丹參對(duì)持續(xù)癲癇幼鼠腦損傷后血清NSE影響的實(shí)驗(yàn)研究(一)

1、丹參對(duì)持續(xù)癲癇幼鼠腦損傷后血清 NSE影響的實(shí)驗(yàn)研究(一)    【關(guān)鍵詞】 丹參；,驚厥性腦損傷；,神經(jīng)元特異性烯醇化酶摘要：目的探討丹參對(duì)持續(xù)癲癇幼鼠腦神經(jīng)元損傷可能具有的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法美解眠誘發(fā)健康幼齡大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作。隨機(jī)分組后分批處死。電鏡觀察海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的改變，ELISA法測(cè)定血清 NSE（神經(jīng)元特異性烯醇化酶）濃度變化。結(jié)果丹參治療組幼鼠電鏡下可見(jiàn)海馬神經(jīng)元較輕的超微結(jié)構(gòu)病變和血清NSE濃度在發(fā)作后相同時(shí)點(diǎn)均低于持續(xù)癲癇組。結(jié)論丹參對(duì)持續(xù)癲癇幼鼠腦神經(jīng)元損傷具有一定的保護(hù)作用；血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶與持續(xù)癲癇幼鼠神經(jīng)元損

2、傷變化趨勢(shì)基本一致，能作為判斷腦神經(jīng)元損傷及其恢復(fù)的有效指標(biāo)。 關(guān)鍵詞：丹參； 驚厥性腦損傷； 神經(jīng)元特異性烯醇化酶Protective Effect of Salvia miltiorrhiza Bge Against Seizure-induced Brain Injury in Young RatsAbstract：ObjectiveTo eva luate the protective effect and mechanism of Salvia miltiorrhiza Bge(SMB) against seizure-induced cerebral neuron injury o

3、f premature rats.MethodsMegimide (20mg/kg) was injected into healthy infant rats(21d) to evoke status epilepticus(SE).The ultrastructure changes of the hippocampus neurons were observed under the electronic microscope.At the same time points,the level of neuron speertic enolale NSE in rat sera was t

4、ested with ELISA.ResultsThe hippocampus neurons of SE group rats,the mitochondria volume decreased,the matrix condensed,the ridge obscured or disappeared.Compared with the SE group, there was a significant improvement in nutron injury in SMB group.The SE group rats in the 72 h after seizures had a h

5、igh level of NSE in sera.But the SMB group was lower.ConclusionSalvia miltiorrhiza Bge has a positive effect on the seizure-induced brain neuron injury of premature rats.The serum NSE may be an effective marker used to tell the existence of neuron injury and point out the recovery.Key words：Salvia m

6、iltiorrhiza Bge; Brain neuron injuries; Neuron specific enolase癲癇為小兒時(shí)期常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，長(zhǎng)期的臨床觀察和流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，小兒更易發(fā)生癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus,SE）1。大量研究證實(shí)，癲癇發(fā)作尤其是癲癇持續(xù)狀態(tài)，不僅可引起暫時(shí)性腦功能障礙，且可致嚴(yán)重的器質(zhì)性腦損傷，進(jìn)而引起學(xué)習(xí)、記憶及行為異常等嚴(yán)重后果。如何在癲癇發(fā)作后采取有效措施防治腦損傷已成為小兒神經(jīng)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)課題。本課題旨在探討丹參對(duì)癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作誘發(fā)的發(fā)育期幼鼠腦損傷是否具有保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制，為臨床探索一種有效途徑來(lái)防治驚

7、厥性腦損傷提供理論依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 動(dòng)物新生20 d清潔級(jí) SD大鼠48只，雌雄各半，體重5470 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.1.2 藥品和試劑、實(shí)驗(yàn)儀器美解眠針（50 mg/20 ml，上海第二軍醫(yī)大學(xué)朝暉制藥廠，批號(hào)：021102）；丹參注射液（2 ml /支，上海中西藥業(yè)有限公司新岡制藥廠，每支相當(dāng)于含原生藥0.15 g，批號(hào)：020909）；神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）ELISA試劑盒（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，批號(hào)：00612）；恒溫水浴箱（上海器械七廠）、酶聯(lián)儀（BJ600板式酶聯(lián)儀）。1.2 動(dòng)物1.2.1 動(dòng)物模型制備及給藥方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物混合喂

8、養(yǎng)1 d后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、持續(xù)癲癇組（SE組）和丹參治療組（SMB組），每組各16只。其中 SE組和丹參治療組按20 mg/kg經(jīng)背部皮下及腹腔注射2，若15 min內(nèi)無(wú)驚厥發(fā)作，再按0.252.5 mg/次追加美解眠，至1 h內(nèi)出現(xiàn)全身性驚厥大發(fā)作。正常對(duì)照組按同樣方法注射等量生理鹽水。按 Simialowski 6級(jí)評(píng)定法3評(píng)定驚厥發(fā)作，驚厥發(fā)作終止后30 min，丹參治療組即刻按(3.5 ml/kg)，各組動(dòng)物混合飼養(yǎng)，每日測(cè)量體重調(diào)整注射劑量，直至不同時(shí)間（驚厥后72 h，7 d）隨機(jī)分批處死。1.2.2 血清標(biāo)本及腦組織取材方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用10%水合氯醛按400 mg/kg行腹腔

9、注射麻醉，自左心室采血約2 ml。立即置入干燥試管中，靜置約1 h，3 200 r/min，離心10 min，取上清液，-20分裝凍存（注意不能溶血，所有溶血標(biāo)本均應(yīng)棄之。取血后行內(nèi)灌注固定，迅速取出腦組織置于-4冰箱保存）。1.2.3 觀察指標(biāo)海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)觀察：取1 mm×1 mm×1 mm大小海馬組織，修剪均勻，常規(guī)電鏡標(biāo)本制備，超薄片，鈾鉛染色，透射電鏡觀察神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化。NES濃度：每組各時(shí)點(diǎn)隨機(jī)取5只實(shí)驗(yàn)鼠血清作 NSE-ELISA測(cè)定。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有定量指標(biāo)均采取±s來(lái)表示。應(yīng)用 SAS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。設(shè)雙側(cè) a=0

10、.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。2 結(jié)果2.1 海馬電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察正常對(duì)照組幼鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞規(guī)則，基質(zhì)均勻，線粒體呈橢圓形，大小正常，嵴規(guī)則，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)清楚，核膜平滑，核呈圓形，常染色質(zhì)分布均勻，核仁不明顯。持續(xù)癲癇發(fā)作后72 h，SE組可見(jiàn)以海馬 CA3區(qū)為主的神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)病變，主要表現(xiàn)為線粒體體積縮小，部分出現(xiàn)空泡，基質(zhì)濃縮，嵴模糊不清或消失，高爾基復(fù)合體輕至中度擴(kuò)張，丹參治療組海馬 CA3區(qū)為主的神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)病變明顯輕于 SE組，表現(xiàn)為線粒體體積縮小，但基質(zhì)、嵴均較清楚，高爾基復(fù)合體輕度擴(kuò)張，而其他腦區(qū)未見(jiàn)類似神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)病變。持續(xù)癲癇發(fā)作后7 d，SE組幼鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷稍

11、有所緩解，而丹參治療組神經(jīng)元損傷有較好程度的修復(fù)。2.2 血清神經(jīng)元烯醇化酶濃度變化持續(xù)癲癇發(fā)作后72 h，SE組血清NSE濃度明顯增高，與正常對(duì)照組及丹參治療組相比有顯著差異，在發(fā)作后7 d其濃度雖有所降低，但與其他兩組相比無(wú)明顯差異。然而，SE組在發(fā)作后72 h與7 d時(shí)的血清 NSE濃度變化有差異，說(shuō)明血清 NSE濃度在腦神經(jīng)元損傷發(fā)生的同時(shí)升高，且隨著腦損傷發(fā)生后的時(shí)間延長(zhǎng)而存在一個(gè)降低趨勢(shì)；丹參治療組在發(fā)作后72 h血清 NSE濃度明顯低于 SE組，從分子水平說(shuō)明了丹參對(duì)腦損傷具有一定的保護(hù)作用。3 討論作為一種醫(yī)學(xué)和神經(jīng)?？频墓餐卑Y，SE造成腦損傷后，相對(duì)高的致障率和死亡率不容忽

12、視，積極采取有效措施來(lái)防治癲癇持續(xù)狀態(tài)后腦損傷有著重要的臨床指導(dǎo)意義。神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，特異性存在于神經(jīng)元和神經(jīng)外胚層組織，正常體液中含量甚微，腦損傷時(shí)神經(jīng)細(xì)胞崩解，血腦屏障破壞，該酶進(jìn)入腦脊液和血液中而致含量明顯增高，是神經(jīng)元損傷的特異活體生物學(xué)標(biāo)志35。然而，由于研究手段的局限性，臨床很難開(kāi)展神經(jīng)元特異性烯醇化酶升高水平與神經(jīng)元損傷的嚴(yán)重程度、損傷修復(fù)間關(guān)系的研究。本研究可見(jiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作組幼鼠發(fā)作72 h即有明顯血清 NSE升高，與正常對(duì)照組比較有顯著差異。不僅與該組大鼠腦組織神經(jīng)元損傷的發(fā)生發(fā)展規(guī)律相一致，也與 Degiorgio對(duì)19例 SE患者血

13、清 NSE臨床研究完全吻合4，進(jìn)一步支持本文前述有關(guān)腦神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)病變的動(dòng)態(tài)結(jié)果。表1 各組實(shí)驗(yàn)鼠血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶濃度變化（略）同一時(shí)點(diǎn)不同組間比較，vs control *P0.01,vs治療組P0.01；同一組不同時(shí)點(diǎn)間比較，P0.01丹參有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩之功效。近期研究表明在缺氧條件下培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元經(jīng)過(guò)丹參處理后其存活率明顯增高，且伴有熱休克蛋白 HSP70的高表達(dá)，提示丹參具有直接的抗氧性神經(jīng)保護(hù)作用6；最新研究7，8表明丹參能降低腦內(nèi)單胺類，肽類等介質(zhì)代謝紊亂，減輕腦水腫，部分抑制 cfos等基因的表達(dá)，降低腦缺氧缺血?jiǎng)游锏闹職埪屎退劳雎?；證實(shí)本實(shí)驗(yàn)研究丹參

14、治療組立SE發(fā)作后腦損傷程度能通過(guò)改善 ATP酶功能，抑制 Ca2+聚集而減輕腦損傷程度。較 SE組明顯減輕，與此同時(shí)，尚可見(jiàn)血清 NSE水平的明顯降低，與SE組相比在 SE發(fā)作后7 h有顯著差異，提示 NSE可能成為臨床觀察和判斷驚厥后腦神經(jīng)元損傷及修復(fù)的特異性生化指標(biāo)。然而，SE組沒(méi)有腦神經(jīng)元損傷的修復(fù)，血清NES卻出現(xiàn)相應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化，說(shuō)明血清 NSE濃度可能僅在腦損傷發(fā)生的早期階段作為判斷損傷修復(fù)的指標(biāo)。此前研究證實(shí)丹參能改善新生兒缺氧腦損傷造成的遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙，是否丹參對(duì)持續(xù)癲癇誘發(fā)所致的腦損傷具有遠(yuǎn)期保護(hù)作用尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。盡管如此，丹參對(duì)持續(xù)癲癇誘發(fā)所致的腦損傷所具有的部分保

15、護(hù)作用無(wú)疑將給小兒神經(jīng)領(lǐng)域帶來(lái)新的希望，針對(duì)癲癇發(fā)作引起腦神經(jīng)元損傷的更有效的個(gè)性化防治措施必然會(huì)露出端倪。參考文獻(xiàn)：1 Holmes GL,Ben-Ari Y.Seizures in the developing brain:perhaps not so benign after all.J.Neuron ,1998,21:1.2 蔣 莉，蔡方成，李 欣，等.驚厥持續(xù)狀態(tài)中大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元死亡的年齡特征J.中華兒科雜志，40（9）：545.3 Degiorgio CM,Correale JP,Gott PS ,et al .Serum neuron -specific enolase in h

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