī)制研究套路（九）組蛋白（去）乙酰化課題：組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶A A在B B基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用1.1.概念介紹：表觀遺傳學(xué)是研究基因的核甘酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)了可遺傳的變化的一門遺傳學(xué)分支學(xué)科。表觀遺傳的現(xiàn)象很多，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA。染色質(zhì)的基本組成單位是核小體，核小體是由146bp堿基對(duì)纏繞由H2A、H2B、H3、H4各2個(gè)組成的組蛋白八聚體構(gòu)成的，各個(gè)核小體之間由H1連接，最終組成染色質(zhì)。組蛋白修飾指對(duì)組蛋白N端尾部氨基酸的修飾，包括乙?；⒘姿峄?、甲基化和泛素化等。在組蛋白的各種修飾方式中，組蛋白乙酰化的研究較為透徹。組蛋白的乙?；饕l(fā)生在賴

2、氨酸殘基上，賴氨酸側(cè)鏈含有氨基，在生理?xiàng)l件下帶正電荷，從而能夠和含有磷酸基團(tuán)的DNA緊密結(jié)合，被乙酰化后使得正電荷被中和，無(wú)法和DNA緊密結(jié)合使得染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，促進(jìn)基因的表達(dá)。組蛋白的乙酰化動(dòng)態(tài)平衡由大量不同的組蛋白去乙酰轉(zhuǎn)移酶（HDAC）和組蛋白乙?；福℉AT）調(diào)節(jié)。如前所述，組蛋白的乙酰化能夠促進(jìn)某些基因的激活，因此通過(guò)使用HDAC抑制劑相對(duì)提高組蛋白乙酰化的程度，能夠顯著上調(diào)大量具有保護(hù)作用的基因，達(dá)到治療某些疾病的目的。目前臨床使用的HDAC抑制劑包括丙戊酸（VPA）、曲古菌素A、丁酸苯酯等。早期，人們認(rèn)為組蛋白修飾只是提供一個(gè)信號(hào)，指導(dǎo)與染色體功能相關(guān)的非組蛋白與染色體的結(jié)合。隨

3、著研究的深入，人們?cè)絹?lái)越清楚地認(rèn)識(shí)到這些修飾的某種組合對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有極其深刻的影響，“組蛋白修飾密碼”假說(shuō)誕生了。這個(gè)假說(shuō)推測(cè)特定的組蛋白修飾是同一個(gè)組蛋白或另一個(gè)組蛋白分子進(jìn)一步修飾的決定因素，特定的共價(jià)修飾，修飾發(fā)生的順序特征以及各種修飾的組合模式形成了復(fù)雜的“組蛋白密碼”，這種密碼決定了基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，這種密碼會(huì)被調(diào)控染色體結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)解讀。2 2 . .示意圖:HistoneacetytationHistoneacetytationHDACnhHDACnh IxltwsIxltwsVPA,T5A)VPA,T5A)圖1:組蛋白乙?；膭?dòng)態(tài)調(diào)節(jié)過(guò)程渀最渀最111111MIlici

4、tlMIlicitl渀最渀最iMliHtiiMliHti渀最渀最I(lǐng)plbci*jiHigir$Iu1Iplbci*jiHigir$Iu1而 E渀最渀最tilvftilvf|Vi11Ci4144111Hl|Vi11Ci4144111Hl圖2:核心組蛋白八聚體的結(jié)構(gòu)和組蛋白尾部可能的共價(jià)修飾3 3 . .研究思路：3.1HDAC抑制劑使B基因mRNA上調(diào)，且使B基因啟動(dòng)子組蛋白H4乙?；缴?33.2組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶A過(guò)表達(dá)增強(qiáng)B基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性3基因啟動(dòng)子上有A蛋白的結(jié)合，過(guò)表達(dá)A蛋白能升高細(xì)胞內(nèi)源性B基因mRNA水平.4H2DH2DN-N-基因啟動(dòng)子上的兩個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn)被確認(rèn)4酰轉(zhuǎn)移

5、酶A和轉(zhuǎn)錄因子GATA-1協(xié)同激活B基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，B基因啟動(dòng)子上兩個(gè)GATA-1位點(diǎn)對(duì)于A的功能是必要的5酰轉(zhuǎn)移酶A與轉(zhuǎn)錄因子GATA-1和Sp1協(xié)同增強(qiáng)B基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性7HDAC抑制劑使B基因mRNA上調(diào)，且使B基因啟動(dòng)子組蛋白H4乙酰化水平升高為弄清楚組蛋白乙酰化是否與B基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)，用HDAC抑制劑丁酸鈉aBu和TSA處理cell-1細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，進(jìn)彳TRT-PCR分析。結(jié)果顯示HDAC抑制劑可使B基因mRNA水平升高。由于HDAC抑制劑是通過(guò)誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子組蛋白高乙酰化而影響基因表達(dá)的，因此，接下來(lái)考察HDAC抑制劑對(duì)B基因的上調(diào)是否也是通過(guò)升高B基因啟動(dòng)子組蛋白乙

6、酰化水平實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如預(yù)期所料，HDAC抑制劑處理細(xì)胞后，B基因mRNA轉(zhuǎn)錄上調(diào)的同時(shí)，伴隨著B基因啟動(dòng)子組蛋白H4乙酰化水平的明顯升高。蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶A過(guò)表達(dá)增強(qiáng)B基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性既然B基因的表達(dá)與B基因啟動(dòng)子組蛋白乙?；揎椨嘘P(guān)，那么，到底是何種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶與B基因啟動(dòng)子的功能直接相關(guān)呢？經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)調(diào)查，我們推測(cè)可能是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Ao為了探討組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶A在B基因轉(zhuǎn)錄中的作用，需構(gòu)建B基因啟動(dòng)子的報(bào)告基因質(zhì)粒PGL3-E-BP（B基因promoter）。將從人類基因組克隆出來(lái)的B基因啟動(dòng)子片段插入螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因載體PGL3-Enh

7、ancer。將不同量的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶A表達(dá)質(zhì)粒（0、0.5、1、2、3、4聞）與1間報(bào)告基因質(zhì)粒PGL3-E-BP瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，裂解細(xì)胞，測(cè)定相對(duì)熒光素酶活性。結(jié)果顯示：組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶A能夠以劑量依賴性的方式增強(qiáng)B基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。接下來(lái)，將PGL3-E-BP、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶A表達(dá)質(zhì)粒和腺病毒癌蛋白E1A的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。已知E1A能夠與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶A的HAT區(qū)結(jié)合從而抑制A的HATE1A-36（缺失與A結(jié)合的結(jié)構(gòu)域）代替E1A時(shí)，A的作用不受影響，證明了A在激活B基因啟動(dòng)子的過(guò)程中，它的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性是必需的。A+AT與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時(shí)，對(duì)

8、B基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活作用顯著減弱，更進(jìn)一步明確了A的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性在B基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活中是必不可少的。注釋：1 1）此步驟中關(guān)于組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶A的推斷，需根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研或選擇不止一個(gè)可能候選者，進(jìn)行逐一排查，但實(shí)驗(yàn)方法同上。2）關(guān)于腺病毒癌蛋白E1A,根據(jù)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶A的不同，可能會(huì)有所變化，如果無(wú)法找到可與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶A的HAT區(qū)結(jié)合從而抑制A的HAT活性的蛋白，則此部分可省略。B基因啟動(dòng)子上有A蛋白的結(jié)合，過(guò)表達(dá)A蛋白能升高細(xì)胞內(nèi)源性B基因mRNA水平前面已證實(shí)A蛋白對(duì)B基因啟動(dòng)子報(bào)告基因的激活作用，A蛋白是否對(duì)內(nèi)源的B基因表達(dá)也發(fā)揮作用，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)揭示。如果能發(fā)現(xiàn)

9、A蛋白確實(shí)與B基因啟動(dòng)子結(jié)合，那將是最直接的證據(jù)。染色質(zhì)免疫沉淀（CHIP）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在B基因啟動(dòng)子上確實(shí)有乙酰轉(zhuǎn)移酶A蛋白存在。在證實(shí)了A蛋白確實(shí)能與B基因啟動(dòng)子結(jié)合后， 接下來(lái)對(duì)A蛋白激活內(nèi)源B基因轉(zhuǎn)錄的功能進(jìn)行進(jìn)一步考察。用A蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染cell-1細(xì)胞，使A蛋白在cell-1細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)，提取細(xì)胞RNA,Real-timePCR分析細(xì)胞內(nèi)B基因mRNA的水平，結(jié)果顯示：A蛋白過(guò)表達(dá)細(xì)胞中B基因的mRNA水平顯著高于對(duì)照組，與HDAC抑制劑NaBu處理的結(jié)果相近。B基因啟動(dòng)子上的兩個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn)被確認(rèn)Sp1Sp1是哺乳動(dòng)物遍在表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，參與大量基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，它能與靶基

10、因啟動(dòng)子區(qū)的富含GC的元件相互作用，既能激活基因轉(zhuǎn)錄，又能抑制基因的轉(zhuǎn)錄，究竟發(fā)揮哪種作用取決于它結(jié)合的元件及與之作用的輔因子。在B基因啟動(dòng)子上游-164/-158和-146/-139有2個(gè)可能的Sp1結(jié)合序列GGGAGGG,為弄清Sp1蛋白是否真的與這兩個(gè)序列結(jié)合，通過(guò)電泳遷移率（EMSA）分析。首先體外合成了包含上述兩段序列的寡核甘酸鏈，野生型：5-CCAGAGCTGGGGGAGGGGGTACACTAGAGGGAGGGGCTACTTTGG-3;突變體：5-CCAGAGCTGGGGGAAAGGGTACACTAGAGGGAAAGGCTACTTTGG-3。以生物素標(biāo)記制備探針，將Sp1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)

11、染293T細(xì)胞，培養(yǎng)24h后提取核蛋白，進(jìn)行EMSA分析。結(jié)果顯示：核提取物使含有2個(gè)可能Sp1位點(diǎn)的探針發(fā)生凝膠電泳遲滯現(xiàn)象；當(dāng)實(shí)驗(yàn)體系中再加入100倍的未標(biāo)記探針時(shí)，遲滯現(xiàn)象消失，競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明該遲滯現(xiàn)象確實(shí)是我們所研究的探針與核蛋白結(jié)合產(chǎn)生的；那么，核提取物中與探針結(jié)合的蛋白究竟是不是Sp1呢？為回答這個(gè)問(wèn)題，在實(shí)驗(yàn)體系中加入Sp1抗體，如預(yù)期所料，由于抗體的特異性結(jié)合使探針-蛋白質(zhì)復(fù)合物的質(zhì)量增大，因此在電泳中發(fā)生了super-shift現(xiàn)象；為了證實(shí)Sp1與探針結(jié)合的位點(diǎn)確實(shí)是2個(gè)可能的Sp1位點(diǎn)，通過(guò)位點(diǎn)突變的探針代替野生型探針，再做EMSA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果無(wú)法觀察到用野生型探針時(shí)所看到的

12、遲滯帶。以上所有結(jié)果充分說(shuō)明了B基因啟動(dòng)子上這2個(gè)相近的元件在體外能與Sp1結(jié)合。注釋：1）關(guān)于Sp1與B基因結(jié)合這部分，主要是為了后續(xù)發(fā)現(xiàn)做鋪墊，如果課題不涉及，可以省略這部分。但是，由于Sp1可能和很多基因的啟動(dòng)子結(jié)合，如果您在完成前期實(shí)驗(yàn)后，不確定您興趣基因的特異性轉(zhuǎn)錄因子，可以嘗試SP1。2）本部分對(duì)EMSA實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)和結(jié)果解釋非常全面，可作為EMSA實(shí)驗(yàn)參考的范例。酰轉(zhuǎn)移酶A和轉(zhuǎn)錄因子GATA-1協(xié)同激活B基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，B基因啟動(dòng)子上兩個(gè)GATA-1位點(diǎn)對(duì)于A的功能是必要的作為轉(zhuǎn)錄輔激活因子，乙酰轉(zhuǎn)移酶A必須由特定的轉(zhuǎn)錄因子招募到靶基因的啟動(dòng)子上才能行使其功能。在B基因啟動(dòng)子上有兩

13、個(gè)典型的轉(zhuǎn)錄因子GATA-1的結(jié)合位點(diǎn)（-124bp和-100bp）,GATA-1可能招募乙酰轉(zhuǎn)移酶A到B基因啟動(dòng)子。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)我們將B基因啟動(dòng)子報(bào)告基因PGL3-E-BP、乙酰轉(zhuǎn)移酶A（或AAHAT）以及GATA-1表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。相對(duì)熒光素酶活性測(cè)定結(jié)果顯示：報(bào)告基因PGL3-E-BP單獨(dú)與乙酰轉(zhuǎn)移酶A或GATA-1表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時(shí)，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)錄活性分別只增加了l倍和1.5倍，當(dāng)與乙酰轉(zhuǎn)移酶A和GATA-1表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時(shí)，啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性增加了近20倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了二者單獨(dú)作用的加和，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄輔激活子乙酰轉(zhuǎn)移酶A和轉(zhuǎn)錄因子GATA-1在B基因啟動(dòng)子的激活中具有強(qiáng)烈的協(xié)

14、同作用。另外，A出AT和GATA-1共轉(zhuǎn)染時(shí)，對(duì)啟動(dòng)子的激活作用相當(dāng)于二者單獨(dú)作用的加和，所以GATA-1介導(dǎo)的乙酰轉(zhuǎn)移酶A對(duì)B基因轉(zhuǎn)錄的作用有賴于乙酰轉(zhuǎn)移酶A的HAT活性的，這些結(jié)果清晰地表明了乙酰轉(zhuǎn)移酶A的HAT活性在B基因轉(zhuǎn)錄中的重要作用， 同時(shí)又一次證明了組蛋白 （或轉(zhuǎn)錄因子） 的乙?；揎梾⑴c了B基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。上面的工作證實(shí)了GATA-1介導(dǎo)了乙酰轉(zhuǎn)移酶A在B基因轉(zhuǎn)錄中的作用。 在B基因啟動(dòng)子上有兩個(gè)GATA-1結(jié)合位點(diǎn)（-124bp和-100bp）,那么這兩個(gè)位點(diǎn)中的哪一個(gè)參與了乙酰轉(zhuǎn)移酶A的功能，還是兩個(gè)都需要。為此我們構(gòu)建了三個(gè)啟動(dòng)子位點(diǎn)突變體報(bào)告基因質(zhì)粒：PGL3-E-BP

15、M1（-124bp位點(diǎn)突變）、PGL3-E-BPM2（-100bp位點(diǎn)突變）和PGL3-E-BPM3（-124bp和-100bp兩個(gè)位點(diǎn)都突變）。然后將它們分別與GATA-1和乙酰轉(zhuǎn)移酶A共轉(zhuǎn)染，相對(duì)熒光素酶活性分析結(jié)果顯示，與野生型PGL3-E-BP相比，兩個(gè)位點(diǎn)分別突變（PGL3-E-BPM1和PGL3-E-BPM2）時(shí)，乙酰轉(zhuǎn)移酶A和GATA-1對(duì)啟動(dòng)子的協(xié)同激活作用明顯降低，當(dāng)兩個(gè)位點(diǎn)都突變（PGL3-E-BPM3）時(shí)，乙酰轉(zhuǎn)移酶A和GATA-1對(duì)B基因啟動(dòng)子的協(xié)同作用不復(fù)存在，由此可知兩個(gè)GATA-1位點(diǎn)都參與了乙酰轉(zhuǎn)移酶A的招募，而且兩個(gè)位點(diǎn)的作用是互相促進(jìn)的。接下來(lái)我們想知道，G

16、ATA-1招募乙酰轉(zhuǎn)移酶A激活B基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄是否與組蛋白乙?；嘘P(guān)呢？通過(guò)報(bào)告基因染色質(zhì)免疫沉淀(ReporterChIP)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示當(dāng)乙酰轉(zhuǎn)移酶A和GATA-1表達(dá)載體與野生型報(bào)告基因(PGL3-E-BP)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，乙酰轉(zhuǎn)移酶A在報(bào)告基因啟動(dòng)子上的結(jié)合有明顯的增加，啟動(dòng)子組蛋白H4的乙?；酵瑫r(shí)也有明顯的升高，然而當(dāng)把GATA-1位點(diǎn)突變體報(bào)告基因PGL3-E-BPM3(兩個(gè)GATA-1位點(diǎn)突變卜乙酰轉(zhuǎn)移酶A和GATA-1表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染時(shí)，啟動(dòng)子組蛋白H4的乙酰化水平?jīng)]有明顯的變化，說(shuō)明GATA-1協(xié)同乙酰轉(zhuǎn)移酶A確實(shí)能提高啟動(dòng)子處的組蛋白乙酰化水平從而促進(jìn)B基因的轉(zhuǎn)錄。酰轉(zhuǎn)移酶

17、A與轉(zhuǎn)錄因子GATA-1和Sp1協(xié)同增強(qiáng)B基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性前面已證實(shí)Sp1參與B基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活， 但具體如何發(fā)揮作用需要進(jìn)一步確證。 為了探究Sp1是否參與對(duì)乙酰轉(zhuǎn)移酶A的招募，我們將PGL3-E-BP與乙酰轉(zhuǎn)移酶A和Sp1表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，相對(duì)熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示乙酰轉(zhuǎn)移酶A和Sp1能協(xié)同激活PGL3-E-BP啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)把GATA-1表達(dá)質(zhì)粒加入到同一個(gè)共轉(zhuǎn)染體系，啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性提高了50倍。與前面結(jié)果相似，乙酰轉(zhuǎn)移酶AHAT與Sp1不再表現(xiàn)出協(xié)同作用，乙酰轉(zhuǎn)移酶AHAT、Sp1和GATA-1的共轉(zhuǎn)染同樣沒(méi)有協(xié)同作用，再一次證明了乙酰轉(zhuǎn)移酶A的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性在調(diào)控B基因表達(dá)中重要性。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)，可以得出結(jié)論：轉(zhuǎn)錄輔因子乙酰轉(zhuǎn)移酶A參與了B基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，它通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子GATA-1及遍在轉(zhuǎn)錄因子Sp1相互作用強(qiáng)烈激活B基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。. .應(yīng)用案例：HanL,LuJ,PanL,WangX,ShaoYHanS,HuangB:Histoneacety