生化檢測(cè)方法匯總

1、一、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（SGPT ）賴氏改良法器材 ： 試管及試管架、移液器或吸量管、恒溫水浴鍋、721 型分光光度計(jì)、溫度計(jì)、動(dòng)物血清試劑：（ 1） O.1mol/L pH7.4 磷酸鹽緩沖液： O.1mol/L 磷酸氫二鈉溶液：稱取Na2HPO414.22 或 Na2HPO4 2H2O17.8g溶 解于蒸餾水中，并稀釋至 1 000ml,4 C 保存。 O.1mol/L 磷酸二氫鉀溶液：稱 KH2PO413.61g§ 解 dH2O 中，稀釋至 1000ml, 4C保存。 將 0.1mol/L 磷酸氫二鈉溶液420ml 和 0.1mol/L 磷酸二氫鉀溶液80ml 混和即為 0.1mo

2、l/L pH7.4 的磷酸鹽緩沖液。加氯仿數(shù)滴， 4C 保存。（ 2） 標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸（含丙酮酸 2.0 卩 mol/mL ）:取標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸鈉10mg 用上述緩沖液準(zhǔn)確定容為50mL 此液須當(dāng)日用當(dāng)日配。（ 3） SGPT 底物液 （含 a -酮戊二酸 2 卩 mol/ml 及 DL-丙氨酸 200 卩 mol/ml ）:取 a -酮戊二酸 29.2mg, DL-丙氨酸 7g ,用試劑 1 溶成 100ml , 在稀釋到刻度前，以 1mol /LNaOH 調(diào) pH 7.4 （因?yàn)檗D(zhuǎn)氨酶在pH7.3 以下或 7.6 以上的環(huán)境中酶活性下降），加數(shù)滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用4 天。（ 4） GO

3、T 底物液（ DL - 天冬氨酸 200mmol/L , a -酮戊二酸 2mmol/L ）:稱取 a -酮戊二酸 29.2mg和 DL-門冬氨酸 2.66g 置于一小燒杯中 ，加入 1mol/L 氫氧化鈉 20.5ml 使溶解 , 并校正 pH 至7.4, 然后將溶液移入100ml 容量瓶?jī)?nèi) ，用 0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液定容至刻度。放置冰箱內(nèi)保存。（ 5） 2.4- 二硝基苯肼溶液 ：取分析純 2,4- 二硝基苯肼 19.8mg, 用 1mol/L HCl 溶于 100ml ，置棕色瓶中保存。（ 6） 0.4mol/L NaOH 溶液 ：稱取 16g 固體 NaOH 用蒸餾水溶解，冷

4、卻至室溫，定容至1000mL 備用。操作步驟：1、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取試管18 支按下表操作。試管號(hào)對(duì) 照12345丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液（ 1 毫升 2 微克分子）00.050.100.150.200.25叮叮小文庫(kù)SGPT 或 SGO 底物0.500.450.400.350.300.252叮叮小文庫(kù)0.1M 磷酸鹽緩沖液 PH7.4( ).10.10.10.0.10.102857115020相當(dāng)于谷丙轉(zhuǎn)氨酶單位97相當(dāng)于谷草轉(zhuǎn)氨酶單位0246111U19004每個(gè)樣做 3 個(gè)平行，置 37 水浴 30 分鐘，各管加 2,4-二硝基苯肼液 0.5mL , 混勻，再在 37C水浴中放置 20mL 各管加 0

5、.4mol/L 氫氧化鈉溶液 5mL 混勻， 10 分鐘后，從水浴箱中取出，以蒸餾水調(diào)“零”點(diǎn)，用 520nm 波長(zhǎng)比色，讀取各管之吸光值，各管之吸光值均減去空白的吸光值，然后以吸光值為縱坐標(biāo)，各管相應(yīng)的轉(zhuǎn)氨酶單位為橫坐標(biāo)。繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。為了方便，可列出各光度相當(dāng)于轉(zhuǎn)氨酶單位表。2、酶活性測(cè)定：取試管兩支，注明測(cè)定管及對(duì)照管。試劑樣品測(cè)定（每個(gè)今3個(gè)平行）|對(duì)照（每個(gè)樣 3 個(gè)平行）血清（ mL樣0.10.1SGPT 或 SGOT 底物 ( mL0.5 1置 37r 水浴 30 分鐘（ SGO 為 37C, 60 分鐘后再加枸櫞酸苯胺1 滴）2.4- 二硝基苯肼（ mL0.50.5置 37

6、r 水浴 20 分鐘SGPT 或 SGOT 底物 ( mL0.5NaOH 溶液（ mL5.05.0對(duì)照及樣品各做 3 個(gè)平行，充分搖勻，靜置10 分鐘后，用 520nm 波長(zhǎng)比色，以蒸餾水調(diào)節(jié)零點(diǎn)，讀取吸光值，用樣品減去對(duì)照吸光值，求得樣品的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力15 鴉實(shí)菠墩熠利. 密;和 -1?EJ.膜舍<U)- 一 -驗(yàn)現(xiàn)霧、丐耳Slj, S1J'J(K)S3, S3r 4, s-i*Ft1O52 S2TUl u空0* 1O. 1os &A濾哎 1 卷日、 u宜旳 P殖誕 *浴 4>亠灌雜 H 早且 北聲 464誠(chéng)工 *O. 16 1d 3?10. 1葆海離舖 SK5

7、1OO_ OE5oB iod 15O, 20門 F；c 4r*d S噫 4 二硝基蘋冊(cè) gj. j6 &6 5O* 5Q, 00, 5CU 56 bi宜 3TP 小苛吉中 呆 ; 蠱 zo 戦丄 "1 (7>O. -1 * &IN iar>H (ml )|S.O6.0je. O1 B- n| fi. O仇 Q1 B.O*混巳 3告世?干皿 m 后出尬 5IM 決 Mi 型分光汽 ; 陡訐上匕色 * 波卜 Sms?空匸亙叩年點(diǎn) -| <> iHTT! S麓曙訐雷?斗=31 Si? =Sj 如=- 'VTL Sa、 =3t> 邑 =S

8、4 芻?=Ann 名借平均 碾兀廉 cz>. ）Ao Al-Ai*血 iA< AB- ArnOAu - 一 Aju O285*7T7150計(jì)砂呂 古果一U1 忻門氐甲吃、m 陽細(xì)甲u(yù)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性單位 :3叮叮小文庫(kù)37 C, pH7.4 ，每小時(shí)每毫升血清催化生成 1 卩 mol 丙酮酸為 1 個(gè)單位。例： 0.1ml 血清每小時(shí)催化生成 0.1 卩 mol 丙酮酸 , 即相當(dāng)于 GPT 100U / 100ml 血清。注意 :1. 在測(cè)定 SGPT 寸，應(yīng)事先將底物、血清在 37C 水浴中 保溫，然后在血清管中加入底物，準(zhǔn)確記時(shí)。2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線上數(shù)值在 20500U 是準(zhǔn)確可靠

9、的，超過500U 時(shí)，需將樣品稀釋。3. 轉(zhuǎn)氨酶只能作用于 a- L- 氨基酸，對(duì)氨基酸無 作用。實(shí)驗(yàn)室多用 a DL 氨基酸（較 L 氨基酸 價(jià)廉），若用 L 氨基酸，則用量減半。4. 溶血標(biāo)本不宜使用，因血細(xì)胞中轉(zhuǎn)氨酶活力較高，會(huì)影響測(cè)定效果。5. 血清樣品的測(cè)定需在顯色后 30 分鐘內(nèi)完成。6. 丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度要求十分精確。由于丙酮酸開封后易 變質(zhì)為多聚丙酮酸，而影響丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液的有效濃度而不 易察覺。建議使用質(zhì)量可靠的市售丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液。7. 每批試劑的空白管吸光度上下波動(dòng)不應(yīng)超過 0.015A ，若有 超出，應(yīng)仔細(xì)檢查試劑與儀器方面的問題。8. 嚴(yán)重脂血、黃疸、溶血和糖尿病酮癥酸中

10、毒病人血清標(biāo)本可增加測(cè)定的吸光度，測(cè)定這類標(biāo)本應(yīng)做血清標(biāo)本對(duì)照管優(yōu)點(diǎn)：盡管基質(zhì)液中余下的a-酮戊二酸同樣可生成紅棕色苯腙硝醌化合物而影響測(cè)定結(jié)果，但因其量不多 ，加之對(duì) 505nm 的吸光度遠(yuǎn)不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物強(qiáng) ，尤其用標(biāo)準(zhǔn)曲 線作測(cè)定時(shí) ,所用的酶活性單位通過卡門氏分光光度速率法矯正 ，擯棄了賴氏法一些固有弊端 ， 結(jié)果比其他比色法準(zhǔn)確 .故衛(wèi)生部臨檢中心建議國(guó)內(nèi)無條件使用連續(xù)監(jiān)測(cè)法的單位使用賴氏法.1981 年全國(guó)常規(guī)生化檢驗(yàn)方法學(xué)術(shù)討論會(huì)認(rèn)為賴氏法測(cè)定ALT 活性較為合理 ， 缺點(diǎn)：由于賴氏法設(shè)計(jì)的底物濃度, 如 a-酮戊二酸不足 ，反應(yīng)速度只能達(dá)到最大速度的65%; 顯色

11、劑 2,4- 二硝基苯肼的用量只及反應(yīng)液中酮酸濃度的一半； 保溫 30min 的酶促反應(yīng)后 ,新生成的丙酮酸和未用完的 a-酮戊二酸存在著無法人為控制的競(jìng)爭(zhēng)顯色的幾率問題，如此等等 ,使賴氏法的重現(xiàn)性較差 ,在測(cè)量精度上仍與連續(xù)監(jiān)測(cè)法相差甚大.* 1 個(gè)卡門氏單位的定義是：在溫度 25C，pH7.4 , 波長(zhǎng) 340nm 光徑 1cm 的條件下， 1ml 血清使 NADH 勺吸光度下降 0.001 的轉(zhuǎn)氨酶活性。*國(guó)際單位：在最適溫度（ 25C）下， 1 分鐘產(chǎn)生 1 卩 mol 丙酮酸的酶量為 1 個(gè)活性單位，即 1IU=1umol/min 。King 法單位定義是：每 1ml 血清在 37

12、 C 條件下與底物作用 60 min ，生 成 1 卩 mol 丙酮酸稱為一個(gè)單位。Mohun 法單位定義是：每毫升血清在 pH=7.4 , 37C 條件下與底物作用 30 min ，每生成 2.5 微克丙酮酸為 1 單位。尿素氮（ BUN ）（二乙酰一肟法尿素測(cè)定）（一）儀器設(shè)備：水浴鍋、紫外分光光度計(jì)、10mL 試管（二） 試劑：1、 尿素氮試劑：蒸餾水100mL ，濃硫酸 44mL85% 磷酸 66mL ，冷卻至室溫后，加氨基硫脲50mg4叮叮小文庫(kù)硫酸鎘 （3CdSO4 ?8H2O ） 2g, 溶解后稀釋至1000mL 。2、 20g/L 二乙酰一肟試劑：稱取二乙酰一肟20g ，加入蒸

13、餾水溶解，定容至1000mL 。3、 尿素氮標(biāo)準(zhǔn)貯存液（357mmol/L ）: 稱取尿素 1.072g 溶解于蒸餾水中定容至1000mL , 至于棕色瓶中貯存。4、 尿素氮標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（17.85mmol/L ） : 取貯存液 5mL , 加蒸餾水定容至100mL 。（三） 操作步驟按下面表格的試劑配比操作：試劑測(cè)定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管血清（ ml ）0.02-尿素氮標(biāo)應(yīng)用準(zhǔn)液（ ml ）-0.02-蒸餾水（ ml ）0.02二乙酰 -肟試劑（ ml）0.50.50.5尿素氮試劑（ ml ）5.05.05.0按上述表的配方每個(gè)樣做3 個(gè)平行樣，混勻，置沸水浴中加熱15min , 立即 用自來水冷卻

14、5 分鐘。分光光度計(jì)選用 540nm 波長(zhǎng)，以空白管調(diào)零點(diǎn)，讀取各管吸光度。尿素（ mg% ）=測(cè)定管吸光度 /標(biāo)準(zhǔn)管吸光度 x 17.85 （mg/ml ）1. 此法靈敏度高，用量極微（一般只需 0.02ml 血清即可）。本實(shí)驗(yàn)是先將血清用生理水以 1： 4 加以稀釋再取 0.1ml ，故最后計(jì)算時(shí)，應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)“5”- 2. 試劑中加入硫胺脲和鎘離子，可增進(jìn)顯色強(qiáng)度和色澤穩(wěn)定性，但仍有輕度褪色現(xiàn)象（小于 5%/h ）o3.此法操作簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)，不受其他非蛋白質(zhì)含氮化合物如尿酸、肌酸等影響，但應(yīng)控制好實(shí)驗(yàn)條件。5叮叮小文庫(kù)4 4. 吸管必須校正，使用時(shí)務(wù)必注意清潔干凈，加量務(wù)必準(zhǔn)確。5.

15、 尿液中的尿素氮也可用此法進(jìn)行測(cè)定。由于尿液中尿素氮含量咼，標(biāo)本需用蒸餾水 以 1:50 稀釋。如果呈色后吸光度仍超過本法的線性范圍，還需將尿液再稀釋，重新測(cè)A 定 o3?尿素濃度以前習(xí)慣用尿素氮表示，尿素分子中含有二個(gè)氮原子，因此1mmol/L 尿素等于 2 mmol/L 尿素氮。世界衛(wèi)生組織推薦使用尿素，并以mmol/L 表示濃度單位，我國(guó)衛(wèi)生部也已規(guī)定一律使用尿素，不再使用尿素氮一詞。尿素氮 mg% = 測(cè)定管 /標(biāo)準(zhǔn)管 X 0.002 X 100/0.1 X 5測(cè)定管 /標(biāo)準(zhǔn)管 X 10【參考范圍】5-20 mg/dl血清尿素氮測(cè)定血清尿素 ?（BUX ）?定檢測(cè)方迭二乙醸 - 時(shí)顯色

16、法； ttft波氏比色法；礙躅聯(lián)速率法"E常蕃考恒2. B6 8. 2EHO 1 /L （ 以尿素計(jì)） =崎床査文展索杲蛋弓質(zhì) 代謝的主褰藝末產(chǎn)物，主賽在肝紙 合戍，由腎蛀拝 泄. 因此 . 測(cè) 定可了解腎小球的濾過功能 .BUN 升高見于： 生理性升高，如高蛋白改宦 =病 理性升高：腎首性， 如天商 積疑傷、劇烈 咽吐 r 幽門?，F(xiàn)、 腸擾殂 r 長(zhǎng)昭復(fù)瀉、上消化道出 血等；腎性 . 如急 性腎小球皆炎、 背菇晚期、腎功能衰喝、慢性腎盂 皆炎及中毒性肯炎等：皆后性 . 抽前列變種大、尿路結(jié) 石、尿路挾窄、 藕號(hào)腫曆等 =BUK 澤低見于： 主理性歸低，址妊娠婦女尋： 病瑾性隠低 ?

17、 如危性肝壞死、 肝硬化、中毒性肝炎等 .三、 肌酐（ Cr ）四、血糖（ Glu）（鄰甲苯胺法）血糖是指血液中的葡萄糖，葡萄糖與冰醋酸、鄰甲苯胺共熱時(shí)，葡萄糖先脫水轉(zhuǎn)化為羥甲基糠醛，再與鄰甲苯胺縮合為藍(lán)綠色的薛夫堿，其顏色的深淺與葡萄糖含量成正比?？捎帽壬ㄟM(jìn)行定量測(cè)定。1、 儀器：紫外分光光度計(jì)、水浴鍋2、 試劑：（1） 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)母液（ 10mg/ml ，用飽和苯甲酸溶液配制）6叮叮小文庫(kù)（2） 鄰甲苯胺溶液：2.5g 硫脲溶于冰醋酸，加入鄰甲苯胺150ml 及 2.4% 硼酸 100ml ，用冰醋酸定容至 1升。3、 操作步驟：（1）配置不同濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：取5 支 10ml 容量

18、瓶，標(biāo)號(hào)，依次加入葡萄糖母液 0.25 ,0.5 ，1.0 ， 2.0，3.0ml ，用飽和苯甲酸稀釋至10ml ，混勻（則上述溶液100ml 葡萄糖含量為25，50 ，100 ，200 ， 300mg ）；（2）分別精密吸取不同濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，設(shè)平行管，空白管加0.1mL 蒸餾水，各管加入鄰甲苯胺試劑5.0mL ，混勻后，置沸水中15 分 鐘，立即移入冷水浴中冷卻；（3）以空白號(hào)管調(diào)零，于紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)630nm 處測(cè)吸光值，以各管的吸光度為縱坐標(biāo)，相應(yīng)管中葡萄糖含量（mg ）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性方程。（4）測(cè)試樣品：取全血0.1mL ，設(shè)平行樣，按上述方法測(cè)出其

19、A630nm 吸光值 ,通過線性方程求出其血糖含量。試劑（ mL）134502鄰甲苯胺試劑5.05.05.05.05.05.0不同濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液00.10.10.10.10.1蒸餾水0.100000100mL 全血相當(dāng)于葡萄02550100200300糖質(zhì)量 mgA630nm0.000注意事項(xiàng) :7叮叮小文庫(kù)1. 本法不需要除去蛋白質(zhì)，鄰甲苯胺試劑只與醛糖顯色，血液中其他還原性物質(zhì)基本上無影響。2. 鄰甲苯胺試劑與葡萄糖顯色的深淺及其穩(wěn)定性與試劑中鄰甲苯胺濃度、冰醋酸濃度、加熱時(shí)間有關(guān)。此法顯色穩(wěn)定，24 小時(shí)內(nèi)無變化。如將加熱時(shí)間縮短，生成顏色容易消褪。3. 輕度溶血的血清對(duì)結(jié)果無明顯影

20、響。根據(jù)推導(dǎo)，血清中含血紅蛋白450 毫克 /100 毫升時(shí)，可使測(cè)定結(jié)果降低約10% 。4?高脂血的標(biāo)本最后顯色有時(shí)會(huì)出現(xiàn)渾濁，影響測(cè)定結(jié)果?？上戎苽溲獮V液后再行測(cè)定。五、血清白蛋白（ Alb ）（溴甲酚綠法BCG ）原理：血清白蛋白在PH4.2 的緩沖液中帶正電荷，在有非離子型表面活性劑存在時(shí)，可與帶負(fù)電荷的染料溴甲酚綠（BCG ）結(jié)合形成藍(lán)綠色復(fù)合物，在波長(zhǎng)630 納米處有光吸收峰，其顏色的深淺與白蛋白濃度成正比，與同樣處理的白蛋白標(biāo)準(zhǔn)比較，可求得血清白蛋白含量。試劑：1. 溴甲酚綠（ BCG ）貯存液：取BCG 419mg, 用 10ml 0.1mol/L NaOH溶解 ,加NaN3

21、100mg, 定容至 1000mL 。貯于棕色瓶備用。如用溴甲酚綠鈉鹽應(yīng)稱取 432mg加水溶解。2. 0.1mol/L 檸檬酸緩沖液（ pH 4.2 ）: 分別配制 0.1mol/L 檸檬酸和檸檬酸鈉溶液，然后按 12.3 ： 7.7 的體積比例混合。每1000ml 混合液加入 NaN 3 100mg 。3. 30% 聚氧化乙烯月桂醚 （Brij-35 ）溶液：取 Brij-35 30g ，加少量水， 60C 水浴溶8叮叮小文庫(kù)解，加水至 100ml （此可用 Tween-20 或 Tween-80 代替） 。4. BCG 應(yīng)用液： BCG 貯存液 250ml ,0.1mol/L 檸檬酸緩沖

22、液（ pH4.2 ） 750ml ,30%Brij-35 8ml （也可以用Tween-20 8ml或 Tween-80 10ml代替）混合而成。5. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（ 10mg/ml ）: 稱取白蛋白 1.00g ，用生理鹽水。實(shí)驗(yàn)操作：1. 白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制（ 1） 稀釋白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液：分別精密量取白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0.10 mL,0.20 mL,0.40 mL,0.60 mL 于試管中，再在每個(gè)管中依次加入蒸餾水0.9 mL ,0.8 mL ,0.6 mL ,0.4mL , 混勻，得到稀釋后白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液含量分別為1.0 mg/ml ,2.0 mg/ml ,4.0 mg/ml ,6.0 mg/ml

23、 。（ 2）分別精密量取每個(gè)不同濃度稀釋白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0.2mL 于試管中，空白管加入生理鹽水 0.2mL ，設(shè)平行樣，再在每個(gè)管中加入BCG 應(yīng)用液 5.0mL , 混勻后以空白管調(diào)零，立即于紫外分光光度計(jì)測(cè)吸光值，吸收波長(zhǎng)為620m n , 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性方程。（ 3） 樣品血清白蛋白測(cè)定：用生理鹽水按1： 10 的比例稀釋血清，取稀釋后的血清 0.2ml 按上述方法測(cè)出其吸光值，求得其白蛋白含量。注意事項(xiàng)1. BCG 是一種 PH 指示劑，變色域?yàn)?PH3.8 （顯黃色） ? 5.4 （顯藍(lán)綠色），因此控制反應(yīng)液的 PH 是本法測(cè)定的關(guān)鍵。2. 配制 BCG 試劑也可用其他緩沖液如

24、枸椽酸鹽或乳酸鹽緩沖液。但以琥珀酸緩沖液的校正曲線通過原點(diǎn)，線性好，靈敏度高，成為首選推薦配方。9叮叮小文庫(kù)3. 試劑中的 Brij-35 也可用其他表面活性劑代替，如吐溫20 或吐溫 80 ， 終濃度為 2ml ，靈敏度和線性范圍不變。4. 當(dāng)白蛋白標(biāo)準(zhǔn)與 BCG 結(jié)合后，溶液光徑 1, 在 630 處測(cè)定的吸光度應(yīng) 為0.811 士 0.035 , 如達(dá)不到此值，表示靈敏度較差。5. 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液是一個(gè)復(fù)雜的問題，實(shí)驗(yàn)證明，BCG 不但與白蛋白呈色，而且與血清中多種蛋白質(zhì)成分呈色，其中以球蛋白、運(yùn)鐵蛋白、結(jié)合珠蛋白更為顯著，其反應(yīng)速度較白蛋白稍慢。由于30S 內(nèi)呈色對(duì)白蛋白特異，故BCG

25、與血清混合后，在 30S 內(nèi)讀取吸光度，可明顯減少非特異性呈色反應(yīng)。為了減少本法基質(zhì)效應(yīng)的影響，最好用參考血清作標(biāo)準(zhǔn)。1. 本法操作簡(jiǎn)便、快速、膽紅素、溶血和中度脂血無干擾，既可手工操作，也能自動(dòng)化分析，是目前國(guó)內(nèi)測(cè)定血清白蛋白的最常用方法。2. 本法線性范圍 10-60g/L , RCV V 4% 。但該法與溴甲酚紫法比較，對(duì)血清白蛋白特異性稍差。六、血清總蛋白（ TP ）（雙縮脲法）原理：血清中蛋白質(zhì)分子的肽鍵與雙縮脲試劑中的Cu+ 結(jié)合形成紫色化合物；其色度與總蛋白的濃度成正比，在546 波長(zhǎng)下進(jìn)行比色測(cè)定。實(shí)際上凡是分子內(nèi)含有兩個(gè)氨基甲酰基（-CONH2 ）的化合物，不論直接相連或是通

26、過一個(gè)氮或碳原子間接連接，均能與雙縮脲試劑發(fā)生反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子內(nèi)含有許多肽鍵（ -CONH2 ）, 因此可用雙縮脲法作比色測(cè)定。但應(yīng)注意的是不僅僅是（ -CONH2 ）, 凡含 -CSNH2 、-C （ NH ） NH2 或-CH2NH2 等基團(tuán)而具有累似結(jié)構(gòu)的化合物對(duì)雙縮脲試驗(yàn)亦呈陽性，所以本反應(yīng)并非為蛋白質(zhì)所特有。但在體液中，除蛋白質(zhì)外實(shí)際上不存在可與雙縮脲試劑顯色的物質(zhì)。各種血漿蛋白質(zhì)，包括病理的和正常的，呈色的程度基本相同，因此在血漿蛋白的比色測(cè)定中，雙縮10叮叮小文庫(kù)脲反應(yīng)是比較理想的方法。儀器：紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、電子天平、試劑：（1） 10% 氫氧化鈉溶液：稱取10.00g

27、氫氧化鈉，用蒸餾水溶解，冷卻至室溫后，定容至 1L，備用。（ 2） 雙縮脲試劑：取 1.50g 硫酸銅和 6.0g 酒石酸鉀鈉，用 500mL 水溶解， 在攪拌下加入 300mL10 %氫氧化鈉溶液， 1.0g 碘化鉀；用水稀釋到 1000mL ,避光保存。此試劑可長(zhǎng)期保存。若貯存瓶中有黑色或暗紅色 沉淀出現(xiàn)，則需重新配制。（ 3） 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液： 10mg/mL 牛血清白蛋白溶液或相同濃度的酪蛋白溶液（酪蛋白用 0.05moL/L 氫氧化鈉溶液配制）。作為標(biāo)準(zhǔn)用的蛋白質(zhì)要預(yù)先用微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)其純度稱量，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。（4） 待測(cè)蛋白質(zhì)溶液：待測(cè)血清按1:10 倍數(shù)稀釋，

28、待用。（注意樣品濃度不要超過 10mg/ml ）操作方法：（ 1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：精密吸取 0 mL , 0.2 mL , 0.4 mL , 0.6 mL , 0.8 mL ,1.0mL 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于試管中，分別依次加入蒸餾水1.0mL ,0.8mL ,0.6mL ,0.4mL ,0.2mL ,0mL ，設(shè)平行樣，然后加入4mL 雙縮 脲試劑。充分搖勻后，37 C 水浴 10min , 以空白管調(diào)零點(diǎn)，在540nm 波11叮叮小文庫(kù)長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。以蛋白質(zhì)的含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）樣品的測(cè)定：用上述同樣的方法，測(cè)定稀釋的待測(cè)血清的蛋白質(zhì)濃度。1?樣品中總蛋白含量

29、超過100.0g/L , 則用生理鹽水稀釋后測(cè)定，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。2?試劑渾濁變色不能用。3?試劑使用后立即蓋緊瓶蓋。1、白蛋白 /球蛋白 =1.52.5/1 , 通過計(jì)算其比值可以判定肝臟的功能情況；2、總蛋白升高：脫水，皮膚大面積燒傷、發(fā)燒、腹瀉、嘔吐。3、總蛋白降低：大量輸液將機(jī)體血漿稀釋，某些水腫性疾病，長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)不良和消耗性疾病。4、球蛋白大量降低：機(jī)體免疫功能降低。七、總膽固醇（ TCH ）八、甘油三酯（ TG ）九、酪氨酸多巴氧化酶活性測(cè)定（多巴色素法）1、儀器設(shè)備：紫外分光光度計(jì)，離心機(jī)，秒表ii叮叮小文庫(kù)2、 試劑：( 1 ) 0.10mol/L 磷酸緩沖液 ( pH6.0

30、) :50mL0.20mol/L Na2HPO4與22mL0.1mol/L HCl混合，稀釋至200mL 。( 2)0.010mol/L 多巴溶液：稱取0.195g 多巴，用 pH6.0 磷酸緩沖液溶解并定容至 100mL 。3、 實(shí)驗(yàn)方法：取 0.1mL 待測(cè)液于試管中，加入2.9mL pH6.0 緩沖液，再加入2mL 多巴溶液，立即搖勻于 480nm 波長(zhǎng)下測(cè)吸光值，開始6min 內(nèi)每分鐘讀一次數(shù)，以后各2min 讀一次數(shù)，直至吸光度變化不大為止。以吸光度對(duì)時(shí)間作圖，從直線斜率求出酶活性。設(shè)平行樣，同樣方法測(cè)0.2mL 和 0.3mL 待測(cè)液的吸光值，求出酶活力。試樣中酶活力計(jì)算公式：a

31、=k/ V x 10 6a待測(cè)樣品的酶活性；k吸光值對(duì)時(shí)間作出的直線斜率；6 多巴溶液的摩爾吸收系數(shù)，L/g.cm ;V 待測(cè)樣品的體積，mL 。十、 SOD 勺測(cè)定方法1、試劑的配制(1) 0.05mol/L 磷酸緩沖液 (PBS, PH7.8) :A 母液： 0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液 ：取 NaHPO ?12HO ( 分子量 358.14 )71.7g,用蒸餾水溶解并定容至1000mL13叮叮小文庫(kù)B 母液： 0.2mol/L 磷酸二氫鈉溶液：取NaHPQ ? 2H0 ( 分子量 156.01 )31.2g ,用蒸餾水溶解并定容至1000mL0.05mol/L PBS(pH7.8)

32、的配制：分別取A 母液 (Na zHPQ 228.75mL,B母液 (NaH 2PQ)21.25mL ，用蒸餾水定容至1000mL(2) 14.5mM 甲硫氨酸溶液 (Met) : 取 2.1637g Met 用磷酸緩沖液 ( pH7.8 ) 定容 至1000ml 。(3) 30 卩 M EDTA-Na2 容液：取 0.001gEDTA-Na2 用磷酸緩沖液定容至 100mL 。(4)60 卩 M 核黃素溶液：取0.0023g 核黃素用磷酸緩沖液定容至100mL 避光 保存。(5) 2.25mM 氮藍(lán)四唑 (NBT) 溶液：取 0.1840g NBT 用 PBS 定容至 100ml ，避光保存

33、。2、酶活性測(cè)定(1) 反應(yīng)混合液配制 (以 60 個(gè)樣為準(zhǔn) )：分別取 Met 溶液 162mL EDTA-Na 溶液0.6mL , 磷酸緩沖液 5.4mL ,NBT 溶液 6mL 核黃素溶液 6mL, 混合后搖勻；(2) 分別取 3ml 反應(yīng)混合液和 30 卩 L 酶液于試管中(3)將試管置于光照培養(yǎng)箱中在4000 lux 光照下反應(yīng) 20min ;同時(shí)做兩支對(duì)照管，其中1 支試管取 3mL 反應(yīng)混合液加入30 L PB ( 不加酶液 )照光后測(cè)定作為最大光還原管，另1 支只加緩沖液置于暗中測(cè)定時(shí)用于調(diào)零。(4)以不照光的對(duì)照管 ( 只有緩沖液并置于暗處) 調(diào)零后，避光測(cè)A560(出現(xiàn)顏色

34、即可測(cè)定 )。(5)酶活性計(jì)算： SQD 舌性單14叮叮小文庫(kù)位以抑制 NBT 光化還原 50%所需酶量 ( 測(cè)的樣品值要在最大管的一半左右才合適，否則要調(diào)整酶量 ) 為1 個(gè)酶活單位 ( U) 。SQD 總活性 =(A ck-AE ) X V/ ( 1/2A ck X V)式中 -Ack 為照光對(duì)照管的吸光度;AE 為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積（ ml,1.6ml ，加入 PBS 的體積 ）；Vt 為待測(cè)樣（ ml ,30ul ）十一、 CAT （過氧化氫酶）的測(cè)定方法1、 試劑配制：0.15mol/L 磷酸緩沖液（ pH7.0 ）: 取 A 母液（Na zHPO q） 457.5 m

35、l 和 B 母液（ NaH 2PO 4）292.5 ml 混合后用蒸餾水定容至 1000ml 。2、 酶活測(cè)定（1） 反應(yīng)液配制：取 200ml PBS （ 0.15M ，pH7.0 ），加入 0.309ml 30% 的 H2O2 （原液）搖勻即可。（ 2） 樣品測(cè)定：以 PBS 為對(duì)照調(diào)零，取 3ml 反應(yīng)液加入 0.1ml （可視情況調(diào)整）樣品液，立即測(cè)定 A240 （紫外）， 1min 測(cè)一次，連續(xù) 4min 。（ 3） 酶活性計(jì)算：以每 min OD 值減少 0.01 為 1 個(gè)酶活性單位（ u）。CAT （u/mL min ）二 AA240 / （VsX0.01 屯式中一一厶人:彳。

36、 ：為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；T ：為反應(yīng)時(shí)間 （min ）;Vs: 為測(cè)定時(shí)樣品液體積（ml）。十二、 MDA 的測(cè)定方法1、 試劑配制：15叮叮小文庫(kù)（ 1） 5%TC （三氯乙酸）： 5.0gTCA 用蒸餾水定容至 1000ml ;Cm- mol/L （2） 0.5%TBA （2-硫代巴比妥酸）： 2.5g 用 TCA 定容至 500ml 。（避光）2、 操作方法：取待測(cè)樣 2mL 和 3mlO.5%TBA混合后在沸水浴煮沸15min , 然后迅速冷卻，4500r/min 離心 10min ，用蒸餾水為空白調(diào)零，分別測(cè)定上清液在450nm 532nm和600nm 處的吸光值。3、計(jì)算組織

37、中MDA 含量：MDA 度 C ( 卩 mol/L)=6.452(OD532-OD 6oo)-0.559D450十三、谷胱甘肽過氧化物酶( GSH k Px) 活力測(cè)定方法原理谷胱甘肽過氧化物酶( GSH-PX 是體內(nèi)存在的一種含硒清除自由基和抑制自由基反應(yīng)的系統(tǒng)。對(duì)防止體內(nèi)自由基引起膜脂質(zhì)過氧化特別重要，其活力以催化GSH 氧化的反應(yīng)速度，及單位時(shí)間內(nèi)GSH 減少的量來表示， GSH 和 5,5 ' -二 硫?qū)ο趸郊姿?( DTNB 反應(yīng)在 GSH-Px 催化下可生成黃色的5-硫代 2-硝基苯甲酸陰離子，于 423nm 波長(zhǎng)有最大吸收峰，測(cè)定該離子濃度，即可計(jì)算出GSH減少的量，由

38、于GSH 能進(jìn)行非酶反應(yīng)氧化，所以最后計(jì)算酶活力時(shí)，必須扣除非酶反應(yīng)所引起的GSH 減少。1、試劑和儀器儀器：可見光分光光度計(jì)、低溫高速離心機(jī)、恒溫水浴鍋、微量加樣器試劑：( 1) 疊氮鈉磷酸緩沖液pH7.0 : 分別稱取NaN16.25mg, EDTA-Ns7.44mg ,NaHPO1.732g,NaHPQ1.076g ，加入蒸餾水溶解至100mL 用少量HCL NaOH 調(diào)16叮叮小文庫(kù)pH7.0 ,4C 保存。(2) 1mmol/L 谷胱甘肽 ( 還原型 GSH 溶液：稱取 GSH 30.7mg 加疊氮鈉磷酸 緩沖液至 100mL 臨用前配制，冰凍保存 1-2 天。(3)1.25-1.5

39、mmol/L H2Q溶液：取30% H2Q 0.15mL-0.17mL ，用雙蒸水稀釋至 100mL 作為貯備液， 4C 避光保存，臨用前將貯備液用雙蒸水稀釋10 倍即可。（4） 偏磷酸沉淀液：稱取16.7gHPO （先用蒸餾水溶解），0.5gEDTA280gNaCI 加蒸餾水溶解至1000mL 用普通濾紙過濾，室溫保存。（5） 0.32mol/LNa 2HPO 溶液：稱取22.7gNa 2HPO 加蒸餾水至 500mL 室溫保存。（ 6） DTNB 顯色液：稱取 40.0mgDTNB 1.000g 檸檬酸三鈉加蒸餾水溶解至100mL 4 C 避光保存 1 個(gè)月。2、實(shí)驗(yàn)步驟13623.1樣品制備溶血液：取鼠血10 卩 l 加入到 1mL 雙蒸水中，充分振搖，使之全部溶血1:100 待測(cè)， 4h 內(nèi)測(cè)定酶活力。若當(dāng)天來不及測(cè)定，將肝素抗凝全血置-20 C 凍存， 3d 內(nèi)測(cè)定，