人肺癌裸小鼠模型活體成像的動態(tài)觀察資料

1、人肺癌裸小鼠模型活體成像的動態(tài)觀察閆明霞 1，吳海燕 2，朱淼鑫 1，劉蕾 1，莢德水 1，孔韓衛(wèi) 1，姚明 1(1. 上海市腫瘤研究所實(shí)驗(yàn)病理研究室，上海200032 ；2. 揚(yáng)州大學(xué)，揚(yáng)州 225009 ) 摘要 目的 ：建立穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的人肺癌細(xì)胞系， 并探討小動物活體 熒光成像系統(tǒng)在皮下移植瘤模型中的應(yīng)用。 方法：應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法建立表 達(dá)綠色熒光蛋白的人肺癌細(xì)胞系NCI-H460-GFP并接種至裸小鼠體內(nèi)建立皮下移 植瘤模型，通過小動物活體成像系統(tǒng)連續(xù) 5周觀察腫瘤在動物皮下的動態(tài)生長情 況。結(jié)果：建立了轉(zhuǎn)染率接近100%勺NCI-H460-GFF細(xì)胞系，在體外及裸小鼠體

2、內(nèi) 均能夠長期穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白。活體熒光成像觀察發(fā)現(xiàn)：1 -4周隨著腫瘤體積逐漸增大，平均熒光量子數(shù)也逐漸增加，5周時隨著腫瘤出現(xiàn)明顯壞死，平均熒光量子數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢。結(jié)論：穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的NCI-H460-GFF細(xì)胞系 及其動物模型可以為肺癌研究提供理想的實(shí)驗(yàn)材料， 應(yīng)用小動物活體成像系統(tǒng)能 夠客觀定量評價腫瘤在動物體內(nèi)的生長情況。關(guān)鍵詞人肺癌；活體成像系統(tǒng)；裸小鼠；綠色熒光蛋白；慢病毒載體Dynamic observation of in vivo biofluorescence imaging of GFP-transfected human lung carcinoma in

3、 nude mice1 2 1 1 1 1YAN Ming-xia 1, Wu Hai-yan 2,Zhu Miao-xin 1,Liu Lei 1, Jia De-shui1,Kong H an-wei 1,1YAO Ming 1(1. Department of Experimental Pathology， Shanghai Cancer Institute， Shanghai 200032， China； 2. College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)ABSTRACT Obj

4、ective： To establish a human lung carcinoma cell line, which can stably express green fluorescent protein, and discuss the application of in vivo biofluorescent imaging system in animal model. Methods： Human lung carcinoma NCI-H460 cells were tranfected with gfp gene by lentiviral vector, and they w

5、ere transplanted into the subcutaneous of the nude mice for preparing the tumor-bearing mice. The biofluorescent signals were detected in sequential five weeks using in vivo fluorescent imaging system. Results： We had successfully built up a human lung carcinoma NCI-H460-GFP cell line, which can dis

6、play stable high-level GFP expression in vitro and in vivo. In vivo fluorescent images showed that the fluorescent intensities gradually increased with the increase of tumor volume in nude mice from one week to four weeks, whereas fluorescent intensities didnt agree with caliper-measured tumor volum

7、e in the fifth week. Conclusions： This high GFP-expressing cell line and animal model may be useful for the study of lung carcinoma, and in vivo fluorescent imaging system was fitted for evaluation and quantitation of the tumor growth.KEY WORDS ： Human lung carcinoma; In vivo imaging system; Nude mi

8、ce； Green fluorescent protein; lentiviral vector活體成像技術(shù)是近幾年新興的一項(xiàng)技術(shù)， 它是利用活體生物發(fā)光或熒光成像 技術(shù)直接監(jiān)測活細(xì)胞在動物體內(nèi)的生物學(xué)行為及跟蹤分子信號， 是檢測實(shí)驗(yàn)動物 體內(nèi)細(xì)胞及分子事件的強(qiáng)有力手段，目前已成為醫(yī)學(xué)、生物學(xué)及藥物開發(fā)等 1-5 研究領(lǐng)域發(fā)展最迅速的前沿技術(shù)。 國內(nèi)在活體成像技術(shù)方面的工作剛剛起步， 相 關(guān)技術(shù)尚 不成熟。本實(shí) 驗(yàn)旨在建立 穩(wěn)定 表達(dá)綠 色熒 光蛋 白 的人 肺癌 NCI-H460-GFP 細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，應(yīng)用活體成像技術(shù)動態(tài)觀察細(xì)胞在體內(nèi)、外的 熒光表達(dá)情況，為肺癌的深入研究提供理想的實(shí)驗(yàn)材

9、料及客觀的參考依據(jù)。 1 材料與方法1.1 材料1.1.1 人肺癌細(xì)胞株人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株 NCI-H460 來源于國家癌基因及相關(guān)基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn) 室，該細(xì)胞在體外用含10%臺牛血清的DME培養(yǎng)液進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物SPF級BALB/c nu/nu裸小鼠7只，68周，體重1822g，雄性，由上海 市腫瘤研究所提供實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號為 SCXK滬）2007 0001，實(shí)驗(yàn)操作 及動物 飼養(yǎng)嚴(yán)格按照 SPF 級標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行 實(shí) 驗(yàn)動 物使用 許可證號為 SYXK滬）2007 0001。1.1.3 儀器和試劑小動物活體熒光成像系統(tǒng)購自德國 Berthold Technologies

10、GmbH Co. KG， 型號為LB983 NC320分析軟件為 WinLight32。熒光顯微鏡購自O(shè)LYMPU公司。 來源于人類免疫缺陷病毒（HIV-1 ）的慢病毒載體系統(tǒng)的3種包裝質(zhì)粒PWPXL-GFP PAX2 PMD2C均來自tronolab 公司。胎牛血清購自 HyClone公司（Lot No.: NSF0050，培養(yǎng)皿及培養(yǎng)板等購自 Greiner Bio-one GmbH。1.2 方法1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒包裝：將293T細(xì)胞鋪于10cm培養(yǎng)皿，每10cm培養(yǎng)皿含2-2.5 x 106個 細(xì)胞，第二天進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。3種質(zhì)粒PWPXL-GF20卩g，PAX215卩g，PMD2G

11、5卩g 加水至500ul，加入500ul 2xHBS混勻。加入50ul 2.5M CaCb，輕輕混勻，室 溫放置 20-25 分鐘后滴加入培養(yǎng)基中。 6-8 小時后，更換培養(yǎng)基。第四天收集培 養(yǎng)基，3000rpm室溫離心5分鐘，0.45卩m濾膜抽濾。病毒可直接用于轉(zhuǎn)染或-70 度保存。病毒感染：將NCI-H460細(xì)胞鋪于24孔板，每孔2x 104個細(xì)胞。將Polybrene 加入24孔板中，終濃度為4卩g/ml。加入慢病毒，MOI=1000熒光顯微鏡觀察 細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)。1.2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活體熒光成像檢測取生長旺盛的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA常規(guī)消化

12、， 計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度，按50卩l(xiāng)體積含10, 100, 1000, 1 X 104, 5X 104, 1 X 105, 5X 105, 1 X 106個細(xì)胞依次滴加于黑色遮光紙，活體熒光成像系統(tǒng)（發(fā)射波長為 520nm,激發(fā)波長為480nm,曝光時間為1s）檢測各細(xì)胞濃度的熒光表達(dá)情況。 腫瘤體內(nèi)生長的活體熒光成像觀察收集生長旺盛的連續(xù)傳代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1X107個/ml，分別取0.2ml 接種于3只裸小鼠右背側(cè)近腋部皮下。當(dāng)皮下移植瘤長至直徑約10伽左右時剝?nèi)〕鲆浦擦觯蕹w維包膜及出血壞死部分，切取生長良好、淡紅色、魚肉狀的 瘤組織，將其剪切成若干1.5 mmX 1.5 mmX 1

13、.5伽的小塊，用20號套管針將腫瘤 小塊逐個移植至其他4只裸小鼠皮下，從而建立皮下移植瘤模型。每周游標(biāo)卡尺 測量皮下移植瘤直徑，計(jì)算移植瘤體積并繪制腫瘤生長曲線。使用小動物活體成像系統(tǒng)檢測 GFP表達(dá)的發(fā)射波長為520nm,激發(fā)波長為 480nm,曝光時間為1s。每周觀察皮下移植瘤生長情況，并定量分析各時間點(diǎn)的 熒光值，連續(xù)觀察5周。以腫瘤接種天數(shù)為橫坐標(biāo)，腫瘤接種部位單位面積熒光 值為縱坐標(biāo)，繪制皮下腫瘤生長曲線。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理將所有數(shù)據(jù)用SAS8.2軟件進(jìn)行處理，相關(guān)性采用SPEARMA等級相關(guān)進(jìn)行分 析，雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)為a = 0.05。計(jì)量資料以均值土標(biāo)準(zhǔn)差（x s）表示。熒光 值按公式：平

14、均熒光量子數(shù)=總量子數(shù)/熒光面積進(jìn)行計(jì)算。移植瘤體積按公式： V=aX b2 /2（V為瘤體積，a為長徑，b為短徑）進(jìn)行計(jì)算。2結(jié)果2.1 GFP標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞GF標(biāo)記的NCI-H460細(xì)胞為多邊形上皮樣細(xì)胞，貼壁生長，熒光顯微鏡觀察 可見細(xì)胞表達(dá)的熒光信號較強(qiáng)，熒光較為均勻地分布于整個細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染率接近 100%細(xì)胞在體外能夠穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白， 并且隨體外長期傳代培養(yǎng)無明顯 消退（圖1）0圖1穩(wěn)定高表達(dá)GFP勺NCI-H460-GFF細(xì)胞(A) NCI-H460-GFP田胞熒光圖(X 200) (B) NCI-H460-GFF細(xì)胞明場圖(X 200) Fig . 1 Stable and

15、 high level GFPexpression NCI-H460-GFPceils in vitro(A) Image of NCI-H460-GFP cells visualized with an in verted fluoresce nee microscopy(200 X magnification).(B) Image of (A) visualized with an in verted microscopy(200Xmagn ificati on).2.2活體熒光成像檢測NCI-H460-GFP的體外表達(dá)通過活體熒光成像系統(tǒng)觀察 NCI-H460細(xì)胞不同濃度的熒光表達(dá)，結(jié)果

16、可見: 該成像系統(tǒng)能夠檢測的最小細(xì)胞數(shù)為 100個腫瘤細(xì)胞，儀器靈敏度較高，隨著細(xì) 胞濃度的遞增，熒光表達(dá)的強(qiáng)度也逐漸增加，即平均熒光量子數(shù)與細(xì)胞濃度成正 比(圖2)。655441X105X101X105X101X10100010010CNumber of cellsnMsne n 2t m e m n s e h(圖2活體熒光成像系統(tǒng)觀察不同濃度細(xì)胞的綠色熒光蛋白表達(dá)(A)不同濃度NCI-H460-GFP細(xì)胞活體成像偽彩圖(B)不同濃度NCI-H460-GFP 細(xì)胞活體成像軟件分析參考圖(C)不同濃度NCI-H460-GFP細(xì)胞熒光定量Fig.2 GFP expression of NCI-

17、H460 with different cells concentrations in vitro observed by in vivo biofluorese nt imagi ng system(A)Pseudo-color image of NCI-H460-GFP cells with differe nt cells concentration .(B)Reference image of dimensional distribution and relative amplitude of fluoresce nce drow n by Win light 32 software.

18、 (C) Quan tificatio n of fluoresce nce of NCI-H460-GFP cells.2.3活體熒光成像動態(tài)觀察 NCI-H460-GFP皮下移植瘤的生長NCI-H460-GFP皮下移植瘤的生長潛伏期約 5天，1周時腫瘤大小不能用游標(biāo) 卡尺測量，2周時腫瘤進(jìn)入對數(shù)生長期，至 5周時移植瘤體積可達(dá)(3782.00 852.89 )伽3，4只動物皮膚表面都出現(xiàn)了不同程度的壞死。應(yīng)用小動物活體熒 光成像系統(tǒng)可監(jiān)測到綠色熒光在裸小鼠皮下的穩(wěn)定表達(dá)，從第1周至第4周，隨著腫瘤移植時間的增加，表達(dá)綠色熒光的面積逐漸增大，熒光量子數(shù)也逐漸增加， 移植瘤體積與熒光量子數(shù)成正

19、相關(guān)(R=0.86713,P0.05 )(圖3, 4， 5)。1w2w3w4w5w圖3活體熒光成像動態(tài)檢測NCI-H460-GFPffl胞在裸小鼠體內(nèi)的表達(dá)Fig.3 Dyn amic observati onof in vivo biofluoresce ntimag ing of theNCI-H460-GFP tumor in four n ude mice from 1 week to five weeks/Tnnrxccnecssro J- D J ro muL M800000002)70000000 mm600000005000000040000000300000002000000

20、0100000000Days post-impla ntati on500045004000 3)350030002500 U2000 O150010005000圖4 NCI-H460-GFP的腫瘤生長曲線與與熒光值的動態(tài)變化Fig. 4 The tumor growth curve of NCI-H460-GFP and dynamic change of biofluoresce nee80000000ecnecsero J - QID naeR=0.86713(P0.001)50010001500200025003000Tumor volume(mm3)70000000600000005

21、0000000400000003000000020000000100000000圖5腫瘤體積與熒光值的相關(guān)性分析Fig. 5 The correlatio n an alysis betwee n tumor volume and biofluoresce nee duri ng tumor proliferati on討論活體熒光成像技術(shù)自從出現(xiàn)以來已經(jīng)成為了生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的強(qiáng)有力 的手段。與之密切相關(guān)的活細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)也得到了越來越快速的發(fā)展。1994年Chalfie等首次在大腸桿菌和線蟲中表達(dá)了GFP開創(chuàng)了 GFP應(yīng)用研究的先河，近年來，綠色熒光蛋白已成為應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記性蛋白質(zhì)之一

22、。與B-半乳糖苷酶（LacZ）、螢火蟲熒光素酶（Luc）等報(bào)告基因相比，gfp基因表達(dá)的綠色 熒光蛋白受到藍(lán)光或紫光照射時可自發(fā)地發(fā)出綠色熒光，熒光信號強(qiáng)度高，易于被捕獲，無需其他底物或輔助因子的協(xié)助便可直接通過活體成像系統(tǒng)、 激光共聚 焦顯微鏡或流式細(xì)胞儀等進(jìn)行檢測，觀察極其直觀方便 7 。此外，它還具有穩(wěn)定 性好、耐受性強(qiáng)、對組織或細(xì)胞無毒性、易于構(gòu)建載體等優(yōu)點(diǎn)。因此，GFP在腫瘤的生長、藥效評價和基因治療等方面都得到了廣泛的應(yīng)用。但是，由于 GFP 的發(fā)射波長較短因而穿透力稍差， 在腫瘤應(yīng)用研究的某些方面仍然存在一定局限 性。如YANG等8認(rèn)為熒光的強(qiáng)弱與腫瘤大小、深度有關(guān)，淺表部位可以

23、檢測到 的最小病灶為59卩m而深部腫瘤由于受到周圍組織的干擾，小的病灶常難以顯 示。Caceres等也證實(shí)GFP標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞適合于對淺表部位的腫瘤進(jìn)行成像 研究，而熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞適合于對深部組織的原發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行研究。 基因轉(zhuǎn)染技術(shù)是分子生物學(xué)的常用技術(shù)之一，轉(zhuǎn)染所用載體主要包括病毒載體(逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒等)和非病毒載體(脂質(zhì)體、DEAE葡聚糖、磷酸鈣共沉淀、電穿孔等)。慢病毒 ( lentivirus) 屬逆轉(zhuǎn)錄病毒亞屬 , 具有能夠轉(zhuǎn) 染分裂和非分裂的細(xì)胞、目的基因整合入靶細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)治療基因 , 無明顯免疫 反應(yīng)等特性 , 同時能夠轉(zhuǎn)染廣泛的組織、能夠被濃縮成高滴度等

24、優(yōu)點(diǎn) 10。脂質(zhì)體 載體最主要的優(yōu)點(diǎn)是介導(dǎo)的目的基因大小不受限制、 無生物源性和毒性， 更安全 可靠。但是它的轉(zhuǎn)染效率較低，轉(zhuǎn)染效果不穩(wěn)定，在動物體內(nèi)缺少G418的選擇壓力作用下只能短暫表達(dá)， 隨著新的腫瘤細(xì)胞的不斷復(fù)制分離， 表達(dá)的熒光強(qiáng)度 會逐漸衰退。本實(shí)驗(yàn)以來源于人類免疫缺陷病毒 -1 ( HIV- 1 )的慢病毒為載體， 成功建立了能夠在體外和體內(nèi)都能穩(wěn)定、長期、高效表達(dá)綠色熒光蛋白的 NCI-H460-GFP細(xì)胞，為活體熒光成像系統(tǒng)的進(jìn)一步應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)?；铙w動物體內(nèi)光學(xué)成像技術(shù)具有極高的靈敏度， 對疾病動物模型微小病灶的 檢測靈敏度極高；該技術(shù)能夠進(jìn)行無創(chuàng)、實(shí)時、動態(tài)的動物活

25、體觀察，從而對同 一實(shí)驗(yàn)對象進(jìn)行不同時間點(diǎn)的觀察， 減少實(shí)驗(yàn)動物個體間差異， 與傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方 法相比，可以大大減少動物的用量，符合替代、減少、優(yōu)化的“ 3R原則。本實(shí) 驗(yàn)在成功建立表達(dá)綠色熒光蛋白的人肺癌細(xì)胞系NCI-H460-GFP的基礎(chǔ)上，使用活體成像系統(tǒng)對不同濃度的細(xì)胞進(jìn)行了體外熒光表達(dá)檢測， 結(jié)果發(fā)現(xiàn) 100個細(xì)胞 就可以檢測到，說明成像系統(tǒng)具有較高的檢測靈敏度。通過連續(xù)動態(tài)觀察 NCI-H460-GFP在裸小鼠體內(nèi)的生長情況，發(fā)現(xiàn)成像系統(tǒng)在腫瘤皮下移植7天時就可以檢測到熒光的表達(dá)， 此時按傳統(tǒng)方法尚無法測量移植瘤體積。 隨著移植瘤 體積的不斷增加， 成像系統(tǒng)可以通過平均量子數(shù)客觀地描

26、述腫瘤的生長， 所得數(shù) 據(jù)與游標(biāo)卡尺測量的腫瘤體積相對應(yīng)。 至5周時瘤體表面出現(xiàn)壞死以后， 盡管游 標(biāo)卡尺測量的腫瘤體積仍在增加， 但成像系統(tǒng)所測的熒光量子數(shù)反而呈現(xiàn)下降趨 勢，原因可能是GFP屬于報(bào)告基因只能在活細(xì)胞中才能表達(dá)。活體成像系統(tǒng)能夠 更加準(zhǔn)確地反應(yīng)腫瘤生長的實(shí)際情況， 有利于減小人為實(shí)驗(yàn)誤差， 所獲得的實(shí)驗(yàn) 結(jié)果更加直觀可靠。 同時，應(yīng)用該系統(tǒng)也可以使實(shí)驗(yàn)動物的用量大為減少， 節(jié)約 了實(shí)驗(yàn)成本， 而且是以自身為對照動態(tài)追蹤腫瘤的生長變化， 有效的排除了動物 個體間差異的影響。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法成功建立了人肺癌 NCI-H460-GFP細(xì)胞系，通 過小動物活體成像系統(tǒng)檢測證

27、實(shí)該細(xì)胞具有在體外和動物體內(nèi)均能穩(wěn)定、持續(xù)、 高效的表達(dá)綠色熒光蛋白的特點(diǎn)。 另外，活體成像系統(tǒng)具有較高的靈敏性， 能夠 客觀評價NCI-H460-GFP細(xì)胞在裸小鼠體內(nèi)的生長情況，為成像系統(tǒng)的在肺癌的 發(fā)展機(jī)理、藥物治療、基因治療等方面研究提供重要的參考依據(jù)。致謝：真誠感謝“國家癌基因及相關(guān)基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”李宗海副研究員對本實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)和幫助。參考文獻(xiàn)：1 ANDY J. MINN,GAORA V P. GUPTA,PETER M.SIEGEL, et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lungJ.Nature,2005,43

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