實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案--馬鈴薯脫毒試管苗的快速繁殖和試管薯的誘導(dǎo)

1、一.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案實(shí)驗(yàn)序號(hào)一實(shí)驗(yàn)名稱馬鈴薯脫毒試管苗的快速繁殖和試管薯的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)時(shí)間2012-4-10至2012-6-15實(shí)驗(yàn)室生科院3241實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 熟練準(zhǔn)確配制MS培養(yǎng)基母液和組培室常用的化學(xué)試劑，鞏固相關(guān)理論基礎(chǔ)知識(shí)。2 掌握無(wú)菌操作的基本技術(shù)；了解馬鈴薯脫毒種薯生產(chǎn)的過(guò)程，為脫毒種薯的生產(chǎn)提供必要的基礎(chǔ)苗。3 進(jìn)一步熟悉配制培養(yǎng)基的步驟，能熟練準(zhǔn)確配制培養(yǎng)基；掌握馬鈴薯試管薯形成的條件，設(shè)計(jì)適合的馬鈴薯試管薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基。4 通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，掌握馬鈴薯試管薯誘導(dǎo)的方法和技術(shù)。2 實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)流程或裝置示意圖實(shí)驗(yàn)1-1 MS培養(yǎng)基母液和常用試劑的配制培養(yǎng)基是植物離體培養(yǎng)組織和細(xì)胞賴以生存的

2、營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。配制培養(yǎng)基時(shí)，為了減少試劑稱取時(shí)的工作量和少量稱取時(shí)出現(xiàn)的誤差，以及避免多種營(yíng)養(yǎng)成分混合導(dǎo)致沉淀產(chǎn)生或相互反應(yīng)而失去培養(yǎng)效果，預(yù)先要將各種營(yíng)養(yǎng)成分配制為一定倍數(shù)的培養(yǎng)基母液，待使用時(shí)稀釋到要求的濃度。母液的濃度為培養(yǎng)基濃度的10倍、100倍或更高。 實(shí)驗(yàn)1-2 馬鈴薯試管苗快速繁殖培養(yǎng)基的配制將事先配制好的培養(yǎng)基母液按一定比例稀釋至濃度為培養(yǎng)基中規(guī)定的使用濃度，再加入瓊脂、蔗糖、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)等，制備成符合要求的培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)1-3 馬鈴薯試管苗的快速繁殖利用適宜的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)帶有腋芽的馬鈴薯單節(jié)莖段進(jìn)行芽生長(zhǎng)和根再生形成單苗，從而達(dá)到快速繁殖的目的。 實(shí)驗(yàn)1-4 馬鈴薯試管薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基

3、的配制將事先配制好的培養(yǎng)基母液按一定比例稀釋至濃度為培養(yǎng)基中規(guī)定的使用濃度，再加入瓊脂、蔗糖、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)等，制備成符合要求的培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)1-5 馬鈴薯試管薯的誘導(dǎo)在培養(yǎng)馬鈴薯脫毒試管苗的培養(yǎng)容器中（試管苗培養(yǎng)4-6周），加入液體的馬鈴薯試管薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基，置于全黑暗條件下即可誘導(dǎo)馬鈴薯試管苗結(jié)薯。3實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料設(shè)備冰箱、50ml三角瓶、500ml搪瓷杯、25ml量筒、1ml和5ml吸管、pH試紙（5.47.0）、封口膜、橡皮筋、扎口用棉線、藥勺、稱量紙、普通電子天平、移液管、量筒、燒杯、酒精棉球、小塊紗布、已滅菌濾紙、槍狀鑷子、手術(shù)剪、解剖刀、已滅菌培養(yǎng)皿、酒精燈、高壓蒸汽滅菌鍋、電磁爐、超

4、凈工作臺(tái)等。藥品及試劑 MS基本培養(yǎng)基母液、馬鈴薯快速繁殖培養(yǎng)基、蒸餾水、75酒精、蔗糖、瓊脂、NAA、6-BA、水解酪蛋白、1mol/LHCl、1mol/LNaOH、。實(shí)驗(yàn)材料: 馬鈴薯脫毒苗 4實(shí)驗(yàn)方法步驟及注意事項(xiàng)方法步驟:1-1 MS培養(yǎng)基母液和常用試劑的配制在配制MS培養(yǎng)基母液時(shí)，為減少工作量可以把幾種藥品（如培養(yǎng)基中的大量元素或微量元素）配在同一母液中，但應(yīng)注意各種化合物的組合以及加入的先后順序，以免發(fā)生沉淀。MS培養(yǎng)基母液包括大量元素母液、微量元素母液、鐵鹽母液、有機(jī)物母液。 可按照以下步驟配制為：確定母液的濃度和體積計(jì)算各種化合物用量稱量分別溶解混合定容裝瓶貼標(biāo)簽放入冰箱保存4

5、.1大量元素母液的配制MS培養(yǎng)基中的9種大量元素除C、H、O外可由KNO3、NH4NO3、CaCl2 2H20、MgSO4 7H2O、KH2PO4幾種無(wú)機(jī)鹽來(lái)供應(yīng)，它們可配在同一母液中母液種類 成 分規(guī)定用量/mg L-1 擴(kuò)大倍數(shù) 稱取量/mg 母液定容體積/ml 配1L MS培養(yǎng)基吸取量/ml 大量元素 KNO3190020 380001000 50 NH4NO3165033000CaCl2 2H204408800MgSO4 7H2O3707400KH2PO4 170 3400 4.2微量元素母液的配制 MS培養(yǎng)基中的微量元素可由MnSO4 4H2O、ZnSO4 7H2O、H3BO3、KI

6、、Na2MoO4 2H2O、CuSO4 5H2O、CoCl2 6H2O幾種無(wú)機(jī)鹽來(lái)供應(yīng)，它們也可配在同一母液中（具體配制見(jiàn)下表）。母液種類 成 分 規(guī)定用量/mg L-1 擴(kuò)大倍數(shù) 稱取量/mg 母液定容體積/ml 配1L 培養(yǎng)基吸取量/ml 微量元素 MnSO4 H2O16.9200338010005ZnSO4 7H2O8.61720H3BO36.21240KI0.83166Na2MoO4 2H2O0.2550CuSO4 5H2O0.0255CoCl2 6H2O 0.0255 4.3分母液的配制MS培養(yǎng)基中所需的維生素和氨基酸等有機(jī)成分母液應(yīng)分別單獨(dú)配制（具體配制見(jiàn)下表）母液種類 成 分規(guī)定

7、用量/mg L-1 擴(kuò)大倍數(shù) 稱取量/mg 母液定容體積/ml 配1L MS吸取量/ml 有機(jī)成分 甘氨酸2.02001002505鹽酸硫胺素0.15鹽酸吡哆素0.525煙酸0.525肌醇10050004.4鐵鹽母液的配制確定母液的濃度和體積計(jì)算各種化合物用量稱量分別溶解混合煮沸數(shù)分鐘調(diào)節(jié)pH值至5.8 定容裝瓶（棕色）貼標(biāo)簽放入冰箱保存。用時(shí)每配l L培養(yǎng)基取該溶液5ml。母液種類 成 分 規(guī)定用量/mg L-1 擴(kuò)大倍數(shù) 稱取量/mg 母液定容體積/ml 配1L MS吸取量/ml 鐵鹽 Na2EDTA 2H2O37.320018652505FeSO4 7H2O27.813904.5生長(zhǎng)調(diào)節(jié)

8、物質(zhì)母液的配制對(duì)于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，配制成母液時(shí)，通常用mgml-1或 ppm 較為方便，一般配制成0.1-1mgml-1的母液，這樣的濃度便于計(jì)算也可避免冷藏時(shí)形成結(jié)晶。2,4-D/NAA用少量95酒精溶解，再加水定容；6-BA應(yīng)先溶于少量1 molL-1的HCl中，再加水定容。 母液種類 成 分 稱取量(mg )母液定容體積(ml )母液濃度(mg/ml)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)2,4-D/NAA501000.56-芐氨基嘌呤100.14.6用試劑的配制鹽酸（lmolL-1 ）：用濃度36.5%、密度1.19g/cm3的濃鹽酸配制氫氧化鈉（lmolL-1 ）：用固體氫氧化鈉配制75%酒精(v/v) ：

9、用95%的酒精來(lái)配制稀鉻酸洗滌液：重鉻酸鉀50 g溶于1000 ml蒸餾水中，冷卻后緩慢加入工業(yè)用硫酸90 ml。1-2 馬鈴薯試管苗快速繁殖培養(yǎng)基的配制 配方： MS基本培養(yǎng)基0.7瓊脂3蔗糖 配制體積：每小組配制0.5L（）根據(jù)需要配制的培養(yǎng)基的量稱好所需的瓊脂（0.0.），撕碎后放入醫(yī)用口杯中，加入適量的蒸餾水（估計(jì)加入母液后不超過(guò)配制總量）置于電磁爐上加熱溶解，邊加熱邊用玻棒攪動(dòng)。 （）待瓊脂完全溶解后，加入規(guī)定用量的母液（可事先取好放于一燒杯中），再加入規(guī)定用量的蔗糖，繼續(xù)加溫并不斷攪拌，待瓊脂煮透后端離火源，根據(jù)培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)基體積加入所需要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，最后加蒸餾水至所需體積

10、。（）調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的酸堿性至pH5.8:培養(yǎng)基若偏酸時(shí)用lmolL-1 NaOH來(lái)調(diào)節(jié)，偏堿則可用lmolL-1 HCl來(lái)調(diào)節(jié)。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)pH值高于6.0時(shí)，培養(yǎng)基將會(huì)變硬；pH值低于5.0時(shí)，瓊脂不能很好地凝固。 （）培養(yǎng)基的分裝:占其容積的1/41/3為宜，果醬瓶每瓶2030ml，太多既浪費(fèi)培養(yǎng)基，又減少了培養(yǎng)材料的生長(zhǎng)空間；太少又會(huì)因營(yíng)養(yǎng)不良影響生長(zhǎng)。培養(yǎng)基分裝完后，用封口膜封嚴(yán)瓶口，并用橡皮筋扎緊。 （）培養(yǎng)基的滅菌:溫度121時(shí)保持1530 min左右即可。(6)接種工具準(zhǔn)備:分別取槍狀鑷子2把、眼科手術(shù)剪和手術(shù)刀各1把，用牛皮紙和橡皮圈包扎成一套；每套培養(yǎng)皿內(nèi)放入合適濾紙23張，用

11、牛皮紙和橡皮圈包扎成一套；然后和培養(yǎng)基一起統(tǒng)一滅菌。1-3 馬鈴薯試管苗的快速繁殖 （1）準(zhǔn)備工作:接種室的清潔和消毒超凈工作臺(tái)的開(kāi)機(jī)和消毒剪刀、鑷子、已滅菌培養(yǎng)皿、酒精棉球、酒精燈、待用培養(yǎng)基等的準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備 （2）無(wú)菌操作 實(shí)驗(yàn)操作前，操作人員洗手及手和小臂消毒（注意問(wèn)題？） 使用的鑷子、解剖刀等用95酒精浸泡，之后放在酒精燈上灼燒滅菌，再放在滅菌后的培養(yǎng)皿中冷卻后使用。培養(yǎng)瓶外壁的消毒將馬鈴薯試管苗剪為單節(jié)莖段后接種到培養(yǎng)基中，在植入材料的前后，培養(yǎng)瓶的瓶口須在酒精燈火焰上燒烤滅菌。封口、標(biāo)記、將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)架上，在溫度20-25，光照強(qiáng)度2000-3000lx，光照時(shí)間12-

12、14小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)。1-4 馬鈴薯試管薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制 配方： MS基本培養(yǎng)基3mg/L6-BA8蔗糖 配制體積：每小組配制0.5L，用100ml三角瓶分裝成10瓶。（1）藥品及用具的準(zhǔn)備（2）培養(yǎng)基配制（3）調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的酸堿性至pH5.8（4）培養(yǎng)基的分裝（5）培養(yǎng)基的滅菌1-5 馬鈴薯試管薯的誘導(dǎo)（1）準(zhǔn)備工作a 接種室的清潔和消毒；b 超凈工作臺(tái)的開(kāi)機(jī)和消毒；c 剪刀、鑷子、培養(yǎng)皿、待用培養(yǎng)基等的準(zhǔn)備；d 實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備（2）馬鈴薯試管薯的誘導(dǎo)方法固體培養(yǎng)法、液體培養(yǎng)法、固液雙層培養(yǎng)法，本次采用固體、液雙層培養(yǎng)法。（3）無(wú)菌操作在無(wú)菌條件下將液體的馬鈴薯試管薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基加入到用固

13、體培養(yǎng)基培養(yǎng)馬鈴薯試管苗的容器中，置于黑暗條件下誘導(dǎo)馬鈴薯試管苗結(jié)薯。注意事項(xiàng):在配制MS培養(yǎng)基母液時(shí)，但應(yīng)注意各種化合物的組合以及加入的先后順序，以免發(fā)生沉淀。力求Ca2+與SO42- 和PO43-錯(cuò)開(kāi)，以免形成硫酸鈣或磷酸鈣的不溶物。同時(shí)，要慢慢地混合，邊混合邊攪拌。配制好的各種母液應(yīng)分別貼上標(biāo)簽，寫(xiě)明母液名稱、配制倍數(shù)、配制者、配制日期。最好在24的冰箱中保存,發(fā)現(xiàn)有霉菌和沉淀結(jié)晶產(chǎn)生，就不能再使用培養(yǎng)基滅菌時(shí)注意: 1滅菌前檢查鍋內(nèi)是否有足夠的水； 2裝鍋不可過(guò)滿； 3培養(yǎng)基消毒滅菌時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，也不可超過(guò)滅菌鍋規(guī)定的壓力范圍；否則，培養(yǎng)基中的蔗糖、有機(jī)物質(zhì)，特別是維生素類物質(zhì)就會(huì)分解

14、，導(dǎo)致培養(yǎng)基變質(zhì)、變色，甚至難以凝固。 4當(dāng)滅菌完成后，應(yīng)切斷電源或熱源，待滅菌鍋內(nèi)氣壓接近“0”時(shí)，方可打開(kāi)放氣閥，擰開(kāi)滅菌鍋蓋取出培養(yǎng)基。切勿為急于取出培養(yǎng)基而打開(kāi)放氣閥放氣，否則鍋內(nèi)氣壓下降太快會(huì)引起減壓沸騰，導(dǎo)致滅菌鍋內(nèi)各容器中的培養(yǎng)基溢出，造成浪費(fèi)或污染，甚至燙傷工作人員。 5實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象： 誘導(dǎo)共得到馬鈴薯微型薯3瓶，兩瓶均無(wú)污染。三瓶中的微型薯長(zhǎng)勢(shì)不錯(cuò)，但馬鈴薯苗出現(xiàn)輕微的倒伏現(xiàn)象。第一瓶共有6株苗，第二瓶共有4株苗，第三共有5株苗，其中第一瓶中有6個(gè)微型薯（未拍攝），第二瓶中有微型薯4個(gè)（未拍攝），第三瓶中有微型薯4個(gè)（未拍攝）。第一瓶中微型薯直徑超過(guò)0.5厘米的有5個(gè)

15、，第二瓶中微型薯直徑超過(guò)0.5厘米的有3個(gè)。微型薯呈現(xiàn)淡黃色，其中直徑較大的顏色偏白，直徑較小的顏色偏黃。實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象分析： 兩瓶中幾乎所有的試管苗都產(chǎn)生了微型薯，產(chǎn)生的微型薯數(shù)量也較多，但直徑超過(guò)0.5厘米的微型薯不多，究其原因可能是培養(yǎng)時(shí)間不夠長(zhǎng)。另外，大部分馬鈴薯苗的葉子發(fā)黃，可能是長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)后，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分缺乏，也會(huì)造成微型薯營(yíng)養(yǎng)不良。6、參考文獻(xiàn)：1李浚明,朱登云編譯.植物組織培養(yǎng)教程（第3版）.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,20052曹孜義,劉國(guó)民主編.實(shí)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程.蘭州：甘肅科學(xué)技術(shù)出版社,20013張獻(xiàn)龍,唐克軒主編.植物生物技術(shù).北京：科學(xué)出版社,2004實(shí)驗(yàn)總結(jié)：本次試驗(yàn)經(jīng)歷了較長(zhǎng)時(shí)間，首先是單節(jié)莖段繁殖，在此操作過(guò)程中，將單節(jié)莖段的馬鈴薯苗植入單節(jié)莖段繁殖培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶后，要將瓶口對(duì)著火焰滅菌，在操作時(shí)一定要注意防止馬鈴薯苗被火焰烤死。在操作時(shí)，我將瓶口小心翼翼地對(duì)著火