米糠蛋白提取工藝優(yōu)化及分離純化kdh

1、FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2010年第35卷第5期 Extracting and purification of rice bran proteinBAI Li,YANG Zhong-liang,JIE Wei-guang(Heilongjiang Oriental College,Harbin 150080Abstract:Rice bran protein as a new type of protein resources is widely used to improve food nutrition andstructures.Cell wall enzy

2、mes on the extraction of rice bran protein plays an important role,selects cellulose is the best enzyme and determines the best dosage of enzyme and optimum reaction conditions.In optimum conditions,the protein extraction rate is 43.93%.And successively by DEAE -52anion -exchange and SephadexG -75ge

3、l filtration chromatography purifies the crude rice bran protein,SDS -polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGEtests the effective of purification,the relative molecular of the protein is 20.0ku.Key words:rice bran protein;extracting;purification;molecular白莉,楊忠亮,接偉光(黑龍江東方學院,哈爾濱150080摘要:米糠蛋白作為一種新型

4、蛋白質(zhì)資源,廣泛用于改善食品的營養(yǎng)和結(jié)構(gòu)。細胞破壁酶類對米糠蛋白提取有重要作用,從中選取纖維素酶為最佳酶類,并確定了該酶的最佳用量以及最適反應條件,在最適條件下,蛋白提取率為43.93%。并先后經(jīng)DEAE-52陰離子交換及SephadexG-75凝膠過濾層析對米糠粗蛋白進行純化,SDS-聚丙烯胺電泳(SDS-PAGE檢測純化效果明顯,為相對分子量20.0ku 的一種蛋白質(zhì)。關(guān)鍵詞:米糠蛋白;分離;純化;分子量中圖分類號:Q 503文獻標志碼:A文章編號:1005-9989(201005-0173-04米糠蛋白提取工藝優(yōu)化及分離純化收稿日期:2009-08-26作者簡介:白莉(1980,碩士,講

5、師,研究方向為生化與分子生物學。米糠是稻谷脫殼后依附在糙米上的表面層,是一種廉價、利用率低但營養(yǎng)豐富的稻米加工副產(chǎn)品。中國是世界上最大的稻米生產(chǎn)國,年產(chǎn)量約為1.85億t ,米糠作為大米加工的副產(chǎn)品,可利用資源相當豐富1,但米糠的綜合開發(fā)利用及相應理論研究仍處于較低水平。米糠蛋白的營養(yǎng)價值雖高,但過去僅作為飼料應用,造成極大的浪費,如能將米糠中的蛋白質(zhì)和其他營養(yǎng)成分提取出來,經(jīng)濟效益將非?？捎^2。因此尋找一種米糠蛋白的最佳水解提取工藝,探索一種實用、高效的米糠蛋白的分離、純化方法是十分必要的。并測定其分子量,為進一步研究米糠蛋白的結(jié)構(gòu)和組成提供一定的理論基礎和實驗依據(jù),為深度開發(fā)米糠產(chǎn)品帶來巨

6、大經(jīng)濟效益作良好鋪墊。1材料與方法1.1材料·173· 新鮮粗米糠(蛋白質(zhì)含量約為14.0%,經(jīng)60目篩子除雜質(zhì),向過篩米糠中以16的比例加入乙醚石油醚(11的混合液,室溫下攪拌3h,4000r/min 離心10min,沉淀在通風櫥中室溫晾干,得脫脂米糠為實驗材料。1.2方法1.2.1米糠蛋白的提取脫脂米糠5g加緩沖液50mL(料液比110適當溫度攪拌加酶反應一定時間滅酶(60、30min離心(3000r/min、30min收集上清液測蛋白質(zhì)含量。1.2.2細胞破壁酶選擇利用細胞破壁酶處理,可以降解植物細胞壁的纖維素成分,使細胞壁內(nèi)有效成分釋放,提高細胞內(nèi)蛋白的提取率。根據(jù)

7、表1比較蛋白質(zhì)提取率,從中選出最佳細胞破壁酶。1.2.3米糠蛋白的純化DE-52纖維素陰離子交換層析初步純化:DE-52纖維素經(jīng)0.05mol/L Tris-HCl(pH7.1平衡緩沖液室溫平衡24h后裝柱,在裝柱過程中不斷攪拌使得柱床面平整。用平衡緩沖液平衡12h,流速為3mL/min4。將3mL米糠蛋白粗提液緩慢上樣,先用平衡緩沖液以3mL/min的流速洗脫,編號收集各蛋白。沖洗至基線后,接著用含0.1mol/L NaCl、0.5mol/ L NaCl的平衡緩沖液分段洗脫5,編號收集流出液。測OD280,電泳檢測。取濃度最高的峰,合并相應管,備用。Sephadex G-75凝膠過濾層析柱再

8、次純化: Sephadex G-75用0.05mol/L Tris-HCl(pH7.1平衡緩沖液15平衡后裝柱,將經(jīng)纖維素DE-52層析純化后合并的樣品上樣。以0.05mol/L Tris-HCl (pH7.1平衡緩沖液0.5mL/min的流速進行洗脫6。編號收集各蛋白,每管收集3mL,沖洗至基線后則停止。分別測OD280,有兩個吸收峰。蛋白質(zhì)樣品濃度的測定:大多數(shù)蛋白質(zhì)在280 nm波長處最大光吸收,這是由于蛋白質(zhì)中有Tyr、Trp和phe存在的緣故,利用這個特征性吸收,可以計算蛋白質(zhì)的含量7。如果沒有干擾物的存在,在280nm處的吸收可用于測定0.10.5mg/mL含量的蛋白質(zhì)溶液。部分純

9、化的蛋白質(zhì)常含有核酸,核酸在260nm波長處有最大吸收。有核酸時,所測得的蛋白質(zhì)濃度必須作適當校正,一般按下述公式計算:蛋白質(zhì)濃度(mg/mL=1.45A280-0.74A260SDS-PAGE測純化蛋白相對分子量以及純化結(jié)果:借鑒生化實驗技術(shù)8。2結(jié)果與分析2.1細胞破壁酶的選擇為了比較各種細胞壁酶對蛋白質(zhì)提取的效果,篩選出合適的提取用酶,分別采用-淀粉酶、纖維素酶、果膠酶對米糠進行水解,比較蛋白質(zhì)提取率,結(jié)果如表2所示。添加不同的細胞破壁酶均可以提高米糠中蛋白的提取率。由于米糠細胞壁的主要成分為纖維類物質(zhì),它們與一些蛋白質(zhì)通過氫鍵緊密纏繞在一起,阻礙了酶的水解作用,使這些蛋白質(zhì)無法溶出。而

10、其他成分含量較少,因此纖維素酶對蛋白質(zhì)提取率的影響最高,對于米糠是一種較好的細胞破壁酶。2.2纖維素酶提取米糠蛋白的單因素分析2.2.1pH對蛋白質(zhì)提取率的影響采用pH單因素實驗,選用不同的pH對米糠進行水解,其他作用條件為:溫度50,S=10%,E/S=2%,時間2 h,實驗結(jié)果如表3所示。在pH4.05.0范圍內(nèi),隨pH的升高,蛋白質(zhì)的提取率呈上升趨勢,在pH5.0時,蛋白質(zhì)提取率最大,為43.93%。隨后再隨pH值的升高,蛋白質(zhì)提取率基本沒有多大變化。2.2.2溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響采用溫度單因素實驗,選用不同溫度對米糠進行水解,其他作用條件為:pH5.0,S=10%,E/S=2%,時

11、間2 h,實驗結(jié)果如表4所示。米糠淀粉的糊化溫度為5861,為防止淀粉表1不同細胞破壁酶水解條件酶的種類pH溫度/E/S/%S/%時間/h 空白對照-502102-淀粉酶 6.0502102纖維素酶 5.0502102果膠酶 4.0352102表2不同細胞破壁酶對蛋白質(zhì)提取率的影響酶類蛋白質(zhì)提取率/%空白對照12.79a-淀粉酶37.85纖維素酶43.93果膠酶30.73表3pH對蛋白質(zhì)提取率的影響pH 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0提取率/%38.4242.3143.9341.1140.29·174·FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2010年

12、第35卷第5期 表7纖維素DE-52陰離子交換層析樣品蛋白含量合并的樣品合并后命名總體積/mL OD 260OD 280蛋白質(zhì)量/mg 8184C 119 2.468 2.48333.7066130、131C 25.51.6141.3674.3328在蛋白質(zhì)提取過程中糊化溶出,提取溫度應控制在50以下。從表4中可以看出,纖維素酶的最適作用溫度50,所以酶解溫度應控制在4550,以便充分發(fā)揮酶的活力。2.2.3酶用量對蛋白質(zhì)提取率的影響采用酶用量單因素實驗,選用不同酶用量對米糠進行水解,其他作用條件為:pH5.0,溫度50,S=10%,時間2h ,實驗結(jié)果如表5所示。在米糠蛋白提取過程中,添加適

13、量的纖維素酶可以提高蛋白質(zhì)的提取率。當添加量為由1%增加到2%時,蛋白質(zhì)提取率增幅很大,當從2%到3%時,隨添加量的增加,蛋白質(zhì)提取率反而下降,可能隨添加量的增加,溶解在米糠水解液中的可溶性纖維含量也有所增加,導致最終的蛋白質(zhì)提取率下降。當添加量由3%增加到5%時,蛋白質(zhì)提取率只有緩慢的增加,所以2%為纖維素酶的最適添加量。2.2.4時間對蛋白質(zhì)提取率的影響采用時間單因素實驗,選用不同時間對米糠進行水解,其他作用條件分別為:pH5.0,溫度50,S=10%,E/S=2%,實驗結(jié)果如表6所示。在米糠蛋白提取過程中,隨著時間的延長,蛋白質(zhì)的提取率呈增加趨勢。當時間為2h 時,蛋白質(zhì)的提取率為43.

14、93%,雖然34h 能加大提取率但效果不明顯,從節(jié)約時間和能源的角度看選擇2h 為最適反應時間。2.3米糠蛋白的分離純化2.3.1粗蛋白的纖維素DE-52陰離子交換層析純化米糠蛋白粗提液經(jīng)纖維素DE-52陰離子交換層析柱分離時,因為米糠蛋白在pH7.1時,帶負電荷,用DE-52纖維素柱層析分離時被交換上,不存在于流出液中,當換用含NaCl 的洗脫液洗脫時,氯離子能將被交換上的米糠蛋白置換下來,所以米糠蛋白存在于洗脫液中,收集的洗脫峰即為初步純化含有目的蛋白的樣品。用紫外分光光度計檢測流出液,得到3個流出峰,收集了77管,編號為1-77。然后用含0.1mol/L NaCl 的0.05mol/L

15、Tris-HCl (pH7.1的平衡緩沖液繼續(xù)洗脫,得到1個洗脫峰,收集了51管,編號78-128。接著換含0.5mol/L Na -Cl 的0.05mol/L Tris-HCl(pH7.1的平衡緩沖液繼續(xù)洗脫,得到1個洗脫峰,收集了81管,編號129-210。曲線如圖1所示。該曲線表明在收集的210個管子中8184和130131號富含大量的蛋白質(zhì)。因為洗脫峰中的目的蛋白,所以將洗脫峰1中的8184號管合并,編號C 1,將洗脫峰2中的130、131號管合并,編號C 2。為了解C 1、C 2中的蛋白質(zhì)種類及含量多少,對C 1、C 2進行電泳檢測,結(jié)果如圖2所示。C 1、C 2二者極為相似,都有明

16、顯的3條帶,只是C 1的條帶重,C 2的條帶輕,分子量也大致相同。電泳檢測結(jié)果與曲線大致相符,洗脫峰的主峰分布在8184、130131號管處,并且主峰含有至少3類不同的量很大的蛋白質(zhì)。為驗證電泳結(jié)果的可靠性,測定合并后蛋白質(zhì)的OD 260、OD 280、體積,計算蛋白質(zhì)含量,結(jié)果如表7所示。表4溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響溫度/3040506070提取率/%30.7435.2843.9328.0224.90表5酶用量對蛋白質(zhì)提取率的影響E/S/%12345提取率/%39.8043.9341.6742.8642.98表6時間對蛋白質(zhì)提取率的影響時間/h 1234蛋白質(zhì)提取率/%36.7743.934

17、5.9846.02圖1粗蛋白在纖維素DE-52陰離子交換層析柱上的初步純化32.521.510.50-0.5A 28050100150200250時間/min標樣C 1C 235.0ku 45.0ku 26.0ku 20.0ku 14.4ku圖2粗蛋白經(jīng)纖維素DE-52陰離子交換層析收集合并的C 1、C 2樣品電泳圖流出峰1流出峰2流出峰3洗脫峰113182130818384洗脫峰2·175· 根據(jù)表7可以看出,其中C 1蛋白質(zhì)含量較多,C 2蛋白質(zhì)含量較少,與層析和電泳結(jié)果相符。2.3.2Sephadex G-75凝膠過濾層析柱進行再次純化將通過纖維素DE-52陰離子交換

18、層析純化后得到的C 1、C 2蛋白質(zhì)樣品合并,總體積為24.5mL ,進一步通過SephadexG-75凝膠層析柱,利用分子排阻原理將不同分子量的蛋白分開。經(jīng)凝膠層析后得到2個較為明顯的洗脫峰,合并3-6號管,編號為G 1、合并27、28號管,編號為G 2。結(jié)果如圖3所示。由于待純化的蛋白質(zhì)分子量較小,所以該蛋白質(zhì)洗脫時間應較長,所以目的蛋白應存在于G 2洗脫峰中。為了解G 2中的蛋白質(zhì)種類及含量,對G 2進行電泳檢測,電泳結(jié)果如圖4所示。從圖4可看出,過柱后得到一條相對分子量約為20.0ku 的單帶,證實經(jīng)上述方法得到了一條純度較高米糠蛋白G 2。為驗證電泳結(jié)果的可靠性,測定合并后蛋白質(zhì)的OD 260、OD 280、體積,計算蛋白質(zhì)溶液含量,結(jié)果如表8所示。3結(jié)論米糠蛋白是存在于稻米米糠中的蛋白質(zhì)統(tǒng)稱,具有很高的營養(yǎng)價值。通過本實驗,首先對脫脂米糠進行酶解粗提,進一步采用DE-52陰離子交換層析、Sephadex G-75凝膠層析兩種純化方法,對米糠蛋白結(jié)合SDS-PAGE 電泳分析,最終分離純化到一種純凈蛋白質(zhì),并且經(jīng)電泳檢測為單一蛋白條帶,相對分子量為20.0ku ,為后續(xù)純化蛋白功能與性質(zhì)研究做鋪墊。參考文獻:1陳正行,等.米蛋白和米糠蛋白開發(fā)利用J.糧食與油脂,2002,(4:6-92陳義勇,等.米糠和米糠蛋白的深度開發(fā)現(xiàn)狀J.