野生食用菌菌種分離與鑒定技術(shù)規(guī)范

1、DB福建省地方標(biāo)準(zhǔn)DB/×××2007野生食用菌菌種分離與鑒定技術(shù)規(guī)范（報(bào)批稿）200×-××-××發(fā)布200×-××-××實(shí)施發(fā)布福建省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局DB/×××2007前言本標(biāo)準(zhǔn)由福建省科技廳和福建省農(nóng)業(yè)廳提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：福建省三明真菌研究所、福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心、福建省科技廳星火辦。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：黃年來、上官舟建、林汝楷、謝寶貴、林津添、張運(yùn)茂、郭美英、朱堅(jiān)、陳曉、吳小平、鄧優(yōu)錦、劉新銳。1DB/×

2、5;×2007野生食用菌菌種分離與鑒定技術(shù)規(guī)范1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了野生食用菌菌種采集、采集前準(zhǔn)備、標(biāo)本采集與保存、菌種分離與鑒別等。本標(biāo)準(zhǔn)僅適用于野生食用菌,不適用于有毒真菌。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單位（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究可以使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T12728-2006食用菌術(shù)語3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1食用菌ediblemushroom可食用的大型真菌，常包括食藥

3、兼用和藥用大型真菌，多數(shù)為擔(dān)子菌，如雙孢蘑菇、香菇、草菇、牛肝菌等，少數(shù)為子囊菌，如羊肚菌、塊菌等。GB/T12728-2006，定義2.1.43.2藥用菌medicinalmushroom有藥用價(jià)值的高等(大型)真菌。GBT12728-2006，定義2.1.53.3木腐菌woodrottingmushroom自然生長在木本植物上可引起木材腐爛的大型真菌。人工栽培的食用菌多數(shù)是木腐菌，如香菇、金針菇等。GB/T12728-2006，定義2.3.103.4草腐菌strawrottingmushroom自然生長在草本植物殘?bào)w上的大型真菌，如草菇、雙孢蘑菇。GB/T12728-2006，定義2.3.

4、113.52土生菌geophilousmushroom自然生長在富含有機(jī)質(zhì)的土壤中的各類大型真菌。如羊肚菌。GB/T12728-2006，定義2.3.143.6糞生菌coprophilousmushroom以腐熟動(dòng)物糞便為營養(yǎng)源的腐生大型真菌。如糞污鬼傘。GB/T12728-2006，定義2.3.153.7菌根真菌mycorrhizalfungus能與植物根系發(fā)生互惠共生關(guān)系形成菌根的真菌。如松口蘑與赤松。由于真菌菌絲深入植物根部程度的不同又有外生菌根和內(nèi)生菌根之分。GB/T12728-2006，定義2.3.193.8分離isolation從基物、子實(shí)體、菌絲培養(yǎng)物中取得純菌種的過程。GB/T

5、12728-2006，定義2.4.343.9核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)NuclearRibosomalDNAInternalTranscribedSpacers在真菌中，18S、5.8S、28S核糖體RNA的基因串聯(lián)在一起，同時(shí)被轉(zhuǎn)錄，這三個(gè)基因之間被一段DNA序列隔開（ITS），18S和5.8S、5.8S和28S的基因之間的間隔區(qū)分別稱為ITS1和ITS2，ITS序列具有較高的保守性，種內(nèi)不同菌株之間的ITS序列同源性很高，但種間的差異較大，它可用于種的鑒別。4.采集4.1采集前的準(zhǔn)備4.1.1工具采集前應(yīng)備齊工具。采集工具包括小鏟子或小鋤子、鋸子、高枝剪、柴刀、小籃子、采集袋、小瓶子、接種針、酒精燈

6、、試管培養(yǎng)基、小型烘干設(shè)備、照相機(jī)、閃光燈、三腳架、海拔表或衛(wèi)星定位儀、鉛筆、油膏筆、標(biāo)本記錄表、尺子、放大鏡、當(dāng)?shù)亟煌▓D、指南針及其它需要物品等。4.1.2著裝要求應(yīng)穿長袖衣服、長筒褲，扎緊褲腳，以防止被雜草割傷或被蚊蟲、螞蟥等叮咬。4.1.3防護(hù)用品應(yīng)帶上草帽、雨傘、雨衣等遮陽防雨用具，以及防蚊蟲叮咬的清涼油、風(fēng)油精、蛇藥、防中暑藥和解渴充饑的開水和干糧等。4.1.4其它3應(yīng)預(yù)先計(jì)劃安排交通工具。應(yīng)根據(jù)行動(dòng)計(jì)劃安排人員，并根據(jù)調(diào)查范圍劃分小組，原則上每個(gè)小組必須為2人以上。應(yīng)制定聯(lián)絡(luò)方式。最好有適當(dāng)?shù)南驅(qū)А?.2標(biāo)本采集與記錄4.2.1野生食用菌采摘用于菌種分離的材料主要是子實(shí)體，在采摘時(shí)

7、應(yīng)盡可能保持子實(shí)體完整，包括菌環(huán)、菌柄基部、菌托等。4.2.2標(biāo)本存放每一種標(biāo)本應(yīng)單獨(dú)存放，防止互相干擾影響鑒定。應(yīng)使用采集袋或樣品盒等，以防止標(biāo)本互相擠壓。4.2.3拍照標(biāo)本采集前應(yīng)進(jìn)行拍照。應(yīng)拍攝子實(shí)體整體（包括菌環(huán)、菌柄基部、菌托等）、菌褶或菌管部分的照片，以及子實(shí)體周邊的生態(tài)照片。4.2.4記錄采集標(biāo)本時(shí)應(yīng)及時(shí)詳細(xì)記錄標(biāo)本信息。記錄標(biāo)本信息用鉛筆或油筆較好。標(biāo)本記錄表見附錄A。5菌種分離5.1培養(yǎng)基分離菌種常用的培養(yǎng)基見附錄B。5.2菌種分離方法根據(jù)采集菌株的營養(yǎng)類型和標(biāo)本的完好程度決定是否分離菌種，所有木腐菌、草腐菌、糞生菌和部分土生菌應(yīng)盡可能進(jìn)行菌種分離，菌根真菌如紅菇、乳菇、牛肝

8、菌等不用分離。常用的分離方法包括：a.組織分離法。以無菌操作方式，用接種針或刀片取子實(shí)體內(nèi)部的一小塊組織接入分離培養(yǎng)基中，在適宜的溫度條件下培養(yǎng)以獲得菌絲純培養(yǎng)；b.耳木分離法。以無菌操作方式，用接種針或刀片取耳木內(nèi)部的一小塊組織接入分離培養(yǎng)基中，在適宜的溫度條件下培養(yǎng)以獲得菌絲純培養(yǎng)；c.孢子彈射法。以無菌操作方式，在一支裝有分離用培養(yǎng)基的試管內(nèi)用接種針取一小塊瓊脂粘在試管壁上，再取一小片菌褶粘在試管壁上的瓊脂塊上，試管靜置過夜，讓菌褶上的擔(dān)孢子彈射到分離用培養(yǎng)基上，在適宜的溫度條件下培養(yǎng)以獲得菌絲純培養(yǎng)。6標(biāo)本保存6.1標(biāo)本在采集當(dāng)天應(yīng)在記錄和分離菌種后及時(shí)烘干。6.2干標(biāo)本帶回單位后應(yīng)及

9、時(shí)處理如分檢、復(fù)烤、裝標(biāo)本瓶，并及時(shí)放入標(biāo)本館妥善保存。7菌種鑒別7.1形態(tài)鑒定對標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)特征描述后，鑒定方法見附錄C。47.2菌種鑒別7.2.1形態(tài)鑒別觀察分離獲得的野生菌種的菌落形態(tài)及菌絲的顯微特征，與該種類的其它菌株進(jìn)行比較，若相同，可判斷所獲得的菌種是正確的，不是雜菌。對于所采集到的野生菌目前還沒有對照菌株，可進(jìn)行出菇試驗(yàn)，若長出的子實(shí)體與野生子實(shí)體標(biāo)本的形態(tài)特征相同，說明所獲得的菌種是正確的，不是雜菌。若形態(tài)鑒別無法確認(rèn)菌種或有疑義，應(yīng)另作分子鑒別。7.2.2分子鑒別7.2.2.1DNA提取野生菌種在適合的液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，收集菌絲，提取總DNA。同時(shí)取其子實(shí)體標(biāo)本，也提取總DN

10、A。7.2.2.2ITS-PCR野生菌種及其子實(shí)體的DNA分別進(jìn)行ITS-PCR。PCR反應(yīng)的組成及程序如下：PCR反應(yīng)的組成：1l模板DNA(含30ngDNA)，2.5l10×buffer緩沖液，2ldNTP(each2.5mmol/L)，1lPrimerITS1(ITS1：5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG)(10mol/L),1lPrimerITS4(ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC)(10mol/L)，0.3lTaqDNAPolymerase(5U/ul),用ddH2O將總體積補(bǔ)至25l。ITS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94預(yù)變性5min；94變性4

11、5s，55退火45s，72延伸1min,35個(gè)循環(huán)，72延伸10min。7.2.2.3ITS擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測取ITS-PCR產(chǎn)物5l加上2l6×溴酚藍(lán)上樣緩沖液，混勻,進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠（含GoldviewTMDNA染料）電泳，160V恒壓電泳1h，通過紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并照像。7.2.2.4ITS片段的克隆與測序ITS-PCR產(chǎn)物與T-Vector連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抗性菌落經(jīng)過菌落PCR驗(yàn)證后，委托生物公司測序。7.2.2.5菌種鑒別采用DNAMAN軟件比對野生菌種及其子實(shí)體的ITS序列，如果兩條序列完全吻合，說明所獲得的菌種是正確的，不是雜菌。如果同源性較低（低于98%），說明所分離的菌種與子實(shí)體標(biāo)本不是同一種,可能是雜菌。5附錄A（規(guī)范性附錄）菌類野外采集記錄表*采集號(hào)_標(biāo)本采集份數(shù)_菌名產(chǎn)地生境針葉林闊葉林混交林灌叢草地草原陽坡陰坡河邊路旁凹地中名：學(xué)名：經(jīng)緯度：基物：地上腐木立木糞上朽葉海拔：米土質(zhì)：紅壤、沙壤、粘壤、沙地、采集時(shí)間：_年_月_日別名：習(xí)性形態(tài)特征備注采集人：鑒定人：*注：