重組牛堿性成纖維細胞生長因子凝膠

1、重組牛堿性成纖維細胞生長因子凝膠Chongzu Niu Jianxing Chengxianwei Xibao Shengzhangyinzi NingjiaoRecombinant Bovine Basic Fibroblast Growth Factor Gel本品系由高效表達牛堿性成纖維細胞生長因子基因的大腸桿菌，經(jīng)發(fā)酵、分離和高度純化后，加入凝膠基質(zhì)制成。含適宜穩(wěn)定劑、防腐劑，不含抗生素。1.基本要求生產(chǎn)和檢定用設施、原料及輔料、水、器具、動物等應符合現(xiàn)行版中國藥典三部“凡例”的有關要求。2 制造2.1 工程菌菌種2.1.1名稱及來源重組牛堿性成纖維細胞生長因子工程菌株系由帶有牛堿性成

2、纖維細胞生長因子基因的重組質(zhì)粒轉化的大腸桿菌菌株。2.1.2 種子批建立應符合 “生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的規(guī)定。2.1.3 菌種檢定主種子批和工作種子批的菌種應進行以下各項全面檢定。2.1.3.1 劃種LB瓊脂平板應呈典型大腸桿菌集落形態(tài)，無其他雜菌生長。2.1.3.2染色鏡檢應為典型的革蘭氏陰性桿菌。2.1.3.3 對抗生素的抗性應與原始菌種相符。2.1.3.4 電鏡檢查（工作種子批可免做）應為典型大腸桿菌形態(tài)，無支原體、病毒樣顆粒及其他微生物污染。2.1.3.5 生化反應應符合大腸桿菌生物學性狀。2.1.3.6 牛堿性成纖維細胞生長因子表達量在搖床中培養(yǎng)，應不低于原始菌種的表達

3、量。2.1.3.7 質(zhì)粒檢查該質(zhì)粒的酶切圖譜應與原始重組質(zhì)粒相符。2.1.3.8目的基因核苷酸序列檢查（工作種子批可免做）目的基因核苷酸序列應與批準序列相符。2.2 原液制備2.2.1 種子液制備將檢定合格的工作種子批菌種接種于適宜的培養(yǎng)基（可含適量抗生素）中培養(yǎng)，供發(fā)酵罐接種用。2.2.2 發(fā)酵用培養(yǎng)基采用適宜的不含抗生素的培養(yǎng)基。2.2.3 種子液接種及發(fā)酵培養(yǎng)在滅菌培養(yǎng)基中接種適量種子液。在適宜溫度下進行發(fā)酵，應采用經(jīng)批準的發(fā)酵工藝，并確定相應的發(fā)酵條件，如溫度、PH值、溶氧、補料、發(fā)酵時間等。2.2.4 發(fā)酵液處理用適宜的方法處理菌體。2.2.5 純化采用經(jīng)批準的純化工藝進行純化，使其

4、達到3.1項要求，即為牛堿性成纖維細胞生長因子原液。加入穩(wěn)定劑，除菌過濾后保存于適宜溫度，并規(guī)定其有效期。2.2.6 原液檢定按3.1項進行。23 半成品制備采用的基質(zhì)應符合凝膠劑基質(zhì)要求（附錄I M）。2.3.1配制與除菌應按經(jīng)批準的配方進行。2.3.2凝膠制備應按經(jīng)批準的工藝進行。凝膠劑應均勻、細膩，在常溫時保持膠狀，不干涸或液化。2.3.3半成品檢定按3.2項進行。2.4 成品2.4.1 分批應符合“生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。2.4.2 分裝應符合“生物制品分裝和凍干規(guī)程”規(guī)定。2.4.3 規(guī)格應為經(jīng)批準的規(guī)格。2.4.4 包裝應符合“生物制品包裝規(guī)程” 和附錄I M的有關規(guī)定。3 檢定3

5、.1 原液檢定3.1.1 生物學活性依法測定（附錄X G）。3.1.2 蛋白質(zhì)含量依法測定（附錄VI B 第二法）。3.1.3 比活性 為生物學活性與蛋白質(zhì)含量之比，每1mg 蛋白質(zhì)應不低于1.7×105IU。 3.1.4 純度3.1.4.1 電泳法依法測定（附錄IV C）。用非還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度為15.0，加樣量應不低于10g（考馬斯亮藍R250染色法）或5g（銀染法）。經(jīng)掃描儀掃描，純度應不低于95.0。 3.1.4.2 高效液相色譜法依法測定（附錄III B）。色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以A相（三氟乙酸-水溶液：取1.0ml三氟乙酸加

6、水至1000ml，充分混勻）、B相（三氟乙酸-乙腈溶液：取1.0ml三氟乙酸加入色譜純乙腈至1000ml，充分混勻）為流動相，在室溫條件下，進行梯度洗脫（070%B相）。上樣量不低于10mg，于波長280nm處檢測，以牛堿性成纖維細胞生長因子色譜峰計算理論塔板數(shù)應不低于2000，按面積歸一化法計算，牛堿性成纖維細胞生長因子主峰面積應不低于總面積的95.0%。3.1.5 分子量依法測定（附錄IV C）。用還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度為15.0，加樣量應不低于1.0g，制品兩條蛋白帶的分子質(zhì)量應分別為17.5kD+1.875kD和22.0kD+2.20kD。3.1.6 外源性D

7、NA殘留量每1支應不高于10ng（附錄 IX B）。 3.1.7 等電點主區(qū)帶應為9.010.0,供試品的等電點與對照品的等電點圖譜一致（附錄IV D）。3.1.8 紫外光譜掃描用水或生理氯化鈉溶液將供試品稀釋至約100g/ml500g/ml，在光路1cm、波長230nm360nm下進行掃描,最大吸收峰波長應為277±3nm（附錄II A）。3.1.9 肽圖（每半年測定一次） 依法測定(附錄VIII E),應與對照品圖形一致。 3.2 半成品檢定3.2.1 生物學活性應按經(jīng)批準的方法預處理供試品，依法測定（附錄 X G ），應符合規(guī)定。3.2.2無菌檢查應按經(jīng)批準的方法預處理供試品，依法檢查（附錄XII A），應符合規(guī)定。3.3 成品檢定除外觀、裝量檢查外，應按經(jīng)批準的方法預處理供試品后，進行其余各項檢定。3.3.1 鑒別試驗按免疫印跡法（附錄VIII A）或免疫斑點法（附錄VIII B）測定，應為陽性。3.3.2 物理檢查3.3.2.1 外觀 應為無色透明凝膠。3.3.2.2 裝量依法檢查(附錄V F)，應符合規(guī)定。3.3.3 pH值按經(jīng)批準的方法對樣品進行預處理,應為6.57.5（附錄V A）。（按1：5的比例用水對凝膠進行稀釋）3.3.4 生物學活性按經(jīng)批準的方法對樣品進行預處理，應為標示量的70%200%（附錄X