總RNA的提取測(cè)定及逆轉(zhuǎn)錄

1、總RNA的提取及測(cè)定（Trizol法）（1）組織勻漿 取出高溫高壓消毒后研缽， 切取 50-100mg 冰凍組織置于研缽內(nèi)， 倒入液 氮，研至粉末狀。 每 50-I00mg 勻漿組織標(biāo)本加入 lml 的 Trizol 繼續(xù)研磨。（標(biāo)本的量不能超 過Trizol體積的10%,否則會(huì)出現(xiàn)DNA污染。） 將以上勻漿標(biāo)本轉(zhuǎn)移到1.5ml的EP管中，在15-30E放置5分鐘，以徹 底分離核蛋白復(fù)合體。 （或 -70°C 過夜后再進(jìn)行）（2）相分離加入0.2ml的氯仿，加蓋好后用手劇烈搖蕩巧秒，在 15-30E放置2-3分 鐘，然后4C離心12000g, 15分鐘。離心后分成3層，下面的紅色為酚

2、-氯仿 相, 一個(gè)中間層（DNA和蛋白質(zhì)），上層是無色的水相。RNA只存在于水相中。 水相占總Trizol的60%。RNA沉淀將上層水相轉(zhuǎn)移到另一干凈的1.5mlEP管中，加入0.5ml異丙醇，輕柔上 下顛倒混勻，15C-30C靜置10分鐘，然后4C, 12000g離心10分鐘。在管 的側(cè)壁和底部可看到絮狀膠樣沉淀，這就是 RNA沉淀。RNA洗滌棄上清，加入1ml 75%乙醇洗滌RNA沉淀，輕彈管壁使RNA沉淀漂浮，4C, 7500g 離心 5 分鐘。（5）RNA再溶解去上清，置真空或空氣中5-10分鐘，干燥RNA沉淀，（不能在真空中離心 干燥。注意不能將RNA沉淀完全干燥，這樣會(huì)極大地降低它

3、的溶解度。）根據(jù) RNA的量，用DEPC*（ 20-60卩l(xiāng)）重懸RNA沉淀，用槍頭反復(fù)吹打幾次，靜 置 10分鐘。測(cè)定RNA濃度：2卩l(xiāng) DEPC水 2次調(diào)零。2卩l(xiāng)樣品測(cè)其RNA濃度。A260/A280的值在1.8-2.0 范圍視為純度很高。（RNA于-70° C保存）逆轉(zhuǎn)錄(RT)取2卩g總RNA加入1卩l(xiāng)隨機(jī)引物，用DEPC水補(bǔ)充體積為15卩I70° C反應(yīng)5分鐘，置于冰上。加入以下反應(yīng)體系：5XM-MLV逆轉(zhuǎn)錄緩沖液5ulM-MLV(200U/ ul)1ul4xdNTP(10mol/L)l.25ulRNas in (40U/ ul)0.6ulDEPC水2.25ul

4、總反應(yīng)體積25ul 置于PCR擴(kuò)增儀中25T 10分鐘，37C60分鐘，95C 5分鐘終止反應(yīng)。逆轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物加80ul滅菌ddH20混勻并分裝，于-20C保存。PCR及瓊脂糖凝膠電泳PCR反應(yīng)體系：TakaRaExTaqDN 聚合酶0.25 ul0.25 ul10XReaetion Buffer5 ul5 ul4XdNTP4 ul4 ulPrimer11 ul0.6 ulPrimer21 ul0.6 ul待測(cè)cDNA1 ul1 ul火菌ddH2O37.75 ul38.85 ul總體積50 ul50 ul2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定產(chǎn)物是否為特異目的片段：稱取瓊脂糖0.6g放入200ml三角燒瓶中，加

5、入30ml 1xTBE溶液，加熱令其 完全溶解，待冷卻至約60°C時(shí)加入2ul溴化乙錠溶液(10mg/ml)，澆板，水平放 置，避光待凝。將已制備的2%瓊脂糖凝膠放入電泳槽，加入 1xTBE至高出凝膠表面1mm。10 u1 PCR產(chǎn)物分別和 2 ul 6x加樣緩沖液混勻后上樣電泳，另取6ul DNALadderMaker作為DNA片段大小的對(duì)照。80V-120V電壓下電泳20-30分鐘。所需試劑（1）RNA（2）（3）（4）1（ 5）RNA提取試劑 TRIZOL Invitrogen 公司焦碳酸二乙酯（DEPC： Sigma公司（進(jìn)口分裝） 氯仿異丙醇75%乙醇：無水乙醇加DEP（水配制（6）核糖核酸酶抑制劑（RNAsin）：華美生物工程公司（7）隨機(jī)引物：上海生工生物工程公司（8）dNTP：北京天為時(shí)代公司（9）M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶：Promega公司（10）M-MLV逆轉(zhuǎn)錄緩沖液（11）DEPC水（12）TakaRaExTaq DNA聚合酶：寶生物工程有限公司（13）目的基因引物：上海生工生物工程公司（14）（15）T< （17）（18）10*Reaction BufferdNTP：北京天為時(shí)代公司滅菌ddHO 瓊脂糖：上海鼎國生物工程公司（