4 生物大分子相互作用分析技術(shù)(基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù))

1、第六章第六章 生物大分子相互作用生物大分子相互作用 分析技術(shù)分析技術(shù)劉劉 蕓蕓 第一節(jié)第一節(jié) 生物大分子相互作用分析的意義生物大分子相互作用分析的意義 第二節(jié)第二節(jié) 常見(jiàn)的生物大分子相互作用分析方法常見(jiàn)的生物大分子相互作用分析方法 第三節(jié)第三節(jié) 生物大分子相互作用分析新進(jìn)展生物大分子相互作用分析新進(jìn)展（FRET、SPR）l真核生物細(xì)胞真核生物細(xì)胞 l原核生物細(xì)胞原核生物細(xì)胞 細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞結(jié)構(gòu) cell原核生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)原核生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)肽聚糖肽聚糖被膜被膜質(zhì)膜質(zhì)膜動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞植物細(xì)胞植物細(xì)胞細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核真核生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)真核生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞中的大分

2、子細(xì)胞中的大分子 Macromolecules in CellsThe approximate composition of a bacterial cell.分子水平DNAsequenceProteins Structure Function?All Cell 第一節(jié)第一節(jié) 生物大分子相互作用分析的意義生物大分子相互作用分析的意義DNAPrimary transcriptmRNAmRNAInactivemRNAproteinnucleuscytoplasmTranscriptionalcontrolPost-transcriptionalcontrolmRNA degradationcont

3、roltranslationcontrolactiveproteinPost-translationcontrol基因表達(dá)的調(diào)控層次基因表達(dá)的調(diào)控層次Protein complexSignaling net work生命機(jī)制生命機(jī)制蛋白質(zhì)組學(xué)的分類(lèi)蛋白質(zhì)組學(xué)的分類(lèi)? 表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)Quantitative study of protein expression between samples that differ by some variable? 結(jié)構(gòu)基因組學(xué)結(jié)構(gòu)基因組學(xué)Goal is to map out the 3-D structure of proteins and

4、protein complexes? 功能蛋白質(zhì)組學(xué)功能蛋白質(zhì)組學(xué)To study protein-protein interaction, 3-D structures, cellular localization and PTMs in order to understand the physiological function of the whole set of proteome.l蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和序列特點(diǎn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和序列特點(diǎn)l蛋白質(zhì)進(jìn)化過(guò)程和保守序列蛋白質(zhì)進(jìn)化過(guò)程和保守序列l(wèi)蛋白質(zhì)表達(dá)譜蛋白質(zhì)表達(dá)譜l蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位及其相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞器或蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位及其相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞器或結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)l

5、蛋白質(zhì)翻譯后修飾情況蛋白質(zhì)翻譯后修飾情況l了解與其相關(guān)聯(lián)的其他細(xì)胞蛋白質(zhì)了解與其相關(guān)聯(lián)的其他細(xì)胞蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)信息的不同層次蛋白質(zhì)信息的不同層次v 蛋白質(zhì)同源二聚體蛋白質(zhì)同源二聚體(homodimer)v 蛋白質(zhì)異源二聚體蛋白質(zhì)異源二聚體(heterodimer)v 蛋白質(zhì)多聚體蛋白質(zhì)多聚體(polymer)v 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物復(fù)合物(protein-DNA complex)v 蛋白質(zhì)-脂質(zhì)復(fù)合物(protein-lipid complex)v 蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物(protein-RNA complex)v DNA-DNA復(fù)合物(DNA-DNA complex)v 生物大分子復(fù)合物的

6、類(lèi)型生物大分子復(fù)合物的類(lèi)型第二節(jié)第二節(jié) 生物大分子相互作用分析技術(shù)生物大分子相互作用分析技術(shù) 1. 研究思路研究思路2. 分類(lèi)分類(lèi)3. 技術(shù)介紹技術(shù)介紹生物大分子相互作用分析研究思路生物大分子相互作用分析研究思路鑒定與目標(biāo)分子相鑒定與目標(biāo)分子相互作用的所有可能互作用的所有可能大分子大分子詳細(xì)描述其生物功能詳細(xì)描述其生物功能及相互作用對(duì)其功能及相互作用對(duì)其功能的影響的影響鑒定出相互作用且在生理鑒定出相互作用且在生理狀態(tài)下得到了驗(yàn)證和合理狀態(tài)下得到了驗(yàn)證和合理的解釋的解釋v GST 融合蛋白技術(shù)融合蛋白技術(shù)(GST pull-down)v 免疫共沉淀免疫共沉淀(Immunoprecipitatio

7、n, Co-IP )v 串聯(lián)親和純化串聯(lián)親和純化(Tandem Affinity Purification，TAP)v 酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast two-hybrid)v 噬菌體展示噬菌體展示(Phage display)v 細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)共定位細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)共定位(Co-localization)v 熒光共振能量轉(zhuǎn)移熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)v 表面等離子共振表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)v 生物大分子相互作用分析技術(shù)生物大分子相互作用分析技術(shù)1.GST融

8、合蛋白技術(shù)融合蛋白技術(shù) （GST pull-down assay）基于重組蛋白表達(dá)純化技術(shù)的體外分析系統(tǒng)基本原理：基本原理：是將靶蛋白是將靶蛋白-GST融合蛋融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹(shù)脂上白親和固化在谷胱甘肽親和樹(shù)脂上,作為作為與目的蛋白親和的支撐物與目的蛋白親和的支撐物,充當(dāng)一種充當(dāng)一種“誘誘餌蛋白餌蛋白”,目的蛋白溶液過(guò)柱目的蛋白溶液過(guò)柱,可從中捕獲可從中捕獲與之相互作用的與之相互作用的“捕獲蛋白捕獲蛋白”(目的蛋白目的蛋白),洗脫結(jié)合物后通過(guò)洗脫結(jié)合物后通過(guò)SDS-PAGE電泳分析電泳分析,從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用或篩選從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白相應(yīng)的目的

9、蛋白,“誘餌蛋白誘餌蛋白”和和“捕獲蛋捕獲蛋白白”均可通過(guò)細(xì)胞裂解物、純化的蛋白、均可通過(guò)細(xì)胞裂解物、純化的蛋白、表達(dá)系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法表達(dá)系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。獲得。 GST pull-down assayPurification of proteinGlutathione columnGlutathione beadGST fusion proteinTags Pull-Down 方法的組成方法的組成RtagbaitpreyResinBaitPreyTags （GST, His, Flag, HA, MBP）RPull-down experimentRWashRR

10、Add preyWashElutionAnalysisBaitPreyControlsRAdd preyWashRRElutionAnalysis S CSDS-PAGE gel實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路GSTXY谷胱甘肽谷胱甘肽-瓊脂糖微珠瓊脂糖微珠細(xì)胞裂解物細(xì)胞裂解物 tube4下孵育下孵育2h2h GST融合蛋白融合蛋白GSTXY+實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程GST pull-down 應(yīng)用應(yīng)用l鑒定未知相互作用的蛋白l鑒定預(yù)測(cè)的或已知的相互作用GST pull down驗(yàn)證兩種已知蛋白質(zhì)驗(yàn)證兩種已知蛋白質(zhì)（X-Y）的相互作用）的相互作用舉舉 例例inputGSTY-GFP + + +X-GSTY-G

11、FP105kDAnti-GFPX-GFP + + +GSTinputAnti-GFPY-GSTX-GFP2. 免疫共沉淀免疫共沉淀（ immunoprecipitation，Co-IP ）非常有效地用于鑒定細(xì)胞內(nèi)生理上的蛋白質(zhì)相互作用的分析技術(shù) 免疫共沉淀（免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：）：是以是以抗體和抗原之間的專(zhuān)一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白抗體和抗原之間的專(zhuān)一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。 基本原理基本原理：當(dāng)細(xì)胞

12、在當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下非變性條件下被裂解時(shí)，完整被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀的抗體免疫沉淀X，那么與，那么與X在在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。也能沉淀下來(lái)。GagaroseGagaroseXYGagarose實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程SDS-PAGEProtein A/GSepharose誘餌誘餌蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)抗體抗體離心離心誘餌誘餌蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)Protein A/GSepharose離心離心傳統(tǒng)方法傳統(tǒng)方法交聯(lián)方法交聯(lián)方法基礎(chǔ)：

13、基礎(chǔ)：細(xì)胞在非變性條件下裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)許多蛋細(xì)胞在非變性條件下裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)之間的結(jié)合保持下來(lái)。白質(zhì)之間的結(jié)合保持下來(lái)。要求要求：在一系列操作過(guò)程中保持蛋白質(zhì)復(fù)合體不變?cè)谝幌盗胁僮鬟^(guò)程中保持蛋白質(zhì)復(fù)合體不變?nèi)秉c(diǎn)缺點(diǎn)：可能檢測(cè)不到細(xì)胞內(nèi)處于動(dòng)態(tài)平衡中的低親和與可能檢測(cè)不到細(xì)胞內(nèi)處于動(dòng)態(tài)平衡中的低親和與瞬間的相互作用瞬間的相互作用,存在著免疫球蛋白的污染，需要培養(yǎng)大存在著免疫球蛋白的污染，需要培養(yǎng)大量的細(xì)胞量的細(xì)胞局限：局限：僅應(yīng)用于從細(xì)胞中溶解出來(lái)仍存在于生理復(fù)合物僅應(yīng)用于從細(xì)胞中溶解出來(lái)仍存在于生理復(fù)合物中的蛋白質(zhì)中的蛋白質(zhì)Co-IP 應(yīng)用應(yīng)用l鑒定已知蛋白質(zhì)相互作用的檢測(cè)l

14、鑒定新蛋白質(zhì)間的相互作用免疫共沉淀驗(yàn)證兩種已知蛋白質(zhì)的免疫共沉淀驗(yàn)證兩種已知蛋白質(zhì)的相互作用相互作用Y-GFPY-GFP+X-HAIP: HA control IgGAnti-GFPAnti-GFPAnti-HAY-GFPinput舉 例3.串聯(lián)親和純化串聯(lián)親和純化（Tandem Affinity Purification，TAP）a. One-step affinity purificationb. Two-step affinity purification (tandem affinity purification)Affinity purification (immunopurific

15、ation)融合了標(biāo)準(zhǔn)生化純化和免疫共沉淀策略的極為有效的快速純化蛋白質(zhì)復(fù)合物的方法串聯(lián)親和純化技術(shù)的優(yōu)勢(shì)串聯(lián)親和純化技術(shù)的優(yōu)勢(shì)C與傳統(tǒng)的生化純化方法相比與傳統(tǒng)的生化純化方法相比C與免疫共沉淀方法相比與免疫共沉淀方法相比使用恒定的標(biāo)簽和標(biāo)準(zhǔn)純化條件避免了每次都要設(shè)計(jì)新純化使用恒定的標(biāo)簽和標(biāo)準(zhǔn)純化條件避免了每次都要設(shè)計(jì)新純化方案的問(wèn)題方案的問(wèn)題多步驟純化降低了細(xì)胞高豐度蛋白質(zhì)以及免疫球蛋白的背景多步驟純化降低了細(xì)胞高豐度蛋白質(zhì)以及免疫球蛋白的背景污染污染雙親和標(biāo)簽：雙親和標(biāo)簽：l ProAProA（葡萄球菌蛋白（葡萄球菌蛋白A A 的兩個(gè)免疫球蛋白的兩個(gè)免疫球蛋白IgGIgG結(jié)結(jié)合單位）合單位）

16、l CBPCBP（鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽）（鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程鈣調(diào)素鈣調(diào)素結(jié)合肽結(jié)合肽TEV酶切酶切位點(diǎn)位點(diǎn)在在Ca2+ 離子下結(jié)合離子下結(jié)合TEV 酶切酶切用用EGTA 洗脫洗脫靶蛋白結(jié)合于靶蛋白結(jié)合于IgG珠子珠子充分洗滌后，在充分洗滌后，在TEV蛋白酶作蛋白酶作用下洗脫結(jié)合物用下洗脫結(jié)合物鈣離子存在下，將首次洗脫物鈣離子存在下，將首次洗脫物中的蛋白質(zhì)結(jié)合于鈣調(diào)蛋白包中的蛋白質(zhì)結(jié)合于鈣調(diào)蛋白包被的珠子上被的珠子上充分洗滌后，加入充分洗滌后，加入EGTA洗洗脫結(jié)合物脫結(jié)合物4. 酵母雙雜交酵母雙雜交（ yeast two-hybrid system ）基于在轉(zhuǎn)錄

17、水平上的直接在酵母細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用的遺傳學(xué)方法基本原理：基本原理： 基于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程的認(rèn)識(shí)?；趯?duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程的認(rèn)識(shí)。 前者可識(shí)別前者可識(shí)別DNA上的特異序列，上的特異序列， 并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游，節(jié)的基因的上游， 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用，用， 啟動(dòng)它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。二個(gè)結(jié)構(gòu)域不但可在其連接區(qū)適二個(gè)結(jié)構(gòu)域不但可在其連接區(qū)適當(dāng)部位打開(kāi)，當(dāng)部位打開(kāi)， 仍具有各自的功能。仍具有各自的功能。而且不同兩結(jié)構(gòu)域可重建發(fā)揮轉(zhuǎn)而且不同

18、兩結(jié)構(gòu)域可重建發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。酵母雙雜交系統(tǒng)利錄激活作用。酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過(guò)激活報(bào)道基因的用雜交基因通過(guò)激活報(bào)道基因的表達(dá)探測(cè)蛋白蛋白的相互作用。表達(dá)探測(cè)蛋白蛋白的相互作用。 典型的真核生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子，典型的真核生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子， 如如GAL4都含有二個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：都含有二個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-binding domain，BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（transcription-activating domain，AD）。）。酵母雙雜交酵母雙雜交（ yeast two-hybrid system ）三個(gè)基本組成部分三個(gè)基本組成部分1. 表

19、達(dá)誘餌蛋白的載體表達(dá)誘餌蛋白的載體，誘餌即我誘餌即我們感興趣的蛋白，它和們感興趣的蛋白，它和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合。域融合。2. 表達(dá)靶蛋白的載體表達(dá)靶蛋白的載體，靶蛋白可以是靶蛋白可以是一個(gè)已知的蛋白，也可以是一個(gè)已知的蛋白，也可以是cDNA或或基因組文庫(kù)編碼的蛋白。靶蛋白和轉(zhuǎn)基因組文庫(kù)編碼的蛋白。靶蛋白和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合。錄激活結(jié)構(gòu)域融合。3. 一個(gè)或多個(gè)報(bào)告基因一個(gè)或多個(gè)報(bào)告基因（如控制氨基如控制氨基酸合成的基因、大腸桿菌的酸合成的基因、大腸桿菌的lacZ基因基因等），位于等），位于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域識(shí)別的調(diào)結(jié)合結(jié)構(gòu)域識(shí)別的調(diào)控區(qū)的下游。控區(qū)的下游。 ADDBDgene+repor

20、terMeasurableproduct+DBDbaitADpreyDBDAD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路Target:未知蛋白或未知蛋白或?qū)⒀芯繉?duì)象研究對(duì)象+ DNA binding domainBait:已知蛋白已知蛋白+ activation domainTarget 與與Bait可互換可互換轉(zhuǎn)入同一個(gè)酵母菌中轉(zhuǎn)入同一個(gè)酵母菌中Construct target plasmid and bait plasmidTransformationScreeningDNA extractionDNA sequencingYeast Two-Hybrid Assaynucleushis- leu- tr

21、p-MeasurableproductDBDbaittrpADfishleureporterDBDADhisHISlacZ優(yōu)勢(shì)：優(yōu)勢(shì)：酵母雙雜交方法的優(yōu)勢(shì)及缺陷酵母雙雜交方法的優(yōu)勢(shì)及缺陷C 采用酵母菌株采用酵母菌株C 敏感度高敏感度高C 蛋白折疊蛋白折疊C 易于篩選易于篩選C 應(yīng)用范圍廣應(yīng)用范圍廣缺陷：缺陷：I 核內(nèi)作用核內(nèi)作用I 假陽(yáng)性假陽(yáng)性I 假陰性假陰性I 轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率酵母雙雜交方法的應(yīng)用酵母雙雜交方法的應(yīng)用l高靈敏度地檢測(cè)蛋白蛋白的相互作用 l確定蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域或重要活性位點(diǎn) l尋找與靶蛋白相互作用的新蛋白 l尋找具有藥物治療作用的小分子肽 l尋找控制蛋白相互作用的化合物 l蛋白

22、相互作用圖譜的繪制舉舉 例例酵母雙雜交前準(zhǔn)備工作酵母雙雜交前準(zhǔn)備工作雙酶切驗(yàn)證雙酶切驗(yàn)證21kb5kb3.5kb2kb1.5kb M 1 M:marker1:pGBKT7-BD-X構(gòu)建誘餌質(zhì)粒構(gòu)建誘餌質(zhì)粒誘餌蛋白的表達(dá)誘餌蛋白的表達(dá)X-BDGal4-BD檢測(cè)誘餌蛋白是否有毒性檢測(cè)誘餌蛋白是否有毒性1 2 3Western blot1.Yeast2.BD-yeast3.X-BD-yeast酵母生長(zhǎng)曲線酵母生長(zhǎng)曲線1.未轉(zhuǎn)化酵母未轉(zhuǎn)化酵母2.BD-酵母酵母3.X-BD-酵母酵母酵母雙雜交結(jié)果酵母雙雜交結(jié)果SD/-Trp/-Leu-Trp/-Leu/-His/-Ade +3-AT （20mM）舉舉

23、例例SD/-Trp/-LeuGal4-BD+Y-ADX-BD+Y-ADGal4-BD+Gal4-ADX-BD+Gal4-AD X-半乳糖苷酶藍(lán)白斑顯色分析半乳糖苷酶藍(lán)白斑顯色分析舉舉 例例X-BD+Y-ADX-BD+gal4-ADGal4-BD+Y-ADgal4-BD+gal4-AD酵母雙雜交測(cè)序結(jié)果酵母雙雜交測(cè)序結(jié)果酵母雙雜交得到的陽(yáng)性克隆子質(zhì)粒經(jīng)過(guò)酵母雙雜交得到的陽(yáng)性克隆子質(zhì)粒經(jīng)過(guò)DNA測(cè)序，由測(cè)序，由NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST檢索檢索cDNA編碼的蛋白質(zhì)編碼的蛋白質(zhì)舉舉 例例5.噬菌體展示技術(shù)噬菌體展示技術(shù)（Phage display）基于將某個(gè)蛋白與其遺傳信息之間直接聯(lián)系的篩選

24、方法 噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白或多肽的或多肽的DNA序列插入到噬菌體外序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)，源基因隨外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)，同時(shí)，外源蛋白隨噬菌體的重新組同時(shí)，外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術(shù)。裝而展示到噬菌體表面的生物技術(shù)。到目前為止，人們已開(kāi)發(fā)出了單鏈到目前為止，人們已開(kāi)發(fā)出了單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、噬菌體展噬菌體展示系統(tǒng)、示系統(tǒng)、T4噬菌體展示系統(tǒng)等數(shù)種噬菌體展示系統(tǒng)等數(shù)種噬菌體展示系統(tǒng)。噬菌體展示系統(tǒng)。 特特 點(diǎn)點(diǎn) 該技術(shù)的主要特點(diǎn)是

25、將特定分子的該技術(shù)的主要特點(diǎn)是將特定分子的基因型基因型和和表型表型統(tǒng)一統(tǒng)一在同一病毒顆粒內(nèi)，即在噬菌體表面展示特定蛋白質(zhì)，而在同一病毒顆粒內(nèi)，即在噬菌體表面展示特定蛋白質(zhì)，而在噬菌體核心在噬菌體核心DNA中則含有該蛋白的結(jié)構(gòu)基因。另外，這中則含有該蛋白的結(jié)構(gòu)基因。另外，這項(xiàng)技術(shù)把基因表達(dá)產(chǎn)物與親和篩選結(jié)合起來(lái)，可以利用適項(xiàng)技術(shù)把基因表達(dá)產(chǎn)物與親和篩選結(jié)合起來(lái)，可以利用適當(dāng)?shù)陌械鞍讓⒛康牡鞍谆蚨嚯奶暨x出來(lái)。當(dāng)?shù)陌械鞍讓⒛康牡鞍谆蚨嚯奶暨x出來(lái)。lUsed for cloning foreign genes among other applicationslProteins and peptides

26、 are fused to the Capsid (surface) of the phagelThe combination of the phage and peptide is known as a Fusion Protein實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路phageslFilamentous phages M13FdF1lOthersT4Filamentous phageslInfect many gram-negative bacterialCircular single stranded DNA genomelAbout 6.4kb.p.lLong, flexible tube stru

27、cturelabout 1m long and 6.5nm in diameterlReproduced and secreted from infected bacteria without cell killing or lysis (lysogenic phage)(a) Adenovirus. (b) Rotavirus. (c) Influenza virus (courtesy of George Leser). (d) Vesicular stomatitis virus.(e) Tobacco mosaic virus. (f) Alfalfa mosaic virus. (g

28、) T4 bacteriophage. (h) M13 bacteriophage.M13 噬菌體顆粒結(jié)構(gòu)噬菌體顆粒結(jié)構(gòu)M13噬菌體的生活史噬菌體的生活史其裂解周期為：其裂解周期為：1)吸附吸附(adsorption) 2)侵入侵入(entory)3)復(fù)制（生物合成復(fù)制（生物合成biosynthesis）4)成熟成熟(maturation) 5)裝配裝配(assembly)6)釋放釋放(release)絲狀噬菌體的基因及蛋白結(jié)構(gòu)絲狀噬菌體的基因及蛋白結(jié)構(gòu)http:/www.scielo.br/scielo.php?pid=S1415-47572005000100001&script=s

29、ci_arttext pIII (406aa, 58copies) pVIII (50aa, 2700 copies) pVI (112aa, 58copies)載體的插入位點(diǎn)載體的插入位點(diǎn) pIII 和和pVIII 噬菌體展示系統(tǒng)噬菌體展示系統(tǒng)pIII系統(tǒng)pVIII系統(tǒng)拷貝數(shù)拷貝數(shù)少少多多多肽片段大小多肽片段大小大大1010個(gè)氨基酸個(gè)氨基酸親和力親和力高高低低適用范圍適用范圍常用于展示由常用于展示由cDNAcDNA和和基因組序列編碼的多基因組序列編碼的多肽，范圍較廣肽，范圍較廣展示小肽，范圍較窄展示小肽，范圍較窄測(cè)序分析插入序列將噬菌體文庫(kù)鋪在固定的靶蛋白上洗脫未結(jié)合的噬菌體加入大腸桿菌，擴(kuò)

30、增和富集洗脫的噬菌體鋪富集文庫(kù)鋪盤(pán)分離單個(gè)克隆34輪篩選驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：結(jié)合實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： A. 高通量的淘選：高通量的淘選：將靶標(biāo)分子（抗體）固定在固相載體上，加入噬菌體展示肽將靶標(biāo)分子（抗體）固定在固相載體上，加入噬菌體展示肽庫(kù)（噬菌體的數(shù)量可達(dá)庫(kù)（噬菌體的數(shù)量可達(dá)1011 PFU），利用抗原），利用抗原-抗體的特異性親和力將與抗體結(jié)合的噬抗體的特異性親和力將與抗體結(jié)合的噬菌體吸附在固相載體上，不能結(jié)合的噬菌體仍在溶液中，可以通過(guò)洗滌去除，再將特異菌體吸附在固相載體上，不能結(jié)合的噬菌體仍在溶液中，可以通過(guò)洗滌去除，再將特異結(jié)合的噬菌體洗脫下來(lái)，如此反復(fù)數(shù)輪擴(kuò)增、淘選，即可將有

31、用的基因從多達(dá)百萬(wàn)以上結(jié)合的噬菌體洗脫下來(lái)，如此反復(fù)數(shù)輪擴(kuò)增、淘選，即可將有用的基因從多達(dá)百萬(wàn)以上的噬菌體克隆中分離出來(lái)。的噬菌體克隆中分離出來(lái)。B. 可用于模擬表位的篩選可用于模擬表位的篩選 ：利用噬菌體展示技術(shù)得到模擬表位的報(bào)道較多模利用噬菌體展示技術(shù)得到模擬表位的報(bào)道較多模擬表位同樣可誘發(fā)與天然表位相似的特異性免疫反應(yīng)，例如利用乙肝病毒的模擬表位免擬表位同樣可誘發(fā)與天然表位相似的特異性免疫反應(yīng)，例如利用乙肝病毒的模擬表位免疫小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的乙肝病毒抗體。疫小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的乙肝病毒抗體。C. 易于純化易于純化 重組噬菌體的純化步驟簡(jiǎn)單、不要求昂貴的試劑與設(shè)備，重組噬菌體的純化步

32、驟簡(jiǎn)單、不要求昂貴的試劑與設(shè)備，在一般的實(shí)驗(yàn)室條件下就可以完成。在一般的實(shí)驗(yàn)室條件下就可以完成。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 首先，目前所建的肽庫(kù)容量只能達(dá)到首先，目前所建的肽庫(kù)容量只能達(dá)到109，要想構(gòu)建大片段的肽庫(kù)，要想構(gòu)建大片段的肽庫(kù)很困難。其次，需要解決肽庫(kù)的多樣性問(wèn)題。第三，少數(shù)多肽由于疏很困難。其次，需要解決肽庫(kù)的多樣性問(wèn)題。第三，少數(shù)多肽由于疏水性過(guò)強(qiáng)，或由于影響外膜蛋白的折疊而不能展示在噬菌體表面。水性過(guò)強(qiáng)，或由于影響外膜蛋白的折疊而不能展示在噬菌體表面。 噬菌體展示系統(tǒng)的應(yīng)用及優(yōu)缺點(diǎn)噬菌體展示系統(tǒng)的應(yīng)用及優(yōu)缺點(diǎn)6、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)共定位、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)共定位（cellular co-locali

33、zation）基于細(xì)胞內(nèi)綠色蛋白示蹤技術(shù)的蛋白質(zhì)間相互的研究方法綠色熒光綠色熒光羅丹明染色羅丹明染色重重 疊疊相相 差差舉舉 例例細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)共定位研究?jī)煞N已知細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)共定位研究?jī)煞N已知蛋白質(zhì)時(shí)空表達(dá)關(guān)系蛋白質(zhì)時(shí)空表達(dá)關(guān)系舉舉 例例第三節(jié)第三節(jié) 生物大分子相互作用分析生物大分子相互作用分析新技術(shù)新技術(shù) 1、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）能夠?qū)τ诩?xì)胞中的蛋白質(zhì)間相互作用或?qū)ψ饔眠M(jìn)行實(shí)時(shí)原位分析的檢測(cè)方法供體熒光素 受體熒光素FRET現(xiàn)象現(xiàn)象 Binding NO BindingFRET: T

34、he Size 當(dāng)一個(gè)熒光分子當(dāng)一個(gè)熒光分子(又稱(chēng)為又稱(chēng)為供體分子供體分子)的熒光光譜與另的熒光光譜與另一個(gè)熒光分子一個(gè)熒光分子(又稱(chēng)為又稱(chēng)為受體受體分子分子)的激發(fā)光譜相重疊時(shí)的激發(fā)光譜相重疊時(shí)，供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光受體分子發(fā)出熒光，同時(shí)供同時(shí)供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減衰減。FRET 程度與供、受程度與供、受體分子的空間距離緊密相關(guān)體分子的空間距離緊密相關(guān)，一般為一般為710 nm 時(shí)即可發(fā)時(shí)即可發(fā)生生FRET；隨著距離延長(zhǎng)隨著距離延長(zhǎng)，F(xiàn)RET呈顯著減弱呈顯著減弱.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)InteractionXCFPYYFP

35、UV laserFRETYellow light emissionYYFPXCFPUV laserCyan light emissionDonorAcceptorFRET的能量供體和受體的能量供體和受體滿足條件：滿足條件： 供體受體的激發(fā)光譜要分得足夠開(kāi)；供體受體的激發(fā)光譜要分得足夠開(kāi)； 供體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜要重疊；供體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜要重疊； 供受體的發(fā)射光譜要足夠分開(kāi)。供受體的發(fā)射光譜要足夠分開(kāi)。CFPYFPWavelength (nm)Normalized intensity (%)GFP 綠綠 色色 熒熒 光光 蛋蛋 白白CFP (青色熒光蛋白青色熒光蛋白)(第第6

36、6位位TyrTrp)(第第203位位ThrTyr)YFP (黃色熒光蛋白黃色熒光蛋白)CFP (433nm /476nm) YFP (513nm / 527nm)FRET的能量供體和受體的能量供體和受體 均相檢測(cè)（無(wú)分離和洗滌步驟）均相檢測(cè)（無(wú)分離和洗滌步驟） 實(shí)時(shí)連續(xù)地觀察活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)連續(xù)地觀察活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化FRET技術(shù)的優(yōu)勢(shì)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)Fluorescence IntensityTime LigandCy3Cy5ABCIntermolecularDirectIndirectKinaseStep2Step1FRET應(yīng)用的類(lèi)型應(yīng)用的類(lèi)型FRET應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍 酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體展

37、示系統(tǒng)所篩選克隆的復(fù)證酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體展示系統(tǒng)所篩選克隆的復(fù)證 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)核酸相互作用核酸相互作用 酶活性分析酶活性分析蛋白酶、磷酸激酶蛋白酶、磷酸激酶 鈣流檢測(cè)、離子通道研究鈣流檢測(cè)、離子通道研究 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究FRET應(yīng)用的局限性應(yīng)用的局限性 信噪比經(jīng)常不佳，通常為信噪比經(jīng)常不佳，通常為1：1 -背景主要來(lái)自受體被直接激發(fā)的信號(hào)背景主要來(lái)自受體被直接激發(fā)的信號(hào) 檢測(cè)儀器的靈敏度、分辨率以及計(jì)算機(jī)影像采集和檢測(cè)儀器的靈敏度、分辨率以及計(jì)算機(jī)影像采集和分析軟件的能力分析軟件的能力2、表面等離子共振技術(shù)、表面等離子共振技術(shù)（surface plasmon resonan

38、ce，SPR）適合于多種類(lèi)型分子并且無(wú)需借助標(biāo)記物可以實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)合物直接實(shí)時(shí)測(cè)定的方法 SPRimagerII 基本原理：基本原理：基于表面等離子共振（基于表面等離子共振（SPR）技術(shù)）技術(shù)來(lái)實(shí)時(shí)跟蹤生物分子間的相互作用，而不用任何標(biāo)記來(lái)實(shí)時(shí)跟蹤生物分子間的相互作用，而不用任何標(biāo)記物。實(shí)驗(yàn)時(shí)先將一種生物分子固定在傳感器芯片表面，物。實(shí)驗(yàn)時(shí)先將一種生物分子固定在傳感器芯片表面，將與之相互作用的分子溶于溶液流過(guò)芯片表面。檢測(cè)將與之相互作用的分子溶于溶液流過(guò)芯片表面。檢測(cè)器能跟蹤檢測(cè)溶液中的分子與芯片表面的分子結(jié)合、器能跟蹤檢測(cè)溶液中的分子與芯片表面的分子結(jié)合、解離整個(gè)過(guò)程的變化。解離整個(gè)過(guò)程的變化。

39、SPR 現(xiàn)象現(xiàn)象SPR angle450 gold layerp-PolarizedLight 表面等離子共振（表面等離子共振（SPR）是一種物理現(xiàn)象，當(dāng)入射光以臨界角入射到兩種不同折是一種物理現(xiàn)象，當(dāng)入射光以臨界角入射到兩種不同折射率的介質(zhì)界面（比如玻璃表面的金或銀鍍層）時(shí)，可引起金屬自由電子的共振，由于電射率的介質(zhì)界面（比如玻璃表面的金或銀鍍層）時(shí)，可引起金屬自由電子的共振，由于電子吸收了光能量，從而使反射光在一定角度內(nèi)大大減弱。其中，使反射光在一定角度內(nèi)完子吸收了光能量，從而使反射光在一定角度內(nèi)大大減弱。其中，使反射光在一定角度內(nèi)完全消失的入射角稱(chēng)為全消失的入射角稱(chēng)為SPR角。角。SPR

40、隨表面折射率的變化而變化，而隨表面折射率的變化而變化，而折射率的變化又和結(jié)合折射率的變化又和結(jié)合在金屬表面的生物分子質(zhì)量成正比。在金屬表面的生物分子質(zhì)量成正比。因此可以通過(guò)獲取生物反應(yīng)過(guò)程中因此可以通過(guò)獲取生物反應(yīng)過(guò)程中SPR角的動(dòng)態(tài)變化，角的動(dòng)態(tài)變化，得到生物分子之間相互作用的特異性信號(hào)。得到生物分子之間相互作用的特異性信號(hào)。 SPR 角度角度掃描曲線掃描曲線SPR angle傳統(tǒng)檢測(cè)原理傳統(tǒng)檢測(cè)原理SPR angle shift as basis of measurementSPR imaging 檢測(cè)原理檢測(cè)原理Fixed angle, fixed wavelengthD%RReflec

41、tivity change as basis of measurementSPRimager 系統(tǒng)系統(tǒng)Rotating Stage流動(dòng)相流動(dòng)相（含待分析物）（含待分析物）Gold-coated glassSPRchipp-pol light棱鏡棱鏡分子探針陣列分子探針陣列GWCs “SPR Imaging” 技術(shù)技術(shù)Bioarray TerminologySPRchipglassgoldattachment chemistryBiosensorAnalyteProbeMonitoring Changes: Difference Images=SA+Bim-PEGn-PEGSASAProbe ArrayProbe Array + BiotinT7Difference Image: signal due to binding of BiotinT7 to StreptavidinABAB-Monitoring Changes: Image + ChartVa