噬菌體展示技和其應(yīng)用ppt課件

1、2022-2-31phage display噬菌體展示技術(shù)及其應(yīng)用食品學(xué)院 廖振林email：2022-2-32 噬菌體展示技術(shù)是將各種多肽或蛋白質(zhì)以融合蛋白的形式表達(dá)并展示在噬菌體表面，同時將其遺傳密碼包含于噬菌體內(nèi)部，這使得蛋白質(zhì)的功能與其基因密碼有機(jī)的連結(jié)在一起。 2022-2-33非展示系統(tǒng) 展示系統(tǒng)2022-2-34the expression of exogenous peptides on the surface of filamentous bacteriophage was initially described by smith in 1985. since his fir

2、st study, different molecules such as small peptides and antibodies have been displayed on coat proteins of phage, greatly expanding the applications of the technology. the past decade has seen considerable progress in the techniques and applications of phage libraries. in addition, different screen

3、ing methods have allowed isolation and characterization of peptides binding to several molecules in vitro, in the context of living cells, in animals and in humans.2022-2-35- in vivo use of phage libraries. initially the phage library is injected in the circulation. next, phage is allowed to circula

4、te for minutes or hours (in this case when internalized phages are to be recovered). finally, after deep anesthesia, mice are euthanized and the organs are dissected for phage recoveryand peptide sequencing.2022-2-36phage structure. piii, pvi, pvii, pviii and pxix representphage proteins. exogenous

5、peptides are expressed or “displayed” usuallyon piii or pviii.2022-2-37三三 絲狀噬菌體的生物學(xué)絲狀噬菌體的生物學(xué)形態(tài)：長桿狀，長度約形態(tài)：長桿狀，長度約1 um，管直徑約，管直徑約6nm?；蚪M：約基因組：約6400核苷酸大小的單鏈線狀核苷酸大小的單鏈線狀dna，結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：2700個主要蛋白（個主要蛋白（pviii）分子螺旋狀排列形成長管，）分子螺旋狀排列形成長管， 一頭一頭5個拷貝的次要?dú)さ鞍讉€拷貝的次要?dú)さ鞍譸iii和和pvi， 另一頭則由次要?dú)さ鞍琢硪活^則由次要?dú)さ鞍譸vii和和pix。生理：生理：f菌毛結(jié)合的序列

6、是菌毛結(jié)合的序列是piii蛋白蛋白n端的端的200個氨基酸。個氨基酸。 一個分裂周期中可生產(chǎn)幾百個子代，一個分裂周期中可生產(chǎn)幾百個子代， 其產(chǎn)量可達(dá)到其產(chǎn)量可達(dá)到0.3mg/ml。2022-2-38外源蛋白的展示部位外源蛋白的展示部位2022-2-39噬菌體展示技術(shù)所展示外源多肽和及文庫噬菌體展示技術(shù)所展示外源多肽和及文庫1. 隨機(jī)肽庫隨機(jī)肽庫l 隨機(jī)肽庫通常較短（隨機(jī)肽庫通常較短（436氨基酸氨基酸8,9長度）長度）l 編碼它們的核酸由化學(xué)法合成而得編碼它們的核酸由化學(xué)法合成而得l 其展示方式包括其展示方式包括3，33，3+3，8，88，8+8等等2. 基因文庫基因文庫l 基因組文庫如基因組

7、文庫如dna staphylococcus aurousl cdna文庫文庫l 抗體庫抗體庫l 病毒病毒cdna3. 各種自然蛋白及蛋白片段等各種自然蛋白及蛋白片段等 其中包括其中包括 - -半乳糖苷酶等蛋白片段；酶類如堿性磷酸酶，胰酶等；激素半乳糖苷酶等蛋白片段；酶類如堿性磷酸酶，胰酶等；激素類如人生長素，血管緊張激素等；酶抑制劑如牛胰蛋白酶抑制劑等；毒類如人生長素，血管緊張激素等；酶抑制劑如牛胰蛋白酶抑制劑等；毒素如蓖麻毒蛋白素如蓖麻毒蛋白b b鏈等；受體如鏈等；受體如igeige受體受體 亞單位、亞單位、t t細(xì)胞受體等；觸體如細(xì)胞受體等；觸體如p p物質(zhì)、神經(jīng)激肽物質(zhì)、神經(jīng)激肽a a和

8、和b b等；抗原及抗原表位；等；抗原及抗原表位；dnadna和和rnarna結(jié)合蛋白如鋅指蛋結(jié)合蛋白如鋅指蛋白等；酶底物如蛋白酶底物等；細(xì)胞素如白等；酶底物如蛋白酶底物等；細(xì)胞素如il3il3，il6il6等。等。2022-2-310抗體庫技術(shù)簡單流程2022-2-311 獲得抗體基因2022-2-312 插入載體2022-2-3132022-2-314 表達(dá)2022-2-315 篩選2022-2-3162022-2-317噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展簡史1985年smith 證實(shí)噬菌體fd基因組能通過基因工程的手段進(jìn)行改造1。1988年parmley 將已知抗原決定簇與噬菌體p n端融合呈現(xiàn)在其表面

9、2。1990年mccafferty 用噬菌體展示技術(shù)篩選溶菌酶的單鏈抗體成功使噬菌體展示技術(shù)進(jìn)入一個廣泛應(yīng)用的時代3。一系列噬菌體文庫的構(gòu)建噬菌體展示技術(shù)煥發(fā)出了新的生命力。2022-2-318 噬菌體定義：噬菌體定義：是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒。 噬菌體宿主菌形態(tài)核酸t(yī)1-t7、n4大腸埃希菌蝌蚪形dsdna，線狀p1志賀菌蝌蚪形dsdna，線狀p22沙門菌蝌蚪形dsdna，線狀sp01、sp82枯草芽胞桿菌蝌蚪形dsdna，線狀29解淀粉芽胞桿菌蝌蚪形dsdna，線狀pm2假單胞菌微球形，有包膜dsdna，線狀x174、s13、m12、g4大腸埃希菌微球形ssdna，線

10、狀f1、fd、m13大腸埃希菌絲形ssdna，線狀ms2、f2、fr、q大腸埃希菌微球形ssrna，線狀6假單胞菌微球形，有包膜dsrna，線狀，分成3節(jié)段噬菌體分類：噬菌體分類：2022-2-319絲狀噬菌體絲狀噬菌體蝌蚪形噬菌體蝌蚪形噬菌體噬菌體、噬菌體、t4噬菌體、噬菌體、t7噬菌體噬菌體m13噬菌體噬菌體2022-2-320t7與m13相比優(yōu)勢明顯t7selectt7select的優(yōu)勢的優(yōu)勢解釋是在細(xì)胞質(zhì)中表是在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的裂解性噬菌達(dá)的裂解性噬菌體體與m13不同，t7是裂解性的，其展示的蛋白無需分泌。c-c-端融合端融合插入序列被克隆到t7select載體基因10 的c-端，可以使

11、帶有終止密碼子的插入子得以表達(dá)和展示。載體克隆容量大載體克隆容量大t7載體比m13克隆容量大，而任何克隆到m13上大于1 kbp的片段都不穩(wěn)定。插入片段穩(wěn)定插入片段穩(wěn)定t7重組子很穩(wěn)定，而m13重組子 尤其是1 kb的很不穩(wěn)定洗提條件靈活洗提條件靈活m13穩(wěn)定性尚可，但是洗提條件頗受限制，sds、鹽、離液劑等，都能造成不穩(wěn)定。而t7在1% sds，5 m nacl，4 m尿素，2 m鹽酸胍，10 mm edta, 100 mm dtt，ph 4-10等條件下穩(wěn)定。生長迅速生長迅速( (小于小于3 3小時小時) )，噬斑大，噬斑大明顯縮短富集過程，每輪親和淘洗之間時間少，2天內(nèi)即可完成標(biāo)準(zhǔn)淘洗包

12、裝效率極高包裝效率極高(10(109 9 pfu/ug) pfu/ug)操作很簡便，只需將dna加到抽提物中，放置并鋪板。克隆效率高克隆效率高m13要用電轉(zhuǎn)化方能獲得高效克隆，而t7select制備大文庫則容易得多2022-2-321噬菌體cdna展示技術(shù)以改構(gòu)的噬菌體為載體，cdna基因片段定向插入噬菌體外殼蛋白基因區(qū)，使外源蛋白表達(dá)并展示于噬菌體表面，通過親和富集法篩選表達(dá)有特異蛋白質(zhì)的噬菌體。2022-2-322噬菌體展示系統(tǒng)的類型產(chǎn)品概況產(chǎn)品概況載體用途展示拷貝數(shù)/噬菌體展示大小(氨基酸)宿主t7select415-1多肽41540 50 aabl21t7select1-1 *蛋白或多

13、肽11200aablt5403 或 5615t7select1-2 a, b & c蛋白或多肽1900aablt5403 或5615t7select10-3b*蛋白或多肽約為10564 * (上限待定)blt5403 或56152022-2-323噬菌體cdna展示技術(shù)的應(yīng)用1 用于模擬表位的研究。2 用于dna、rna結(jié)合蛋白的研究。3 用于蛋白-蛋白相互作用的研究。4 用于非蛋白小分子與蛋白相互作用的研究。5 細(xì)胞與蛋白相互作用的研究。6 酶作用底物的分析、先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)、定位信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等。2022-2-3242022-2-325問題1. 沒有一個系統(tǒng)能夠表達(dá)所有的真核細(xì)胞蛋白

14、。2. 在外源cdna插入噬菌體載體時存在雙向插入，可能導(dǎo)致表達(dá)減少或者逆向表達(dá)。2022-2-326展望 噬菌體cdna展示技術(shù)有效地實(shí)現(xiàn)了基因型和表現(xiàn)型的轉(zhuǎn)換，在分子克隆的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)構(gòu)想的體外控制，從而可獲得具有生物學(xué)活性的表達(dá)產(chǎn)物。若將其與蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測、分子模擬技術(shù)完美融合，對分子相互作用、分子識別、受體識別、酶學(xué)機(jī)制等研究進(jìn)程將起到極大的推動作用。2022-2-327應(yīng)用舉例：部分做過的工作2022-2-328一、半合成噬菌體抗體庫的構(gòu)建 構(gòu)建一個半合成抗體庫，不經(jīng)免疫制備人源抗tie2 fab抗體。通過rt-pcr方法，從人臍帶血淋巴細(xì)胞總rna 擴(kuò)增輕鏈基因及重鏈vh

15、段基因，將輕鏈基因插入pcomb3載體中，得人輕鏈質(zhì)粒庫；從乙肝表面抗體（hbsab）的fd段基因制備含有不同長度隨機(jī)化cdr3的fr3-cdr3-j-ch1片段，然后將vh段基因與隨機(jī)化的cdr3融合，得到fd基因片段，再將其插入輕鏈質(zhì)粒庫中，得半合成人fab質(zhì)粒庫。 2022-2-329材料和方法人臍帶血淋巴細(xì)胞 ficollpaque plus購自pharmacia公司。trizol試劑購自invitrogen 公司。pcomb3噬菌體抗體表達(dá)載體：4029bp，含有可插入輕鏈和重鏈基因的克隆位點(diǎn)。大腸桿菌xll-blue 輔助病毒vcsm13 2022-2-330cdna制備引物設(shè)計(jì)電

16、轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備輔助噬菌體的制備抗體庫制備2022-2-331結(jié)果pcr擴(kuò)增人抗體基因擴(kuò)增人抗體基因 圖3.1 鏈pcr擴(kuò)增結(jié)果1-6泳道：vl1, vl2, vl3, vl4, vl5, vl6m：marker dl2,000圖3.2 鏈pcr擴(kuò)增結(jié)果11-3泳道：vk1, vk2, vk3m：marker dl2,0002022-2-332圖3.3 重鏈分段pcr擴(kuò)增結(jié)果13泳道：h135，h2，h4(約290bp)47泳道：cdr3-5, cdr3-8, cdr3-10, cdr3-12(約400bp)m：marker dl2,000 2022-2-333圖3.4 重鏈重疊pcr擴(kuò)增結(jié)果

17、13泳道： cdr3-5+(h135，h2，h4) 融合結(jié)果46泳道： cdr3-8+(h135，h2，h4) 融合結(jié)果79泳道： cdr3-10+(h135，h2，h4) 融合結(jié)果1012泳道：cdr3-12+(h135，h2，h4) 融合結(jié)果1 2 3 4 5 6 m 7 8 9 10 11 12 m 2022-2-334圖3.5輕鏈和重鏈插入pcomb3 流程hl2022-2-335人源輕鏈抗體文庫的構(gòu)建人源輕鏈抗體文庫的構(gòu)建 經(jīng)限制性內(nèi)切酶saci和xbai 雙酶切的人抗體輕鏈pcr產(chǎn)物與用相同內(nèi)切酶酶切、去磷酸化的pcomb3載體，16連接，用該連接產(chǎn)物進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，根據(jù)1l和10l菌

18、液鋪平板所長出來的菌落數(shù)，可推算出人抗體輕鏈文庫的庫容量。 鏈文庫的容量為5.03106,鏈文庫的容量為6.8106(多次建庫混合后的庫容量)。 從平板上隨機(jī)挑取10個菌落，涂格，過夜培養(yǎng)，菌落pcr鑒定。對于鏈文庫，10個克隆中有6個陽性，鏈文庫的插入率大約為60；鏈文庫10個克隆中有7個是陽性，其插入率大約為70。 2022-2-336人源噬菌體人源噬菌體fab抗體半合成文庫的構(gòu)建抗體半合成文庫的構(gòu)建 將酶切純化的重鏈重疊pcr產(chǎn)物插入經(jīng)酶切、并切膠回收純化的輕鏈抗體文庫中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，在輔助噬菌體vcsm13的超感染下，繁殖出表達(dá)人抗體fab段的噬菌體，即為抗體組合文庫。1l和10l

19、轉(zhuǎn)化菌鋪平板計(jì)數(shù)，計(jì)算出fd（包括cdr3-5到cdr3-12的全部隨機(jī)化fd片段）文庫的庫容為5.89106。隨機(jī)挑取10個菌落，涂格，過夜培養(yǎng)后菌落pcr：其中6個克隆中有輕鏈也有重鏈。雙鏈插入率為60左右。2022-2-337 以相同的程序構(gòu)建fd鏈抗體庫，庫容量為6.55106, 隨機(jī)挑取10個菌落，涂格，過夜培養(yǎng)后菌落pcr：其中有5個克隆擴(kuò)增出輕鏈和重鏈片段。雙鏈插入率為50左右。 為了提高抗體庫的庫容量，在增加細(xì)菌轉(zhuǎn)化效率的同時，進(jìn)行了多次轉(zhuǎn)化，每次轉(zhuǎn)化都計(jì)算插入率。結(jié)果如表所示。2022-2-338表3.1抗體庫的庫容與抗體片段插入率 nd ：未做2022-2-339混合抗體庫

20、的鑒定混合抗體庫的鑒定 將所構(gòu)建的各種fab抗體庫混合成為最終的人源噬菌體抗體庫，理論庫容為1.97107 實(shí)際的噬菌體抗體庫滴度為3.91014cfu/ml。隨機(jī)挑取10個菌落進(jìn)行pcr，.電泳觀察,雙鏈陽性有5個(圖3.6),單鏈（輕鏈或者重鏈）陽性有4個,空載體1個, fab陽性率為50左右。 2022-2-340圖3.6半合成抗體庫fab重組克隆的pcr鑒定 其中1，2，4，5，8五個克隆為輕重鏈雙陽性克隆m 1l 1h 2l 2h 3l 3h 4l 4h m 5l 5h 6l 6h 7l 7h 8l 8h2022-2-341討論 本研究采取構(gòu)建半合成抗體庫的方法，以胎兒臍帶血為材料，

21、將基因組的vh段與人工合成的cdr3（共4組）拼接，在體外進(jìn)行v-d- j重排，構(gòu)建fd段基因庫，再與來自胎兒臍帶血的輕鏈基因庫組合?，F(xiàn)已明確人類基因組中有約50個vh基因，分7個亞群，第6和第7個亞群僅各有一個基因。我們設(shè)計(jì)了三種vh基因 5端引物，其中可擴(kuò)增出第1,3,5亞群，h2擴(kuò)增第2亞群，h4擴(kuò)增第4亞群，第6,7亞群因基因數(shù)量少未設(shè)計(jì)專門引物，但也可分別由 h135和h4擴(kuò)增。 2022-2-342 在進(jìn)行cdr3隨機(jī)化的過程中，進(jìn)行重疊pcr時難免會有錯誤。故在完成fd鏈的融合后，對fd基因進(jìn)行了檢測，將產(chǎn)物克隆到t載體中，測定了5個克隆。發(fā)現(xiàn)有2個克隆在重疊區(qū)提前出現(xiàn)了終止密碼

22、子或者缺失d區(qū)，另外3個正常，分別屬于vh1,vh2,vh4基因家族 2022-2-343為了增加抗體基因的豐度，在試驗(yàn)過程 中提取淋巴細(xì)胞總rna，可以避免提取 mrna時容易降解和丟失目的基因。獲得的抗體基因需要多次酶切、連接、 轉(zhuǎn)化等步驟，所以在這些過程中要盡量 提高連接效率：可采取分步雙酶切，保 證切割完全，檢測連接效率。 2022-2-344 實(shí)驗(yàn)過程中，克隆的抗體基因在細(xì)菌的培養(yǎng)過程中會有丟失現(xiàn)象發(fā)生，雙鏈陽性率會由轉(zhuǎn)化時的60左右變成50左右，與前人報告的情況一致。可能原因有：帶有輕重鏈基因的克隆在細(xì)菌生長過程中發(fā)生缺失突變、帶有抗體基因的克隆生長緩慢、輔助噬菌體cp-iii蛋白

23、與fabcpiii蛋白競爭進(jìn)入噬菌體過程中部分噬菌體沒有fabcpiii蛋白包裝在表面。 2022-2-345二 從噬菌體抗體庫中篩選抗tie2抗體 以tie2為靶標(biāo)，對已經(jīng)建好的半合成噬菌體抗體庫進(jìn)行3輪的吸附、洗脫、擴(kuò)增的篩選，獲得2株能夠同tie2抗原特異性反應(yīng)的fab噬菌體抗體。2022-2-346材料與方法材料抗原抗原 tie2-fc，ang1 (購自a &b system公司) 對照抗原：對照抗原：bsa 購自sigma公司 丙型肝炎病毒ns5表面抗原(本室表達(dá)) igg1標(biāo)準(zhǔn)品（sigma公司）?？贵w抗體： hrp標(biāo)記的抗vcsm13多克隆抗體（購自sigma 公司）hr

24、p標(biāo)記的抗人標(biāo)記的抗人igg fab 抗體（購自抗體（購自sigma公司）公司） 2022-2-347方法噬菌體滴度測定噬菌體抗體庫的淘篩，制備噬菌體抗體的抗原結(jié)合活性-夾心elisa試驗(yàn)噬菌體抗體的特異性鑒定交叉反應(yīng)性競爭抑制試驗(yàn)序列測定2022-2-348結(jié)果4.1半合成抗體庫的篩選：半合成抗體庫的篩選： 將tie2抗原過夜包被在酶連板中，對所得總庫進(jìn)行了三輪淘篩每輪洗脫噬菌體鋪平板計(jì)數(shù)，分別是：2.8104 ， 2.9105， 2.6106 。經(jīng)過三輪的吸附、洗脫、擴(kuò)增的篩選，tie2抗原對噬菌體抗體進(jìn)行了特異性富集。從表4.1可以看出在三輪淘洗的過程中，噬菌體確實(shí)出現(xiàn)了特異性的富集，第

25、三輪淘洗比第一輪的產(chǎn)率高出近40倍。 2022-2-349表4.1 噬菌體抗體庫的富集 2022-2-3504.2 噬菌體抗體的鑒定噬菌體抗體的鑒定 4.2.1噬菌體抗體的抗原結(jié)合活性噬菌體抗體的抗原結(jié)合活性elisa實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 第三輪淘篩后，隨機(jī)挑取60個克隆，制備單克隆噬菌體抗體，用間接elisa法檢測對tie2抗原的結(jié)合活性。a490值超過0.8的有10個（見表4.2）。4.2.2 噬菌體抗體的交叉反應(yīng)性鑒定噬菌體抗體的交叉反應(yīng)性鑒定 和其他抗原的交叉反應(yīng)性：將噬菌體抗體滴度較高的10個克隆同其他三種不同的抗原（hcv ns5蛋白，bsa，人igg，）進(jìn)行elisa交叉反應(yīng)，排除交叉反應(yīng)抗

26、體，剩余的抗體是特異性針對tie2 抗原的（表4.2）。2022-2-351表4.2 篩選所得克隆與tie2的結(jié)合活性 及和其他抗原的交叉反應(yīng)性2022-2-3524.2.3競爭抑制試驗(yàn)結(jié)果：競爭抑制試驗(yàn)結(jié)果： 為進(jìn)一步驗(yàn)證所得噬菌體抗體對體tie2抗原的特異性，用ang1與陽性噬菌體抗體克隆做競爭抑制試驗(yàn)，結(jié)果表明：ang1對部分噬菌體抗體的tie2結(jié)合活性具有抑制作用。如表4.3所示 2022-2-353表4.3競爭抑制試驗(yàn)結(jié)果 2022-2-3544.2.4所得克隆的酶切與測序：所得克隆的酶切與測序： 選取交叉反應(yīng)小，有競爭抑制活性的克隆進(jìn)行酶切鑒定(ecorixhoi酶切如圖4.1所示

27、)，片段大小為1.6kb和3.7kb 大小正確。同時送部分菌株測序。 2022-2-355圖 4.1 pcomb3-fab酶切結(jié)果 3 . 7 k b 1 . 6 k b 2000s12 12 s2 s4 m1 m2s12,12,s2,s4 fab陽性克隆m1 /ecot14m2 dl20002022-2-356序列分析 克隆s12測序結(jié)果與抗體胚系基因數(shù)據(jù)庫（v-base）比較，重鏈屬于vh4基因家族，與胚系基因dp-66同源性最高；d、j分別是d7-27和jh3a；輕鏈屬于v1家族，來自胚系基因dp3，j段屬于j2（如圖4.2）。在重鏈的cdr3區(qū)，符合最初的（nnk）8的隨機(jī)化設(shè)計(jì)，在c

28、dr3前面共有人工加入的8個氨基酸，后面3個氨基酸是基本固定的。12號克隆重鏈屬于vh1家族，與dp-23同源性最高，d、j分別是dp-26和jh4d，cdr3區(qū)，符合最初的（nnk）12隨機(jī)化設(shè)計(jì)；輕鏈屬于vl2家族，來自胚系基因dpl11，j段屬于jl2/jl3a 。 在測序的克隆中，有兩個克隆測序發(fā)現(xiàn)d基因缺失。 2022-2-357圖4.2 s12號克隆輕鏈重鏈可變區(qū)dna及氨基酸序列 2022-2-358討論 噬菌體抗體庫展示技術(shù)的發(fā)展為不經(jīng)免疫直接制備抗體成為可能；利用半合成抗體庫直接獲得人源抗體，是噬菌體展示技術(shù)中的主要方法之一。我們在本研究中從半合成抗體庫中成功篩選出抗tie2人源抗體fab抗體，說明這一方法是可行的。但所得的tie2抗體是否能在體內(nèi)抑制ang1配體的結(jié)合，還需進(jìn)一步的試驗(yàn)。半合成抗體庫的庫容是一個重要參數(shù)，用組合感染法可以達(dá)到1010，常規(guī)的電穿孔法很難達(dá)到。我們的庫容通過多次建庫為1.97107。在所建庫中篩到的有些克隆vh基因不全，這和王琰的結(jié)論有相似的地方，在cdr3隨機(jī)化的過程中，由