IgA腎病系膜細(xì)胞負(fù)周期調(diào)控蛋白的表達(dá)水平與病理_第1頁(yè)
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1、IgA腎病系膜細(xì)胞負(fù)周期調(diào)控蛋白的表達(dá)水平與病理?yè)p害程度、中醫(yī)證型之間的相關(guān)研究 專 業(yè):中西醫(yī)結(jié)合臨床研究生:?jiǎn)?瑞 英 導(dǎo) 師:鄭 京 副教授摘 要ABSTRACT目的:1. 探討IgA腎病患者腎小球系膜細(xì)胞中負(fù)周期調(diào)控蛋白p21、p27和增殖細(xì)胞核抗原PCNA的表達(dá)水平與腎臟病理?yè)p害程度(Lee分級(jí)和Katafuchi積分)之間的關(guān)系;2. 周期相關(guān)蛋白p21、p27和PCNA的表達(dá)水平與中醫(yī)辨證分型(肺腎氣虛、肝腎陰虛、氣陰兩虛、脾腎陽(yáng)虛)之間的關(guān)系;3.負(fù)周期調(diào)控蛋白p21、p27與PCNA等指標(biāo)的相關(guān)性。方法:1. 收集通過腎活檢確診的原發(fā)性IgA腎病患者61例,行腎活檢時(shí)進(jìn)行中醫(yī)

2、辨證分型。取腎挫裂傷腎摘除患者6例為正常對(duì)照。2. 對(duì)連續(xù)病理切片行免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腎組織p21、p27、PCNA等指標(biāo)。3. 腎臟病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)采用Lee氏分級(jí)和Katafuchi積分(由南京軍區(qū)福州總醫(yī)院病理科評(píng)定分級(jí))。結(jié)果:1.IgA腎病患者Lee氏分級(jí)間,與正常對(duì)照組比較,、級(jí)p21、p27、PCNA表達(dá)水平均有顯著性差異,P0.01;與級(jí)比較,、級(jí)p21、PCNA表達(dá)顯著增高P0.01,p27表達(dá)顯著降低,P0.01;與級(jí)比較,級(jí)p21、PCNA表達(dá)有明顯意義P0.05,p27表達(dá)降低非常顯著,P0.01。2. 與正常組比較,中醫(yī)各證型組均有顯著性意義,P0.01;與肺腎氣虛組比

3、較,肝腎陰虛組p21表達(dá)有明顯增高,P0.05,p27、PCNA變化不明顯,P0.05;氣陰兩虛組p21的表達(dá)顯著增高,P0.01,p27表達(dá)明顯降低,P0.05,PCNA的表達(dá)明顯增高,P0.05;與肝腎陰虛組比較,氣陰兩虛組p21、PCNA表達(dá)無(wú)明顯增高,P0.05,p27表達(dá)明顯降低,P0.05;與氣陰兩虛組比較,脾腎陽(yáng)虛組p21、PCNA表達(dá)明顯升高,P0.05,p27的表達(dá)顯著降低,P0.01。3. Lee氏級(jí)中醫(yī)證型主要表現(xiàn)為肺腎氣虛證,級(jí)表現(xiàn)以肝腎陰虛為主,少數(shù)為肺腎氣虛、氣陰兩虛證,而級(jí)則主要表現(xiàn)脾腎陽(yáng)虛證,兼有少數(shù)肝腎陰虛證、氣陰兩虛證。從腎臟損害Katafuchi積分結(jié)果顯

4、示與肺腎氣虛組比較,肝腎陰虛組加重?zé)o明顯意義P0.05,氣陰兩虛組損害較重P0.05,脾腎陽(yáng)虛組損害顯著加重P0.01;與肝腎陰虛組比較,氣陰兩虛組明顯加重P0.05,脾腎陽(yáng)虛組顯著加重P0.01;與氣陰兩虛組比較,脾腎陽(yáng)虛組明顯加重P0.05。4. 負(fù)調(diào)控蛋白p21與PCNA呈顯著正相關(guān),r0.603,p27與PCNA呈明顯負(fù)相關(guān),r-0.264。結(jié)論:1. IgA腎病腎小球系膜細(xì)胞中負(fù)周期調(diào)控蛋白p21的表達(dá)隨Lee分級(jí)增高呈增高趨勢(shì),p27的表達(dá)隨Lee分級(jí)增加呈降低趨勢(shì),增殖細(xì)胞核抗原PCNA與增殖程度相一致。負(fù)周期調(diào)控蛋白p21與增殖細(xì)胞核抗原PCNA表達(dá)呈正相關(guān),p27與PCNA呈

5、負(fù)相關(guān)。說明負(fù)周期調(diào)控蛋白與系膜細(xì)胞的增殖程度有密切的關(guān)系。 2. IgA腎病肺腎氣虛證、肝腎陰虛證,至氣陰兩虛證、脾腎陽(yáng)虛證各組p21、p27的表達(dá)較正常組有顯著的差異。p27的表達(dá)呈下降趨勢(shì),p21的表達(dá)逐漸增高,與增殖程度相一致的PCNA表達(dá)也逐漸增多;在脾腎陽(yáng)虛組p27表達(dá)下降非常顯著,p21表達(dá)升高顯著。說明負(fù)周期調(diào)控蛋白的表達(dá)程度可能與不同中醫(yī)證型的表現(xiàn)有著一定的關(guān)系。 3.IgA 腎病患者腎臟病理Lee氏級(jí)中醫(yī)證型主要表現(xiàn)為肺腎氣虛證,級(jí)表現(xiàn)以肝腎陰虛為主,而級(jí)則主要表現(xiàn)為脾腎陽(yáng)虛證,脾腎陽(yáng)虛組腎臟病理?yè)p害Katafuchi積分最高,肝腎陰虛組、氣陰兩虛組及肺腎氣虛組積分依次降低

6、。說明中醫(yī)證型從肺腎氣虛、肝腎陰虛、氣陰兩虛、脾腎陽(yáng)虛的變化,在一定程度上反應(yīng)了IgA腎病腎臟病理?yè)p害程度。 主題詞:IgA腎病/診斷 辯證分型/診斷腎臟病理免疫組化周期素依賴性激酶抑制蛋白p21p27增殖細(xì)胞核抗原 The Correlated Research on the Changes of Cyclin-dependent kinaseInhibitor of mesangial Cells and the Degree of Pathological Lesion、TCM Syndromes in IgA NephropathyMajor:Clinic of integrated

7、western medicine and TCMPostgraduate:Qiao RuiyingTutor: Vice Prof.Zheng JingABSTRACTObjective:1.To study the relationship between the changes of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21、p27 and proliferating cell nuclear antigen(PCNA) and the degree (Lees and Katafuchis) of pathological lesion in I

8、gA nephropathy patients. 2.To study the relationship between the level changes of the cycle modulin p21、p27 and PCNA expression and the differentiation of symptoms and signs for classification of syndrome(insufficiency of QI of the lung and kidney、hepatic and renal yin deficiency、deficiency of both

9、vital energy and yin、asdthenic splenonephro-yang). 3. To evaluate the correlation between the cyclin-dependent kinase inhibitor p21、p27 and PCNA expression. Methods:1.To collect 61 examples of primarily IgA nephropathy to definite by renal biopsy, and to evaluate the differentiation of symptoms and

10、signs for classification of syndrome during the renal biopsy. 2.To detect the p21、p27 and PCNA expression by Immunohistoche stain to successive pathological section. 3.The standardization of the grade of renal pathology was formulated by Lee and Katafuchi.Results:1. Compared to the normal control ,

11、it was very significant on the level of p21、p27、PCNA expression in the grade 、 of Lees .Compared to the grade of Lees, the p21、PCNA expression in the grade 、 advanced highly significant, but the p27 degraded significantly,P0.01;Compared to the grade of Lees, the p21、PCNA expression were significant,

12、P0.05,the p27 expression degraded significantly,P0.01. 2. Compared to the normal control , it was very significant on every group of type of syndrome of traditional Chinese medicine, Compared to the group of insufficiency of QI of the lung and kidney, the p21 expression increased highly significant,

13、 P0.05, the p27 、PCNA expression was nonsignificantly,P0.05, in the group of hepatic and renal yin deficiency; the p21、PCNA expression increased highly significant, the p27 expression degraded significantly in the group deficiency of both vital energy and yin、deficiency of both vital energy and yin

14、and asdthenic splenonephro-yang. 3.The group of insufficiency of QI of the lung and kidney included principally the grade of the renal biopsy, but the group of asdthenic splenonephro-yang included principally the grade . Compared to the group of insufficiency of QI of the lung and kidney、hepatic and

15、 renal yin deficiency, the scores of Katafuchis in the group of asdthenic splenonephro-yang increased highly significant P0.01. Compared to the group of deficiency of both vital energy and yin, the scores of Katafuchis in the group of asdthenic splenonephro-yang increased obviously P0.05. 4.The p21

16、expression was positive correlation to the PCNA expression ,r0.603; and the p27 expression was negative correlation to the PCNA, r-0.264.Conclusions:1.The expressive tendency of the p21 was high, and the p27、PCNA was degrade according to the degree of the renal pathological lesion in IgA nephropathy

17、 patients. The expression of the p21 was positive correlation to the expression of the PCNA, and the expression of the p27 was negative correlation to the PCNA. It was closed relation between the changes of the cyclin-dependent kinase inhibitor and the proliferated degree of mesangial cells. 2.The e

18、xpression of the p21 started in the insufficiency of QI patients,but the expression of the p27 was higher. Compared to insufficiency of QI, the expression of the p21 was highest ,yet the p27 was lowest. It shows that the level of negtive modulins may play a role in Zheng differentiation of TCM. 3.Th

19、e group of insufficiency of QI of the lung and kidney included principally the grade of the renal biopsy, but the group of asdthenic splenonephro-yang included principally the grade .The score of Katafuchis was highest in the group of asdthenic splenonephro-yang ,and the group of hepatic and renal y

20、in deficiency、deficiency of both vital energy and yin、insufficiency of QI of the lung and kidney was lower by turns. Zheng differentiation classification of TCM may reveals the degree of renal pathological lesion of IgA nephropathy.Mesh Terms:IgA nephropathy/diag differentiation of symptoms and sign

21、s for classification of syndrome/diagrenal pathological lesion Immunohistoche staincyclin-dependent kinase inhibitor,CKIp21p27proliferating cell nuclear antigen ,PCNAIgA腎病系膜細(xì)胞負(fù)周期調(diào)控蛋白的表達(dá)水平與病理?yè)p害程度、中醫(yī)證型之間的相關(guān)研究專 業(yè):中西醫(yī)結(jié)合臨床研究生:?jiǎn)?瑞 英導(dǎo) 師:鄭 京 副教授前 言INTRODUCTIONIgA腎病是全世界最常見的原發(fā)性腎小球腎炎,是導(dǎo)致終末期腎衰竭最常見的原因之一。1,2,也是我國(guó)

22、最常見的原發(fā)性腎小球疾病,發(fā)病率較高,占原發(fā)性腎小球疾病的3040。腎臟病理見腎小球系膜區(qū)以IgA免疫復(fù)合物為主的顆粒樣沉積,同時(shí)有系膜細(xì)胞的增生,基質(zhì)增多,系膜區(qū)電子致密物沉積。通過長(zhǎng)期觀察發(fā)現(xiàn)約20的IgA腎病患者經(jīng)20年臨床疾病演變后進(jìn)展至終末期腎功能衰竭。腎臟固有細(xì)胞的增殖和肥大以及細(xì)胞外基質(zhì)的積聚是許多腎臟疾病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié),并最終導(dǎo)致腎小球硬化。因此腎臟固有細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控對(duì)預(yù)防和延緩腎臟疾病的進(jìn)展具有重要意義。細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控最終發(fā)生在細(xì)胞周期水平上,近年來,人們對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白在腎臟疾病中的作用做了大量的工作。細(xì)胞周期調(diào)控蛋白分為正調(diào)控蛋白和負(fù)調(diào)控蛋白,正、負(fù)調(diào)控蛋白在細(xì)胞周

23、期過程中起著非常重要的作用。細(xì)胞周期中各期時(shí)間相對(duì)固定,只有G1期時(shí)間可以改變,G1期時(shí)間的長(zhǎng)短決定細(xì)胞周期的時(shí)間,G1/S檢驗(yàn)點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵點(diǎn)。所以通過把細(xì)胞阻滯在G1期是抑制細(xì)胞增殖的關(guān)鍵,Cip/Kip家族包括p21、p27、p57,能廣泛抑制大多數(shù)周期素(cyclin)和周期素依賴性激酶(cell cycle dependent kinase, CDK)組成的復(fù)合物(cyclin/CDK復(fù)合物),使細(xì)胞不能通過G1/S檢驗(yàn)點(diǎn),停滯在G1期。研究表明p57僅在腎小球上皮細(xì)胞表達(dá),p21、p27主要在腎小球系膜細(xì)胞表達(dá)3,4。p21又可以與細(xì)胞DNA聚合酶的輔助蛋白:增

24、殖細(xì)胞核抗原(PCNA,其在G1晚期表達(dá)開始增加,在S期達(dá)到高峰,其表達(dá)可反映細(xì)胞增殖的程度)結(jié)合,抑制DNA的復(fù)制,從而抑制細(xì)胞周期的完成。祖國(guó)醫(yī)學(xué)中無(wú)“IgA腎病”一名,但根據(jù)其臨床癥狀,本病屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)的“尿血”、“腰痛”、“水腫”、“虛勞”等范疇。該病的主要病位主要在肺、脾、腎三臟,病證總屬本虛標(biāo)實(shí),本虛常見肺腎氣虛、肝腎陰虛、氣陰兩虛、脾腎陽(yáng)虛,標(biāo)實(shí)則概之為濕熱、濕濁、血瘀等。在臨床工作中發(fā)現(xiàn),病理?yè)p害程度的輕重有時(shí)與中醫(yī)證型的變化有著一定的關(guān)系。金世建等5認(rèn)為系膜增殖性腎炎為本虛標(biāo)實(shí),其中本虛以陰虛為主,后期轉(zhuǎn)為氣陰兩虛;劉宏偉等6認(rèn)為,腎臟炎性病變多遵循傷陰氣陰兩虛陽(yáng)虛陰陽(yáng)兩虛的

25、發(fā)展過程。本研究通過細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控蛋白p21、p27及增殖細(xì)胞核抗原PCNA在IgA腎病腎小球系膜細(xì)胞中的表達(dá)水平,以探討系膜細(xì)胞的增殖程度與負(fù)周期調(diào)控蛋白p21、p27及PCNA之間的關(guān)系,隨中醫(yī)各證型的變化,觀察p21、p27及PCNA表達(dá)的變化,及其與病理?yè)p害程度的關(guān)系,進(jìn)一步探討外在的中醫(yī)證型變化與病理?yè)p害的內(nèi)在關(guān)系。材 料 與 方 法MATERALS AND METHODS1病例診斷標(biāo)準(zhǔn)1.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn):參照文獻(xiàn)7,8。腎活檢組織病理,光鏡下見局灶或彌漫姓腎小球系膜區(qū)擴(kuò)張,系膜細(xì)胞增殖;免疫熒光檢查見系膜區(qū)彌漫性IgA免疫復(fù)合物沉積;電鏡下見系膜區(qū)電子致密物沉積。并根據(jù)臨床資料排

26、除過敏性紫癜腎炎、乙肝相關(guān)性腎炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡性腎炎等繼發(fā)性疾病。病理分級(jí)采用1982年Lee分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)9:級(jí)別 腎小球變化 腎小管-間質(zhì)變化I 基本正常,偶有輕度系膜擴(kuò)大,伴有 無(wú)變化 或不伴有系膜增多II 50%腎小球出現(xiàn)局灶性系膜增生 基本正常 和硬化,偶有小的新月體形成 III 彌漫系膜增生,有小的新月體形成, 局灶間質(zhì)水腫,炎癥細(xì)胞 球囊粘連胞浸潤(rùn),腎小管萎縮 浸潤(rùn)IV 明顯彌漫系膜增生、硬化,<45腎小球 腎小管萎縮間質(zhì)炎性細(xì)胞有新月體形成,常見部分腎小球硬化 浸潤(rùn)V 與IV型相似但更嚴(yán)重,> 45%腎小球有新月 與IV相似,但更嚴(yán)重 體形成腎小球、腎小管及血管的各項(xiàng)病

27、理參數(shù)采用Katafuchi10 的半定量標(biāo)準(zhǔn):總積分127分腎小球積分112分 腎小管間質(zhì)積分09分 血管積分06分系膜增殖程度(0-4分) 間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)(03分) 管壁增厚(0-3分)節(jié)段損害如新月體形成、 間質(zhì)纖維化(0-3分) 玻璃樣變性(03分)節(jié)段硬化和球囊粘連(04分) 球性硬化(04分) 腎小管萎縮(03分)1.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn): 參照1993年中醫(yī)新藥臨床研究指導(dǎo)原則中的中藥新藥治療慢性腎炎的臨床指導(dǎo)原則。選用其中的四個(gè)本證證型:肺腎氣虛證,肝腎陰虛證,氣陰兩虛證,脾腎陽(yáng)虛證。凡具備下列各證型中任何3項(xiàng)癥狀者,即可診斷為該證型。(1)肺腎氣虛證:面浮肢腫,面色萎黃;少氣無(wú)力

28、;易感冒;腰脊酸痛;舌淡、有齒痕,苔白潤(rùn),脈細(xì)弱。(2)肝腎陰虛證:目睛干澀或視物模糊;頭暈耳鳴;五心煩熱,口干咽燥;腰脊酸痛,夢(mèng)遺和月經(jīng)失調(diào);舌紅少苔,脈弦細(xì)或細(xì)數(shù)。(3)氣陰兩虛證:腰酸痛,水腫;少氣乏力;易感冒;午后低熱或手足心熱;口干咽燥或長(zhǎng)期咽痛,咽部暗紅;大便先干后??;舌質(zhì)偏暗,少苔脈細(xì)或脈弱。(4)脾腎陽(yáng)虛證:浮腫明顯,面白;畏寒肢冷;腰脊酸痛或脛酸腿軟,足跟痛;神疲,納呆或便溏;性功能失常(遺精、陽(yáng)萎、早泄)或月經(jīng)失調(diào);舌嫩淡胖,有齒痕,脈沉細(xì)或沉遲無(wú)力。2納入及排除標(biāo)準(zhǔn)2.1 納入標(biāo)準(zhǔn):凡符合西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)和中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn),均納入試驗(yàn)病例。2.2 排除標(biāo)準(zhǔn):1) 不符合納入標(biāo)準(zhǔn),

29、資料不全影響判斷者;2) 年齡10歲或60歲者; 3) 腎功能不全,血肌酐265.2umol/L者; 4) 排除由系統(tǒng)性紅斑狼瘡、過敏性紫癜、肝臟疾病等引起的繼發(fā)性IgA腎病。3研究對(duì)象所有病例均來自2003年至2005年10月福建省人民醫(yī)院和南京軍區(qū)福州總醫(yī)院的住院病人。共收集行腎穿刺病理診斷為IgA腎病的患者65例,其中分級(jí)不明確介于兩個(gè)級(jí)別之間的3例,腎小球數(shù)目少于5個(gè)的1例,故予以剔除。實(shí)際納入病例61人,其中男36例,女25例,最大年齡51歲,最小年齡10歲,平均年齡31.41±9.65歲。根據(jù)Lee氏分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),其中級(jí)18例,男11例,平均年齡33.91±11.2

30、7歲,女7例,平均年齡32.43±11.47歲;級(jí)20例,男14例,平均年齡25.29±11.14歲,女6例,平均年齡36.17±7.39歲;級(jí)23例,男11例,平均年齡34.45±5.41歲,女12例,平均年齡31.42±6.53歲。根據(jù)中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn):其中肺腎氣虛型16例,男11例,平均年齡29.45±12.45歲,女5例,平均年齡36.60±6.19歲;肝腎陰虛型21例,男13例,平均年齡27.08±9.81歲,女8例,平均年齡30.88±10.55歲;氣陰兩虛型13例,男5例,平均年齡37.8&

31、#177;10.71歲,女8例,平均年齡33.75±8.76歲;脾腎陽(yáng)虛型11例,男7例,平均年齡34.43±5.06歲,女4例,平均年齡30.25±2.50歲。正常對(duì)照組來自南平市第一人民醫(yī)院病理科,腎挫裂傷腎切除患者6例,男4例,女2例,平均年齡34.50±6.85歲。經(jīng)齊同性檢驗(yàn),正常組與IgA腎病組及Lee氏分級(jí)各組間、中醫(yī)各證型組間性別、年齡在分布上具有可比性(P0.05)。4指標(biāo)檢測(cè)4.1 試劑與儀器:鼠抗人單克隆抗體p21 Protein(WAF1 Protein)、p27,鼠抗人單克隆抗體PCNA試劑,二抗PV-6001試劑盒均購(gòu)自北京中

32、杉金橋生物技術(shù)有限公司;北京航空航天大學(xué)CMIAS病理圖像分析系統(tǒng)。4.2 檢測(cè)方法:所有腎組織病理切片均行免疫組化二步法,用乳腺癌陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照。 烤片、脫蠟:3µm石蠟切片放入烤箱內(nèi)60過夜,后經(jīng)二甲苯溶液及酒精梯度脫蠟至水;蒸餾水沖洗,PBS浸泡5分鐘;抗原修復(fù)枸櫞酸酸鹽溶液PH6.0,高壓煮沸2分鐘; 3H2O2室溫孵育10分鐘,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性;滴加一抗工作液,37孵育2小時(shí),PBS沖洗,2分鐘×3次;滴加二抗(Poly peroxidase-anti-mouse IgG)室溫孵育30分鐘,PBS沖洗,2分鐘×3次;DAB顯色劑顯色;自來水

33、沖洗,復(fù)染,封片。4.3 各指標(biāo)半定量檢測(cè) 采用圖像分析系統(tǒng)(北京航空航天大學(xué)CMIAS病理圖像系統(tǒng))對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行分析,每張切片分別在高倍鏡(×400倍)下隨機(jī)選取5個(gè)腎小球,進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)胞核顯示棕褐色為陽(yáng)性核,顯示藍(lán)色為陰性核,利用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分別對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞核、陰性細(xì)胞核計(jì)數(shù),p21、p27、PCNA的陽(yáng)性率陽(yáng)性核數(shù)/(陰性核數(shù)陽(yáng)性核數(shù))×100,最后取5個(gè)腎小球的平均值。5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:p21、p27、PCNA的分布呈正態(tài)分布,所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示,計(jì)量資料組間指標(biāo)比較使用F、q檢驗(yàn),對(duì)指標(biāo)間進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié) 果RESULTS1.

34、 Lee氏分級(jí)間p21、p27、PCNA各指標(biāo)間的變化,見表1。表1. Lee氏分級(jí)間與P21、P27、PCNA之間的變化比較(±S)Lee氏分級(jí) N p21 p27 PCNA正常組 6 9.09±1.57 67.01±2.04 9.28±0.91 18 32.54±10.65 58.27±5.29 33.28±6.48 20 46.67±10.28 53.53±5.01 56.63±7.65 23 53.06±8.64* 45.01±7.69* 62.52±8.8

35、9*注:與正常組比較P0.01; 與級(jí)比較P0.01; 與級(jí)比較* P0.05,* P0.01。表1結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組比較,、級(jí)p21、p27、PCNA表達(dá)水平均有顯著性差異,P0.01;與級(jí)比較,、級(jí)p21、PCNA表達(dá)顯著增高P0.01,p27表達(dá)顯著降低,P0.01;與級(jí)比較,級(jí)p21、PCNA表達(dá)有明顯意義P0.05,p27表達(dá)降低非常顯著,P0.01。2. 腎組織中p21、p27與PCNA之間的相關(guān)關(guān)系,見表2。表2. P21、P27與PCNA之間的相關(guān)系數(shù) p21 p27PCNA 0.603* -0.264*注:* P0.05,* P0.01。表2結(jié)果顯示:p21與PCNA呈正

36、相關(guān),r0.603,P0.01;p27與PCNA呈負(fù)相關(guān),r-0.264,P0.05。3.中醫(yī)各證型間p21、p27、PCNA表達(dá)變化關(guān)系,見表3。表3. 中醫(yī)各證型中與P21、P27、PCNA的變化比較(±S)中醫(yī)證型 N p21 p27 PCNA正常組 6 9.09±1.57 67.01±2.04 9.28±0.91 肺腎氣虛 16 33.67±11.90 56.95±4.94 41.88±14.05肝腎陰虛 21 43.19±10.14 54.90±5.73 50.75±13.00氣陰兩虛

37、 13 46.27±11.51 49.43±5.99* 55.03±13.16脾腎陽(yáng)虛 11 56.21±6.44* # 39.81±6.03 * # # 65.31±8.31 * #注:與正常組比較P0.01;與肺腎氣虛組比較P0.05,P0.01;與肝腎陰虛組比較*P0.05,* P0.01; 與氣陰兩虛組比較# P0.05, # #P0.01。表3結(jié)果顯示:與正常組比較,中醫(yī)各證型組均有顯著性意義,P0.01;與肺腎氣虛組比較,肝腎陰虛組p21表達(dá)有明顯增高,P0.05,p27、PCNA變化不明顯,P0.05;氣陰兩虛組p21的

38、表達(dá)顯著增高,P0.01,p27表達(dá)明顯降低,P0.05,PCNA的表達(dá)明顯增高,P0.05;與肝腎陰虛組比較,氣陰兩虛組p21、PCNA表達(dá)無(wú)明顯增高,P0.05,p27表達(dá)明顯降低,P0.05;與氣陰兩虛組比較,脾腎陽(yáng)虛組p21、PCNA表達(dá)明顯升高,P0.05,p27的表達(dá)顯著降低,P0.01。4.中醫(yī)各證型與腎臟病理Lee分級(jí)、Katafuchi積分之間的關(guān)系,見表4。表4. 中醫(yī)各證型與腎臟病理Lee分級(jí)及Katafuchi積分之間的關(guān)系中醫(yī)證型 N (%) (%) (%) Katafuchi積分肺腎氣虛 16 11(61.1) 5(25.0) 0 (0) 6.13±2.0

39、3肝腎陰虛 21 5 (27.8) 10(50.0) 6(26.1) 7.00±2081氣陰兩虛 13 2(11.1) 5(25.0) 6(26.1) 9.38±3.04*脾腎陽(yáng)虛 11 0(0) 0 (0) 11(47.8) 14.36±3.75*#注:與肺腎氣虛組比較P0.05,P0.01;與肝腎陰虛組比較 * P0.05, * P0.01;與氣陰兩虛組比較# P0.05。表4結(jié)果顯示,Lee氏級(jí)中醫(yī)證型主要表現(xiàn)為肺腎氣虛證,級(jí)表現(xiàn)以肝腎陰虛為主,少數(shù)為肺腎氣虛、氣陰兩虛證,而級(jí)則主要表現(xiàn)脾腎陽(yáng)虛證,兼有少數(shù)肝腎陰虛、氣陰兩虛。從腎臟損害Katafuchi積分

40、結(jié)果顯示與肺腎氣虛組比較,肝腎陰虛組加重?zé)o明顯意義P0.05,氣陰兩虛組損害較重P0.05,脾腎陽(yáng)虛組損害顯著加重P0.01;與肝腎陰虛組比較,氣陰兩虛組明顯加重P0.05,脾腎陽(yáng)虛組顯著加重P0.01;與氣陰兩虛組比較,脾腎陽(yáng)虛組明顯加重P0.05。討 論DISCUSSION1. 細(xì)胞周期調(diào)控蛋白與IgA腎病1.1系膜細(xì)胞增殖在IgA腎病發(fā)病機(jī)制中的認(rèn)識(shí)IgA是外分泌系統(tǒng)中拮抗病毒或細(xì)菌抗原的主要免疫球蛋白,其功能是防止大量微生物、藥物及環(huán)境抗原對(duì)機(jī)體造成損害。生物學(xué)上IgA可分為IgA1、IgA2兩個(gè)亞型。IgA主要來源于體內(nèi)兩大系統(tǒng):(1)黏膜免疫系統(tǒng),如腸道、唾液腺呼吸道、乳腺、扁桃體

41、,以產(chǎn)生多聚體IgA為主,其中IgA1和IgA2各占50;(2)全身免疫系統(tǒng)包括骨髓、淋巴結(jié)、脾臟等,主要產(chǎn)生單體IgA,其中IgA1占90,IgA2占10,存在于血清中。系膜區(qū)IgA沉積物來自血液循環(huán),并可能以循環(huán)免疫復(fù)合物形式存在。IgA之所以能夠沉積在腎小球系膜區(qū),可能是因?yàn)椋海?)具有某種被系膜細(xì)胞捕捉的理化特性;(2)能與沉積在系膜區(qū)的抗原(食物、病毒和細(xì)菌等)結(jié)合;(3)能與系膜區(qū)內(nèi)源性抗原結(jié)合。另外系膜細(xì)胞本身也積極參與IgA腎病的發(fā)病,除增加對(duì)IgA表面受體的表達(dá)使IgA容易在系膜蓄積外,系膜細(xì)胞合成大量炎性細(xì)胞因子和細(xì)胞表面受體,造成腎小球損傷、炎性變和硬化11。 腎臟固有細(xì)

42、胞的增殖或肥大是許多腎臟疾?。ㄈ缦的ぴ鲋承阅I小球腎炎、IgA腎病、狼瘡性腎炎、糖尿病腎病、高血壓腎病等)發(fā)生和發(fā)展的基礎(chǔ)。當(dāng)這些固有細(xì)胞增殖或肥大時(shí),將引發(fā)細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和氧化劑、蛋白酶等介質(zhì)釋放明顯增加,并形成自分泌損傷,從而導(dǎo)致基底膜損傷和細(xì)胞外基質(zhì)的聚積,最終導(dǎo)致腎小球硬化或小管、間質(zhì)纖維化,腎衰竭。 細(xì)胞增殖是由多個(gè)水平調(diào)節(jié)的,細(xì)胞最終必須進(jìn)入細(xì)胞周期才能增殖。細(xì)胞周期指正常連續(xù)分裂的細(xì)胞從上一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的動(dòng)態(tài)過程,共分為4個(gè)階段:依次分為G1(DNA合成前期)、S(DNA合成期)、G2(DAN合成后期)、M期(有絲分裂期)。細(xì)胞周期中各期時(shí)間相對(duì)固定

43、,只有G1期時(shí)間可以改變,因此G1期時(shí)間的長(zhǎng)短決定細(xì)胞周期時(shí)間的不同,細(xì)胞進(jìn)行增殖是,從靜止期G0期進(jìn)入G1期,通過G1/S檢驗(yàn)點(diǎn),進(jìn)入S期,再通過G2/M檢驗(yàn)點(diǎn),進(jìn)入M期完成有絲分裂。其中G1/S檢驗(yàn)點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵點(diǎn)。細(xì)胞周期的完成則依賴于正、負(fù)調(diào)控蛋白之間的平衡。1.2細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控蛋白p21、p27在增殖性腎病中的作用細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控蛋白即周期素依賴性激酶抑制蛋白(cyclin-dependent kinase inhibitor,CKI)CKIs是一類核內(nèi)小分子蛋白,它們可作用于不同的周期素(cyclin)和周期素依賴性激酶(cell cycle dependent

44、kinase, CDK)組成的復(fù)合物(cyclin/CDK復(fù)合物),根據(jù)其分子量不同對(duì)其命名,并根據(jù)其結(jié)構(gòu)是否同源及底物特異性分為兩個(gè)家族,一個(gè)為INK4(CDK4抑制劑)家族,包括p15、pl6、p18、p19,它們僅作用于cyclinD/CDK4及cyclinD/ CDK6復(fù)合物;另一個(gè)為CIP/KIP家族,包括p21、p27、p57,它們對(duì)G1早期(cyclinD/CDK4及cyclinD/ CDK6)、Gl晚期(cyclinE/CDK2)和S期(cyclinA/CDK2) cyclin/CDK復(fù)合物均有作用。CKIs在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中起著重要作用。一般認(rèn)為,CKI可與cyclin/CDK

45、復(fù)合物結(jié)合,抑制CDK活性,使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(pRb)不能磷酸化,從而抑制轉(zhuǎn)錄因子E2F的釋放,導(dǎo)致進(jìn)人S期所需蛋白合成不足,使細(xì)胞不能通過G1/S調(diào)控點(diǎn)而停留于G1期。CKIs可能通過兩種方式抑制CDKs的活性,一是CKI與CDK結(jié)合破壞或抑制了cyclin與CDK的結(jié)合;二是CKI可通過抑制細(xì)胞周期素激活激酶(CAK)阻止CDK2的第160位蘇氨酸及CDK4的第172位蘇氨酸的磷酸化12。p21是已知的具有最廣泛激酶抑制活性的細(xì)胞周期抑制蛋白,能廣泛抑制G1期、S期cyclin-CDK復(fù)合物的磷酸化激酶活性。主要有兩個(gè)機(jī)制:第一,P21 N末端與周期素-CDK復(fù)合物結(jié)合,使pRb低磷酸

46、化不能釋放細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子E2F,從而使細(xì)胞周期停滯,被認(rèn)為使細(xì)胞周G1/S轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵13。第二,p21的C末端還可與增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)結(jié)合形成p21-PCNA-周期素-CDK,從而使DNA復(fù)制受阻,使細(xì)胞停滯于G1期。p21可通過p53依賴性14 途徑(細(xì)胞DNA受到損傷時(shí),p53表達(dá)增加,啟動(dòng)p21表達(dá),并作為p53的下游中介者執(zhí)行p53的部分功能,導(dǎo)致G1期停滯,使細(xì)胞有時(shí)間對(duì)損傷的DNA進(jìn)行修復(fù),從而維持細(xì)胞遺傳信息的穩(wěn)定性。)和p53非依賴性途徑15(即在各類生長(zhǎng)因子的強(qiáng)刺激下,p21表達(dá)水平上調(diào)。)參與細(xì)胞生物學(xué)行為調(diào)節(jié)。p27是1994年由Polyak等16和Toyoshim

47、a等17發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞周期調(diào)控蛋白,它是廣普的cyclin/ CDK復(fù)合物抑制物,能廣泛抑制G1期、S期的cyclin與CDK結(jié)合。p27的N末端存在CDK結(jié)合位點(diǎn),能結(jié)合并抑制周期素D、E、A和B依賴的酶,p27的C末端無(wú)PCNA結(jié)構(gòu)域,故不能抑制PCNA。在整個(gè)細(xì)胞周期中,p27 mRNA水平是恒定的,其蛋白水平是由翻譯及降解調(diào)控。p27在靜止態(tài)表達(dá)增強(qiáng),說明它是維持細(xì)胞靜止所必需的,細(xì)胞增生時(shí),p27水平降低,p27的表達(dá)與G1維持時(shí)間有關(guān),p27增強(qiáng)時(shí),G1期延長(zhǎng)。此外,p27還與通過G1晚期的限制點(diǎn)有關(guān)。p27反義寡脫氧核苷轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在去除血清(去除生長(zhǎng)因子)后,不出現(xiàn)G1期中止。增

48、殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)為一種細(xì)胞DNA聚合酶的輔助蛋白,其表達(dá)在細(xì)胞增殖中的不同階段是不同的。在靜止期和G1早期幾乎不表達(dá),G1晚期表達(dá)開始增加,在S期達(dá)到高峰,其合成、表達(dá)與細(xì)胞增殖密切相關(guān),是反映細(xì)胞增殖的主要生物學(xué)指標(biāo) 18,19。因此,通過檢測(cè)腎小球內(nèi)PCNA的表達(dá)多少可以反映系膜細(xì)胞增生的程度20。許多動(dòng)物試驗(yàn)研究表明,正常腎小球和靜息系膜細(xì)胞p21不表達(dá)或低水平表達(dá), p21主要存在于系膜細(xì)胞,且p21與細(xì)胞增殖呈正相關(guān),如Lang等4研究發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)因子PDGF可使系膜細(xì)胞的cyclin Dl表達(dá)增加,促進(jìn)細(xì)胞增

49、殖,同時(shí)也使p21表達(dá)增加,而用cyclin Dl的反義寡核苷酸處理則使PDGF誘導(dǎo)的cyclin Dl和p21表達(dá)降低,同時(shí)細(xì)胞增殖明顯受抑。Ma等21制作5/6腎大部切除模型,用過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor- , PPAR-)激動(dòng)劑曲格列酮( troglitazone)干預(yù),可使腎小球細(xì)胞增殖水平較未干預(yù)組降低,同時(shí)有p21mRNA水平的降低,腎小球和腎小管轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-)mRNA也降低。以上提示p21通過對(duì)MC增殖的調(diào)控,影響腎小球腎炎發(fā)病。p27在體外靜息系膜細(xì)胞有高度表達(dá),Shankland2

50、2等以血小板生長(zhǎng)因子(PDGF)和堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)刺激系膜細(xì)胞增殖時(shí),發(fā)現(xiàn)p27水平明顯下降。進(jìn)一步研究觀察到,p27反義寡核苷酸作用于系膜細(xì)胞可加快并增大PDGF刺激體外系膜細(xì)胞的增殖幅度。他們還發(fā)現(xiàn)在Thy1模型中系膜細(xì)胞增生伴有p27水平的下降,在增生的高峰期甚至測(cè)不出p27,然而隨著系膜細(xì)胞增殖的緩解p27水平又逐漸恢復(fù)正常。為明確p27在腎小球細(xì)胞增殖中的作用,Ophascharoensuk23分別在p27(+/+)和p27(-/-)鼠建立實(shí)驗(yàn)性腎小球腎炎模型。研究得出三個(gè)結(jié)論:正常生理情況下,青春期p27(-/-)鼠腎臟p27缺失與DNA合成無(wú)關(guān);腎小球腎炎炎癥期,p

51、27(-/-)鼠腎小球細(xì)胞DNA合成以及增殖較對(duì)照組出現(xiàn)要早;p27(-/-)鼠腎小球細(xì)胞DNA合成量以及增殖程度明顯高于對(duì)照組。為排除p27(-/-)組細(xì)胞增殖為免疫反應(yīng)所造成,作者對(duì)p27(+/+)和p27(-/-)鼠進(jìn)行全面放射線照射,并從正常p27(+/+)鼠移植骨髓。移植后重新檢測(cè)腎炎模型。結(jié)果證實(shí):p27(-/-)鼠細(xì)胞增殖程度仍明顯高于對(duì)照組,細(xì)胞對(duì)損傷的增殖反應(yīng)由p27水平?jīng)Q定而不是由免疫反應(yīng)引起。通過以上動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,負(fù)周期調(diào)控蛋白表達(dá)水平在增殖性腎炎中起著重要的作用。1.3腎組織中p21、p27及PCNA表達(dá)水平變化在IgA腎病中的作用本研究表1,表2結(jié)果顯示:與正常對(duì)

52、照組比較,、級(jí)p21、p27、PCNA表達(dá)水平變化均有顯著性差異,P0.01;p27的表達(dá)從,顯著降低,p21、PCNA的表達(dá)水平從,明顯增高。p21與PCNA呈中度正相關(guān)(r=0.603, P0.01);p27與PCNA呈低度負(fù)相關(guān)(r=-0.264,P0.05)。本研究結(jié)果顯示,在正常組織系膜細(xì)胞中p27呈較高表達(dá),PCNA呈非常低表達(dá),p21不表達(dá),有的呈低表達(dá),在正常組織中,負(fù)周期調(diào)控蛋白p27表達(dá)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),在p27的控制下,僅有少量細(xì)胞可以通過細(xì)胞周期,完成分裂增殖,同正常細(xì)胞的凋亡相平衡,維持著系膜細(xì)胞的穩(wěn)定。IgA腎病患者存在著自身免疫功能的紊亂或低下,血液循環(huán)中IgA和IgA

53、免疫復(fù)合物(IgA-IC)增加,易造成其在腎小球系膜區(qū)的沉積,從免疫組織學(xué)檢查來看,幾乎所有系膜IgA沉積物均伴有C3沉積。這種沉積可激活炎癥介質(zhì),在炎癥介質(zhì)的刺激下,p27的表達(dá)降低,周期素(cyclin)和周期素依賴性激酶(CDK)表達(dá)增加,細(xì)胞開始增殖,增殖細(xì)胞核抗原PCNA開始表達(dá)。同時(shí)炎癥因子的強(qiáng)刺激可以使另一周期素依賴性激酶抑制劑 p21逐漸表達(dá),或者由于細(xì)胞DNA受到損傷,具有監(jiān)視基因組完整性的p53基因(即野生型p53)活化,引起其下游效應(yīng)基因p21的轉(zhuǎn)錄,p21表達(dá)增加,通過兩種形式阻滯細(xì)胞周期,即p21-cyclin/CDK、p21-PCNA-周期素-CDK,使pRb低磷酸

54、化不能釋放細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子E2F,從而使細(xì)胞周期停滯在G1期。由于刺激因素持續(xù)存在,cyclin/CDK表達(dá)占優(yōu)勢(shì),細(xì)胞增殖旺盛,在p21的表達(dá)影響下,系膜細(xì)胞的增殖受到一定限制,不至于象腫瘤組織那樣異常的增生。趙景宏等24以IL-1為刺激因素,其刺激大鼠系膜細(xì)胞增生的作用在24小時(shí)達(dá)到高峰,在IL-1作用的高峰時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞周期中有G0/G1期進(jìn)入S期的細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組顯著增加,CDK2表達(dá)明顯增加,而同時(shí)p27的表達(dá)則下降。易著文等25研究表明腎病大鼠模型中固有細(xì)胞p21、cyclinD1、PCNA的表達(dá)明顯增高,p27的表達(dá)水平顯著下降,提示腎病大鼠存在細(xì)胞周期調(diào)控蛋白表達(dá)紊亂及細(xì)胞增生。這與本研

55、究結(jié)果一致。本研究通過觀察負(fù)周期調(diào)控蛋白p21、p27及PCNA的表達(dá)變化,表明負(fù)周期調(diào)控蛋白與系膜細(xì)胞的增殖程度密切相關(guān), PCNA表達(dá)的多少可以直接反應(yīng)系膜細(xì)胞的增生程度,在炎癥刺激下p27的表達(dá)下降,細(xì)胞明顯增生,同時(shí)又可促進(jìn)p21的表達(dá)進(jìn)一步抑制增生;p27的表達(dá)與系膜細(xì)胞增殖程度(PCNA的表達(dá)水平)呈正相關(guān),p21的表達(dá)與系膜細(xì)胞增殖程度呈負(fù)相關(guān)。 2 IgA腎病中p21、p27、PCNA表達(dá)水平變化與中醫(yī)證型的關(guān)系2.1中醫(yī)學(xué)對(duì)IgA腎病發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)祖國(guó)醫(yī)學(xué)中無(wú)“IgA腎病”一名,但根據(jù)其臨床癥狀,本病屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)的“尿血”、“尿濁”、“腰痛”、“水腫”、“虛勞”等范疇。IgA

56、腎病有反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn),在發(fā)作前多感受風(fēng)熱外邪(上呼吸道感染)或濕熱毒邪(腸道感染)。風(fēng)熱之邪從外而侵,首襲肺臟,母病及子,邪熱入腎;或濕熱之邪內(nèi)侵,流注下焦,內(nèi)舍于腎,熱灼血絡(luò),血溢脈外,產(chǎn)生血尿諸癥;病久腎陰不足,陰虛火旺,灼傷絡(luò)脈,或脾失統(tǒng)攝,血不歸經(jīng),可見血尿。腎主封藏,脾主統(tǒng)攝,脾腎不足,精微下泄,可見蛋白尿。脾腎陽(yáng)虛,氣不化水,水濕泛溢,則為水腫。久病不愈,氣血陰陽(yáng)不足,或陽(yáng)虛寒凝,或氣虛不運(yùn),或虛火煉液,均可導(dǎo)致瘀血內(nèi)停,水濕內(nèi)蓄。聶莉芳26主張分主因與誘因,主因多系脾腎虛損,正氣耗傷,機(jī)體免疫功能失調(diào);誘因責(zé)之外邪與過勞,以致血尿反復(fù)發(fā)作。楊瑞龍27認(rèn)為風(fēng)熱邪毒或濕熱邪毒是本病的發(fā)病原因,邪熱耗氣傷陰,又可致氣虛、陽(yáng)虛、陰虛、氣陰兩虛及瘀熱內(nèi)停。該病的主要病位在于肺、脾、腎三臟,從整個(gè)病程來看是先有肺腎氣虛、衛(wèi)外不固、濕熱毒邪入侵或五勞內(nèi)傷引起人體免疫功能失調(diào)(氣虛),而后邪戀傷氣、傷陰,而致陰虛

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