超高效液相色譜法測(cè)定雞組織中二硝托胺及其代謝產(chǎn)物殘留量

1、超高效液相色譜法測(cè)定雞組織中二硝托胺及其代謝產(chǎn)物殘留量吳銀良 皇甫偉國(guó) 楊 挺 (寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 寧波 315040)摘 要：建立了超高效液相色譜同時(shí)測(cè)定雞組織二硝托胺及代謝產(chǎn)物(3-Amino-5-nitro-o-toluamide, ANOT)的方法。樣品用酸性磷酸鹽緩沖液提取兩次,離心后合并提取液,并調(diào)至pH7.0,過(guò) HLB 固相萃取小柱,用 0.1% 甲酸溶液-乙腈(8020,V/V) 洗脫,洗脫液過(guò)濾膜后進(jìn)行超高效液相色譜分析,二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè),外標(biāo)法定量。二硝托胺和ANOT的檢出限分別為25和55ug/kg。在添加濃度15009000ug/kg范圍內(nèi),二硝托胺和ANO

2、T的平均添加回收率為79.2%88.1%,批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在 2.7%5.2%之間,批間RSD在4.1%6.9%之間。峰面積與樣品濃度在202000ug/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,二硝托胺和 ANOT 的線性回歸系數(shù)均大于0.9998。 關(guān)鍵詞 雞組織;超高效液相色譜法;二硝托胺;代謝產(chǎn)物1 引言二硝托胺(Dinitolmide)是1960年由法國(guó)Dow公司開發(fā)的硝苯酰胺類抗球蟲藥1。我國(guó)于1989年批準(zhǔn)生產(chǎn)使用,二硝托胺因其毒性小,防治球蟲效果好而得到普遍應(yīng)用,但長(zhǎng)期高濃度使用會(huì)造成藥物殘留,對(duì)人體健康造成潛在危害。我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告中明確規(guī)定二硝托胺的最大殘留限量以親體和代

3、謝產(chǎn)物(3-Amino-5-nitro-o-toluamide,ANOT)總量計(jì),雞肉和雞肝中分別為3000和6000ug/kg2。目前尚缺乏相應(yīng)的殘留分析物標(biāo)準(zhǔn)方法,因此有必要開展同時(shí)測(cè)定雞組織中二硝托胺和ANOT殘留量的分析方法研究。對(duì)于飼料和動(dòng)物組織二硝托胺和ANOT的殘留量分析的方法主要為薄層色譜法3和高效液相色譜法4-7,但多數(shù)方法分析對(duì)象僅為親體或僅為代謝產(chǎn)物。陳慧華等采用HPLC-MS方法檢測(cè)了動(dòng)物組織中22種同化激素8。但是動(dòng)物組織中二硝托胺的分析方法僅見SN/T 2453-20109,分析對(duì)象僅為二硝托胺,未見有其代謝產(chǎn)物ANOT的分析方法報(bào)道。本研究根據(jù)二硝托胺和ANOT的

4、化學(xué)性質(zhì),建立了緩沖溶液提取-固相萃取凈化相結(jié)合的前處理步驟,采用超高效液相色譜分析,方法具有高靈敏度、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的特點(diǎn)。2 實(shí)驗(yàn)部分 2.1 儀器與試劑 Waters 超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司),配二極管陣列檢測(cè)器;Acquity BHE C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 um);固相萃取儀(美國(guó)Supelco 公司);HLB小柱(3 mL,60 mg,Waters 公司);Sigma離心機(jī);Ultra-Tyrrax T25 型勻質(zhì)器(德國(guó))。 二硝托胺和ANOT標(biāo)準(zhǔn)品(Dr.Ehrenstorfer 公司)；甲醇和乙腈(色譜純,Merck 公司)；甲

5、酸(色譜純, Tedia公司)；KH2PO4 和 K2HPO4·3HO2 (分析純,上海化學(xué)試劑公司)；磷酸鹽緩沖液(pH6.0和4.0)。2.2 色譜分離條件 流動(dòng)相:A為0.1%甲酸,B為乙腈。梯度洗脫:0-1.0 min, 80% A；1.0-4.0 min，80% -30% A;4.0-5.0min, 30% A；5.0-5.1 min,30% -80% A；5.1-7.0 min, 80% A。流速0.2 mL/min,進(jìn)樣量10uL,檢測(cè)波長(zhǎng)317nm；柱溫30。 2.3 樣品處理 準(zhǔn)確稱取2 g試料于50mL離心管中,在雞肉和雞肝中分別加入pH 7.0和pH 4.0的磷

6、酸鹽緩沖液10mL,以 10000 r/min 速度勻質(zhì) 1 min,再以 8000 r/min 離心 5 min,收集上清液;在殘?jiān)性偌尤?0 mL磷酸鹽緩沖液,同樣步驟操作后合并上清液；取4 mL 上清液調(diào)至pH 7.0,再以 8000 r/min 離心5 min，上清液加入到已經(jīng)被 3 mL 甲醇和 3 mL 水活化的 HLB 小柱中,待凈化液液面到達(dá)柱吸附層表面時(shí)加入3 mL 水淋洗,抽干柱子,用4 mL0.1%甲酸-乙腈 (8020,V/V)洗脫,收集洗脫液,過(guò) 0.22 um濾膜,供LC分析。2.4 線性實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取二硝托胺和 ANOT 標(biāo)準(zhǔn)品各 10.0mg 于 100mL

7、容量瓶中,用乙腈定容,得 100 mg/L 的標(biāo) 準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 10 mL 于 100 mL 容量瓶中,用乙腈定容,得 10 mg/L 混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液。用0.1%甲酸-乙腈 (8020,V/V)稀釋,配制20, 100, 200, 500, 1000和2000 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,進(jìn)行LC分析,每個(gè)濃度進(jìn)樣3次,以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2.5 添加回收率實(shí)驗(yàn) 添加回收率實(shí)驗(yàn)樣品處理同 2.3 節(jié),雞肉添加濃度為1500,3000和4500mg/kg;雞肝添加3000,6000和9000 mg/kg。 3 結(jié)果與討論 3.1 色譜條件的

8、建立 在210-800 nm范圍內(nèi)對(duì)二硝托胺和 ANOT 的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描(圖 1),二硝托胺存在兩個(gè)最大吸收峰,分別在216.0和300.8 nm;而ANOT至少存在兩個(gè)最大吸收峰,分別為 317.4和526.9 nm。考慮到 ANOT 的靈敏度低于二硝托胺,為盡量提高 ANOT 的靈敏度,避免干擾峰,本實(shí)驗(yàn)選擇 317 nm 進(jìn)行分析。 采用梯度洗脫對(duì)二硝托胺和ANOT進(jìn)行同時(shí)分析時(shí),初始流動(dòng)相中有機(jī)相比例大于25%時(shí),ANOT 和二硝托胺出峰太快,易受雜質(zhì)干擾；而有機(jī)相比例低于15% 時(shí),ANOT由于出峰較遲而易受雜質(zhì)干擾。本實(shí)驗(yàn)將初始流動(dòng)相中水相和有機(jī)相的比例定為8:2。從圖 2 可

9、知,二硝托胺和ANOT的峰形均較好,在空白組織中未見干擾。3.2 提取和凈化條件的選擇 二硝托胺和ANOT極性較強(qiáng),且易溶于酸性溶液,本實(shí)驗(yàn)采用磷酸鹽緩沖液 pH(4,5,6和7)提取雞肌肉和雞肝樣品(圖3)。當(dāng) pH=6.0時(shí),肌肉樣品中二硝托胺和ANOT的提取回收率均高于90%；而對(duì)于肝臟樣品,pH=4.0-7.0時(shí),提取效果越來(lái)越差,僅pH 4.0時(shí),二硝托胺和ANOT的提取回收率高于90%。因此,提取樣品時(shí),肌肉和肝臟樣品分別采用 pH 6.0和pH 4.0 的磷酸鹽緩沖液。而對(duì)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),雞肉提取液直接進(jìn)行固相萃取凈化時(shí),ANOT 的回收率僅約40%。且HLB小柱換成 Bond Elu

10、t C18小柱后,回收率無(wú)明顯改善。而雞肉提取液調(diào)至 pH 7.0 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),過(guò)HLB小柱,回收率大于90%；過(guò) Bond Elut C18柱,回收率無(wú)明顯改善。本實(shí)驗(yàn)采用HLB小柱進(jìn)行凈化。3.3 線性實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,對(duì)二硝托胺和 ANOT 在 20-2000 ug/L 濃度范圍內(nèi),以峰面積對(duì)濃度(mg/L)作圖,所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為y=206.6x-1049.7(ANOT)和y=211.5x-1787.8(二硝托胺),相關(guān)系數(shù)(r)均高于0.9998,說(shuō)明本方法適用于二硝托胺和ANOT的定量分析。 3.4 方法的檢出限、回收率和精密度 采用在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法,對(duì)雞肉和雞

11、肝樣品進(jìn)行了了 3 次添加回收實(shí)驗(yàn),每個(gè)濃度點(diǎn)重復(fù)進(jìn)行6次,結(jié)果見表1。雞肉和雞肝中各濃度點(diǎn)二硝托胺和 ANOT 的平均添加回收率均在79.2% -88.1%之間。批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均在2.7%-5.2%之間,批間RSD均在4.1%-6.9%之間,方法具有較好的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。同時(shí)按信噪比S/N=31計(jì)算得兩種組織中的檢出限為55.0 ug/kg (ANOT)和25.0 ug/kg(二硝托胺)。參考文獻(xiàn)：1.TIAN Ying,LIU Zai-Sheng(田穎,劉再勝).Liaoning Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medici

12、ne (遼寧畜牧獸醫(yī)),1996,6:2122 2.The Ministry of Agriculture Bulletin of PRC235(農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告),2002 3.WebsterGK,PastoreRJ,HawkinsK A,HorschAL.J.Agric.FoodChem.,1998,46:36233629 4.Morawski J, Kyle G.J.AOAC Int.,1984,67(5):861862 5.Parks O W,Doerr R C.J.AOAC Int.,1986,69(1):7071 6.Burns I W,Jones A D.Analyst,198

13、0,105(1250):509512 7.SHAO Yao-Dong,LIN Dong(邵耀東,林 冬).Progress in Veterinary Medicine(動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展),2009,30(5): 5557 8.農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-5-2006,Determination of Dinitolmide in Feeds High Performance Liquid Chromatography (飼料中二硝托胺的測(cè)定 高效液相色譜法).National Standard of the Peoples Republic of China(中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn))9.SN/T2453-2010,Determination of Zoalene Residu