（精選）胰蛋白酶活性測定

1、實驗一 胰蛋白酶活性測定實驗目的：掌握測定胰蛋白酶濃度、活性、比活的原理與方法。實驗原理：胰蛋白酶相對分子量23.7 KD，主要水解肽鏈中堿性氨基酸與其它氨基酸相連接的肽鍵，此外還能水解堿性氨基酸形成的酯鍵， 如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解為H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。胰蛋白酶所催化的上述反應中，產(chǎn)物BA對253 nm 的光吸收遠大于BAEE，因此可以在實驗起始點把253 nm 的消光值調為零，然后記錄反應體系對253 nm 的消光值的增量，并把這個增量作為測定胰蛋白酶的活性指標。酶活單位定義：在底物

2、BAEE濃度1m mol/L，光程1 cm，波長253nm，溫度25 0C，測量體積3mL,.條件下吸光值每分鐘遞增0.001（DA/min=0.001）為1個BAEE酶活單位。胰蛋白酶制劑中蛋白質濃度含義 ：胰蛋白酶含量一般E1%表達。這個值的含義是：濃度為1% 酶蛋白，在1cm光徑下，對紫外280nm的消光值。不同廠家、不同產(chǎn)品的E1%值有很大差別。E1% 值越高，表明酶制劑中酶蛋白含量越高。 由于酶制劑中蛋白質含量各不相同，所以用酶制劑配制E1%的蛋白質溶液時，按照廠家對產(chǎn)品的E1% 的測定值配制溶液。 在本實驗中，胰蛋白酶酶蛋白樣品采用SIGMA 公司生產(chǎn)的產(chǎn)品,生產(chǎn)公司對展品的描述是

3、對280nm紫外吸收值15.3， 配制胰蛋白酶標準溶液可根據(jù)廠家的這個說明。器材以試劑：器材，電子天平，紫外分光光度計，微量加樣器。試劑： 標準胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。1胰蛋白酶活性測定：1）配制E1% 的胰蛋白酶溶液每組取E1%=15.3的 胰蛋白酶樣品10mg 放到1ml去離子水中，充分溶解后，放入冰中保存。2)按照表1 的要求配制試驗體系所需其它各種溶液.3)按照表1的順序進行測定標準胰蛋白酶的活性。表1 胰蛋白酶活性測定加樣順序試劑 步驟1：空白調零 步驟2：樣品測定0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖液,pH 8.0 , 1.5 mL 1.5

4、mL2.0 m mol/L BAEE 1.5 mL 1.5 mL250C預熱5min 250C預熱5min 胰蛋白酶: 10mg/mL 0 mL 10 mL蒸餾水 10 mL 0 mL 充分搖勻 充分搖勻 步驟1：DA253 nm/min 調0 - 步驟2：DA253-nm/min - 記錄 在步驟2樣品測定中，加入酶液后立即蓋上蓋迅速混勻計時，每半分鐘讀數(shù)一次，共讀34min。測得的結果要使A253nm/min控制在0.050.100之間為宜，若偏離此范圍則要適當增減酶量（5 mL -20 mL之間，空白試驗相應增減等體積水）后重新測定，一直到A253nm/min值落在0.050.100之間

5、為止。3分別求算：1)標準胰蛋白酶溶液（濃度10mg/mL）的酶活和比活：計算方法：i)胰蛋白酶活性單位數(shù)計算：ii)胰蛋白酶比活計算: (用BAEE單位數(shù)/mg胰蛋白酶表示比活)實驗二 胰蛋白酶動力學測定實驗目的：初步掌握以下幾個酶動力學參數(shù)測定與求算方法：米氏常數(shù)Km,最大反應速度Vmax,轉換數(shù)kcat,特異性常數(shù)kcat,/Km。實驗原理：已知胰蛋白酶遵守米氏方程，可以通過測定底物濃度與反應速度間的關系測定與求算這個酶的諸動力學參數(shù)。胰蛋白酶可以水解堿性氨基酸的羧基所生成的肽鍵、酰胺建和酯鍵。在本實驗中，利用胰蛋白酶水解酰胺鍵活性的性質，以苯甲酰-L-精氨酰-對硝基苯胺（BAPA）作底

6、物測定這個酶的動力學參數(shù)，反應式如下：反應最適pH8.1,最適溫度25 0C。反應產(chǎn)物之一：對硝基苯胺 (p-Nitroaniline，4 -NA)呈黃色，對405nm波長光的摩爾吸光系數(shù)為9870，但底物BAPA 和另一個產(chǎn)物BA對405nm波長的光基本不吸收， 因此本實驗測定光波的波長設在405nm上，把起始反應的吸光值調為0，記錄消光值的變化。L-BAPA最大濃度低于5´104mol/L時這個酶促反應符合米氏方程，可用Hanes作圖法求動力學參數(shù)。Hanes作圖法是單倒數(shù)作圖法，把米氏方程變形為：在實驗中設定一系列底物濃度Si，測定每一個底物濃度條件下的反應速度ni,然后用Si

7、/ni 對Si作圖，可以得到一條線段，線段在y軸的截距是Km/Vmax, 線段的延長線在x軸的截距是-Km，據(jù)此可以得到Km和 Vmax值；kcat=Vmax / Et。Et是酶的初始濃度，已在實驗設定為已知,因此kcat可以得出；特異性常數(shù)Km/ kcat可根據(jù)上述已知數(shù)計算出來。器材與試劑：器材：756紫外-可見分光光度計，恒溫水浴鍋，分析天平，秒表，容量瓶，移液器。試劑：10.1mol/L pH8.1的Tris-HCI緩沖液（含0.4%CaCl2）：取 0.2mol/L Tris（Mr=121.14）100mL與0.2mol/L HCI 52.4mL混勻，加入0.8gCaCl2,蒸餾水定

8、容到200mL（pH值需用計pH校正）。21mmol/L DL-BAPA（Mr=434.9）水溶液：稱取43.49mg BAPA，蒸餾水溶解并加熱到80 0C以上，完全溶解后置冰水中冷卻，定容到100mL。 這個濃度為1mmol/L的DL-BAPA溶液命名為第六組母液，按照逐步稀釋原則配制下列溶液濃度系列：0.8m mol/L （第五組母液，25mL）； 0.6m mol/L （25mL，第四組母液）；0.4m mol/L （25mL，第三組母液）；0.2 m mol/L （10 mL，第二組母液）；0.1 m mol/L （10mL，第一組母液）。360%（V/V）乙酸溶液4胰蛋白酶溶液，該

9、酶的比活ñ1.0´104 BAEE 單位/mg蛋白 實驗步驟：1 計算胰蛋白酶加樣體積：在本實驗中加入胰蛋白酶的量是60mg，實驗1 已經(jīng)測到胰蛋白酶的比活和濃度（mg/mL），根據(jù)這些值計算加入體系的酶液體積的mL數(shù)。2 實驗溶液系統(tǒng)：本實驗有6組實驗組成。實驗順序按照表2的加樣程序執(zhí)行。 離曲線ianIMEI 表2. 測定Km 和Vmax值加樣表組BAPA母液濃度（m mol/L）加入BAPA母液（mL）加入Tris-HCI（mL）加入胰蛋白酶（mL）加入60%乙酸（mL）反應體系底物BAPA濃度（m mol/L）nA4051.0.1樣品1, 2.0對照 1, 2.01

10、.51.6n00.40.4S10.0520.2樣品2, 2.0對照2, 2.01.51.6n00.40.4S20.130.4樣品3, 2.0對照3, 2.01.51.6n00.40.4S3 0.240. 6樣品4, 2.0對照4, 2.01.51.6n00.40.4S40.350.8樣品5, 2.0對照5, 2.01.51.6n00.40.4S50.461 .0樣品6, 2.0對照6, 2.01.51.6n00.40.4S60.525 0C 保溫5 min后，搖勻，秒表計時，準確反應2min后加入0.4mL 60%的乙酸溶液，搖勻終止反應。反應溶液總量應達到4mL,不足部分可加蒸餾水補足。對照

11、試管不加入胰蛋白酶，只加入0.4mL 60%的乙酸溶液。最后分別記錄樣品和對照的A405 值，每組種兩者的差值D A405 代入下式即可得到對應于Si的ni表2列出的是6個實驗，鑒于目前實驗室尚沒有12個槍頭的加樣，所以每一個實驗都可獨立進行。需要特別注意：1）比活大于1.0´104 BAEE u/mg protein的胰蛋白酶制劑，純度范圍是90%-100%，一般可達到95%-97%。在計算動力學參數(shù)時，如無特殊精確要求，可按照胰蛋白酶100%的近似值計算。在本試驗中，可根據(jù)濃度胰蛋白酶濃度10mg/ml， 純度100%, 每個試管要求加入質量數(shù)60mg，計算出每個試管加入的胰蛋白

12、酶溶液微升數(shù)。2）在進行動力學參數(shù)計算時，要進行胰蛋白酶質量-摩爾數(shù)轉換，如無特殊要求，也可以把胰蛋白酶純度近似為100%.3）如果有求精確, 但產(chǎn)品說明沒有給出胰蛋白酶在固形物中的百分含量，就需配制一定濃度的固形物溶液，首先測定蛋白質濃度，通過求算蛋白質總量，得到蛋白質在酶制劑中的重量比。然后通過雙向電泳，圖像掃描，把掃描結果輸入計算軟件，按照軟件步驟，求算胰蛋白酶在全部蛋白樣品中的百分比。把實驗設定的每一個Si和測定到的對應的Vi換算成Si/Vi后,填入表3，作圖求Km，Vmax表3. Hanes 作圖的數(shù)據(jù) Si/ nI : S1/n1 S2/n2 S3/n3 S4/n4 S5/n5 S6/n6 Si : S1 S2 S3 S4 S5 S6用S/n 對S作圖可得到一條線段，線段與軸的截距是Km/Vmax，線段延