學(xué)生拷貝高效液相色譜法

1、.第四章高效液相色譜法（HPLC）high performance Liquid chromatography一 .高效液相色譜法的特點：1、高壓2、高效3、高速4、高靈敏度5、應(yīng)用廣泛HPLC與GC共同點：1、色譜的基本理論是一致的2、定性定量原理完全一樣HPLC與GC區(qū)別：1、流動相不同2、固定相不一樣3、儀器的結(jié)構(gòu)差別較大二 .高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)1.高壓輸液系統(tǒng)P.244(1) 貯液罐用于存放流動相，其位置要高于泵體，以便保持一定的輸液靜壓差，應(yīng)耐腐蝕，盡可能密閉，以防因溶劑易揮發(fā)而引起流動相組分的變化以及空氣中的 O2、CO2 等重新溶于已脫氣的流動相中。(2) 、高壓輸液泵P.24

2、5其產(chǎn)生高壓將流動相送入系統(tǒng)，所以對高壓泵有如下要求：a. 泵體材料能耐化學(xué)腐蝕；b. 能在高壓連續(xù)工作；c. 輸出流量范圍寬；d. 輸出流量穩(wěn)定，重復(fù)性高(3)梯度淋洗裝置P.2452.進(jìn)樣系統(tǒng)P. 246它將待分析的樣品注入系統(tǒng)進(jìn)行分析。目前主要采用六通閥為核心的額進(jìn)樣器，其有“進(jìn)樣 ”和 “取樣 ”兩個位置，當(dāng)處于“取樣 ”位置時，流動相不經(jīng)過樣品管，此時可打開進(jìn)樣口注入樣品到樣品管，封上進(jìn)樣口，然后切換到進(jìn)樣的位置，流動相就經(jīng)過樣品管沖洗樣品到色譜柱完成進(jìn)樣的動作。如果是自動進(jìn)樣器，則這一切將按程序自動完成取樣、進(jìn)樣、復(fù)位、樣品管路清洗等過程。3.分離系統(tǒng)（色譜柱）P.246色譜儀中的

3、分離核心，樣品在此完成分離，故其性能對分析結(jié)果起關(guān)鍵作用，其主要參數(shù)有填料的類型、柱子長度、內(nèi)徑的大小等。.4.檢測系統(tǒng)P.247主要用于監(jiān)測經(jīng)色譜柱分離后的組分濃度的變化，并由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)繪出圖譜來進(jìn)行定性和定量分析。理想的液相色譜監(jiān)測器應(yīng)具備如下特征：靈敏度高；對所有的溶質(zhì)都有響應(yīng)；響應(yīng)對流動相流量和溫度的變化都不敏感；不引起柱外譜帶擴展；線性范圍寬；適用范圍廣。常用的檢測器有紫外檢測器（UVD ）、示差折光檢測器（RID ）、電導(dǎo)檢測器（ECD）、熒光檢測器（ FD ）和蒸發(fā)激光散射檢測器（ELSD 等。5. 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)色譜分析結(jié)果 ,以前主要采用記錄儀和積分儀來處理作站來處理數(shù)據(jù)，大

4、大提高了工作效率和結(jié)果的準(zhǔn)確性。.現(xiàn)在幾乎都使用PC機結(jié)合色譜工三 . HPLC1.固定相分析常用的幾種色譜分離模式的原理和應(yīng)用流動相P.2502.高效液相色譜通常依據(jù)溶質(zhì)（樣品）在固定相和流動相分離過程的物理化學(xué)原理來分類，主要有以下幾種色譜分離模式：1)、吸附色譜2)、分配色譜3)、離子色譜4) 、體積排阻色譜 （凝膠色譜 ）5)、親合色譜法6)、手性色譜法2). 分配色譜(1) 正相色譜： 流動相極性 小，固定相極性 大(2) 反相色譜： 流動相極性 大，固定相極性 小各種色譜法的比較方法吸附色譜分配色譜離子色譜排阻色譜親合色譜項目固定相全多孔固體吸鍵合在基體上高效微粒離子具有不同孔徑鍵

5、聯(lián)在基體上附劑的鍵合相基團(tuán)交換劑的多孔凝膠的特異配位體流動相不同極性有機不同極性有機不同 PH 的緩沖有機溶劑或一可加改性劑的溶劑溶劑和水溶液定 PH 緩沖液PH 緩沖液分離原理吸附解吸溶解揮發(fā)可逆性離子交多孔性凝膠的鑰匙結(jié)構(gòu)絡(luò)合換滲透或過濾物可逆性離解平衡常數(shù)吸附系數(shù) K A分配系數(shù) K P選擇性系數(shù) K S分布系數(shù) K D穩(wěn)定常數(shù) KC主要應(yīng)用中等分子量的大多數(shù)的化合離子型化合物大分子的化合生物活性物質(zhì)脂溶性化合物物的分離與分的分離與分析物的分離和分的分離與分析析子量測定.四 . 建立高效液相色譜分析方法的一般步驟準(zhǔn)備工作想辦法得到各種信息向同行了解是否做過此類樣品，或有否類似樣品的分析方

6、法查文獻(xiàn)，如CA( 化學(xué)文摘 )儀器制造商的文獻(xiàn)對色譜柱有足夠的了解掌握分離機理，自己開發(fā)方法充分了解您自己的樣品靈敏度的要求有多高?樣品的本底是否很復(fù)雜?有多少組份要分析?對分析的精確度、準(zhǔn)確度等有多高要求?是否因是日常檢驗，而要求方法容易使用?要分離（即制備）的樣品量有多大?要分離的組份在樣品中的含量很高? 還是微量 ?是否需要保持生物活性?對分離產(chǎn)物純度的要求有多高?純度或活性的鑒定如何完成?1.選擇一種適當(dāng)?shù)纳V分離模式，見下圖。2.選擇一根合適的色譜柱，包括規(guī)格和填料類型.3.選擇適當(dāng)?shù)纳V分離條件，確定流動相的組成、流速及洗脫方法，進(jìn)行分離條件的優(yōu)化，實現(xiàn)下面的結(jié)果：在保證一定分離

7、度的條件下達(dá)到最快的分析速度。在保證分析時間的條件下對難分離物質(zhì)獲得最大的分離度。請記?。好看胃淖円粋€參數(shù)4.對獲得的色譜圖進(jìn)行定性和定量分析。樣品的預(yù)處理重要性占樣品分析時間的比例樣品預(yù)處理所用時間遠(yuǎn)大于色譜分離的時間占分析的消耗總成本最大消耗大量的溶劑及其他化學(xué)品實驗的重復(fù)性及準(zhǔn)確性最差的環(huán)節(jié)? 影響實驗結(jié)果好壞的最重要因素? 是決定性的步驟樣品預(yù)處理常用的方法高速離心 過濾、 超濾去除微粒高速離心過濾膜 /過濾裝置大于： 10,000g選擇性沉淀樣品 衍生反應(yīng)固相萃?。?SPE）技術(shù)液-固萃取/ 液 -液萃取Sep-Pak 樣品處理小柱濃縮樣品確認(rèn)回收率色譜分離模式的選擇.樣品分子量小于

8、 2000分子量大于 2000溶機 溶機 溶水溶 于溶于水溶 于劑 有于劑 有非非溶溶離離醇烷于于子子等等化化甲己RPRPRPIPRPNPICGPCICGPCACGFGFAC ：吸附色譜，NP：正相色譜，RP：反相色譜，IP：離子對色譜，IC ：離子色譜，GP：凝膠滲透色譜GF ：凝膠過濾色譜五 .HPLC分析常用小器具和基本使用方法1、溶劑過濾器對流動相進(jìn)行過濾的裝置， 同時也完成了脫氣， 主要由過濾瓶、 真空泵和至少 0.45um 孔徑的微孔濾膜組成。微孔濾膜有水系、有機系和兩用膜三種，兩用膜價格比較昂貴一些。使用時裝上相應(yīng)的濾膜， 連上真空泵， 從上面倒入待過濾流動相， 啟動真空泵直至過

9、濾完所需的流動相。2、脫氣裝置除用溶劑過濾器脫氣外， 還可用超聲波法和氦驅(qū)趕法對已過濾過的流動相進(jìn)行脫氣處理，操作都很簡單。3、樣品過濾器由于樣品的量較少，一般就用針頭過濾器和小體積的注射器來過濾樣品，針頭過濾器有直徑為 13mm 和 25mm 兩種規(guī)格。4、固相萃取小柱（SPE）主要在樣品預(yù)處理時用來去掉干擾的雜質(zhì)以及對目標(biāo)化合物的富集，隨著填料的發(fā)展，這種樣品預(yù)處理技術(shù)應(yīng)用越來越廣， 應(yīng)用效果越來越理想。在使用時， 首先詳細(xì)閱讀產(chǎn)品說明書，了解產(chǎn)品特性，結(jié)合自己的樣品的相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行條件試驗，找出最優(yōu)化的方法。5、預(yù)柱（保護(hù)柱）使用預(yù)柱可以達(dá)到在線富集、凈化樣品和保護(hù)色譜柱的作用，但同時也會

10、引起譜帶的擴寬，為盡可能降低擴寬程度，應(yīng)該使用與分析柱完全相同的填料填充預(yù)柱。.6、在線過濾器用來防止色譜柱堵塞而加在色譜柱前的一個過濾裝置，主要結(jié)構(gòu)就是一片孔徑為0.45um 的不銹鋼燒結(jié)過濾片，只起過濾作用，故應(yīng)定期清洗。六 .HPLC 基本故障的分析和處理方法1、每次使用時，開機后首先看看有沒有漏液的情況，在所有的連接頭部分都有可能，如果是泵頭漏液，就必須更換里面的密封圈， 如果是普通的接頭處漏， 緊一緊接頭即可，如仍不行就更換接頭。2、其次，看看壓力是否正常。如果壓力一直升高，說明系統(tǒng)有堵塞，這時最好先檢查色譜柱，方法是拆去色譜柱，開機看壓力情況， 如正常， 則說明色譜柱堵塞， 更換或

11、清洗色譜柱； 如仍升高， 則可能管路堵塞，應(yīng)從泵后開始按順序一段一段的檢查，清除相關(guān)問題。如果壓力升不上去或波動太大先看有無泄露情況，再看系統(tǒng)中有沒有氣泡，如有請先排氣泡；然后再檢查泵頭上的進(jìn)口單向閥和出口單向閥是否堵塞，如有堵塞請清洗或更換；最后再查泵的密封圈是否損壞，如壞則更換。3、然后，用流動相平衡色譜柱，檢測器預(yù)熱足夠長時間后，看基線是否平穩(wěn)，噪音是否太大。基線不穩(wěn)一般由下列因素引起：流動相流量波動；流動相組成發(fā)生變化；檢測器燈的能量不穩(wěn)；色譜柱尚未平衡好、色譜柱損壞或柱效下降等環(huán)境溫度變化太大；電源不穩(wěn)定，最好采用高性能的電源穩(wěn)壓器。4、 最后，進(jìn)樣分析.考察分析結(jié)果，看結(jié)果的重現(xiàn)性

12、如何，峰形如何。保留時間的重現(xiàn)性一般與流動相的穩(wěn)定性、色譜柱的性能等有關(guān)，而峰面積或峰高的重現(xiàn)性除了前兩者外，還與進(jìn)樣技術(shù)、檢測器性能等有關(guān)。峰形的好壞則主要與系統(tǒng)的死體積、色譜柱的性能、 色譜條件的選擇等有關(guān)。七 . HPLC 儀器的日常維護(hù)儀器的日常維護(hù)非常重要，其可避免故障的高發(fā)生率，提高儀器的使用率和工作效率。以下對高效液相色譜系統(tǒng)的各個部件的常規(guī)維護(hù)作一簡單的提示， 具體的做法最好詳細(xì)參考儀器說明書。1、貯液器 (清潔 .濾膜 .定期清洗）清潔是保持流動相貯液器正常使用的關(guān)鍵，要盡可能的使用HPLC 級的溶劑和試劑。含有緩沖鹽和非HPLC 級的流動相一定要經(jīng)過0.5um 的過濾膜過濾

13、以除去其中的微粒物質(zhì)。改變流動相是應(yīng)防止交叉污染， 陳舊的流動相和用久了的試劑應(yīng)定期廢棄或用適當(dāng)?shù)姆椒ū４?，避免微生物生長和組分的改變。貯液器內(nèi)壁要定期清洗。等等。2、泵（密封墊圈.鹽沉積 . HPLC 級試劑）.泵的密封墊圈是最易磨損的部件，其損壞可引起許多系統(tǒng)故障，一旦損壞只能更換，故應(yīng)采取以下措施來延長墊圈的壽命：每天要把泵中的緩沖鹽洗干凈，防止鹽沉積，泵要浸在無緩沖鹽的溶液或有機溶液中；盡量用 HPLC 級試劑；溶液管前用燒結(jié)不銹鋼沉子以過濾微粒物質(zhì)。 另外，要防止因系統(tǒng)堵塞而導(dǎo)致的高壓使柱塞杠折斷或燒毀電機。3、進(jìn)樣器停機后要沖洗干凈進(jìn)樣器內(nèi)殘留的樣品或緩沖鹽， 防止鹽沉積和樣品微粒

14、造成閥轉(zhuǎn)子面磨損或堵塞，對于手動進(jìn)樣器應(yīng)避免尖針頭進(jìn)樣，防止密封墊損壞。4、色譜柱主要是防止色譜柱性能的下降，應(yīng)做到：溶劑的化學(xué)腐蝕性不能太強；避免微粒在柱頭沉積；系統(tǒng)的壓力不能太大；流動相的 PH 值應(yīng)在色譜柱正常使用的PH最好在柱前使用在線過濾器或加保護(hù)柱；使用合理的方法清洗色譜柱；根據(jù)色譜柱所附的說明書的要求正確保存長范圍內(nèi)；期不用的柱子。色譜柱保護(hù)? 使用保護(hù)柱? 儀器在使用完畢，要沖洗整個系統(tǒng)移走系統(tǒng)中緩沖液? 過濾所有的溶劑和樣品? 柱子在不使用時，兩端密封保存? 在適當(dāng)?shù)娜軇┲斜４嬷? 注意色譜柱的 pH 值使用范圍? 不要高壓沖洗柱子? 不要高溫下過長時間使用硅膠鍵合相5、檢

15、測器要保持檢測器的清潔，每天用后連同柱子一起沖洗。提倡不定期用強溶劑反向沖洗檢測池（先拆開柱子，再反接） 。防止氣泡卡在池內(nèi)。注意有效利用檢測器的燈源，不用時不要開燈（預(yù)熱時除外） 。八 .HPLC定性分析和定量分析的方法定量分析誤差定量分析誤差主要由下面各過程中的失誤引起：（與GC的方法相同）樣品的準(zhǔn)備： 取樣不具代表性；配制樣品的溶劑不合適；等。進(jìn)樣技術(shù)： 進(jìn)樣器的結(jié)構(gòu)， 操作人員進(jìn)樣技術(shù)的熟練程度，儲藏樣品不當(dāng)及預(yù)處理不合理進(jìn)樣量的大小等都對色譜分析的結(jié)果有影響。.色譜柱的穩(wěn)定性：物理強度好、色譜性能穩(wěn)定的固定相可以減小誤差。流動相的穩(wěn)定性：流速穩(wěn)定、流動相的組成穩(wěn)定有利于減小誤差。檢測

16、器的特性：靈敏度、噪音、線性特性、響應(yīng)信號波動都會導(dǎo)致誤差。分離度：其主要影響峰高和峰面積測量的準(zhǔn)確度從而導(dǎo)致誤差。峰高法和峰面積法的選擇： 定量方法的選擇既能影響準(zhǔn)確度， 又能影響精確度， 下表對兩種方法的選擇進(jìn)行總結(jié)。色譜分析時遇到的問題流量波動流動相組成變化溫度波動色譜柱超負(fù)荷分離度小峰嚴(yán)重拖尾檢測器時間常數(shù)太大色譜柱柱效下降定量方法的選擇峰高峰面積峰面積峰面積峰高峰面積峰面積峰面積九 .摸索 HPLC 測定新方法的一般程序（ . 建立高效液相色譜分析方法的一般步驟）準(zhǔn)備工作想辦法得到各種信息向同行了解是否做過此類樣品，或有否類似樣品的分析方法查文獻(xiàn)，如CA( 化學(xué)文摘 )儀器制造商的文

17、獻(xiàn)對色譜柱有足夠的了解掌握分離機理，自己開發(fā)方法充分了解您自己的樣品? 1、資料的收集? 2、所需實驗用具的準(zhǔn)備? 3、色譜條件的摸索（對標(biāo)準(zhǔn)品） 。? 4. 樣品預(yù)處理方法的摸索? 5、色譜條件的進(jìn)一步摸索（對樣品） ? 6、方法學(xué)鑒定。? 7、方法驗證十 . 樣品預(yù)處理物理法： 1、過濾法化學(xué)法： 1.萃取法2、稀釋法2、蒸餾法3、濃縮法3、衍生法4、離心法4.皂化法5、粉碎法5.水解法6、膜分離法6.沉淀法等.例如：應(yīng)用高效液相色譜法分析維生素之一維生素色譜法與分離柱分離條件備注維生素 A反相色譜、 ODS-18柱流動相：甲醇水， 98 2。流速： 1ml/min 。熒測定視黃醇光檢測器

18、： EX ： 325nm,EM:470nm ，或紫外檢測器： 325nm。維生素 A正相色譜、 Si-60 柱流動相：正已烷與正丁醇98 2。流速： 2ml/min 。 測定全 -反式 - 和熒光檢測器： EX ： 325nm， EM ：475nm。13-順式 -視黃醇 -胡蘿卜反相色譜、 ODS-18柱流動相：乙腈、甲醇和二氯甲烷。 75/20/5。流速：測 定全 - - 胡1.5ml/min 。紫外檢測器： 450nm。蘿卜維生素 D正相色譜、 Si-60 柱流動相：正已烷異丙醇 991。流速：測定總維生素 D1.5ml/min 。紫外檢測器： 265nm。維生素 D反相色譜、 ODS-1

19、8柱流動相：甲醇水， 98 2，流速： 1ml/min 。紫可測定維生素外檢測器： 265nm。進(jìn)樣量： 20ul/ 次D2和D3維生素 D正相色譜與反相色譜流動相：正已烷異丙醇99 1（正相），甲醇可排除樣品雜質(zhì)結(jié)合使用水，98 2（反相），進(jìn)樣量：200ul/次（正相）， 20ul/干擾，準(zhǔn)確定量次（反相），紫外檢測器： 265nm。維生素 K反相色譜、 ODS-18柱流動相：乙腈甲醇水、70 22 8，流速：測定維生素 K12ml/min 。紫外檢測器： 270nm。進(jìn)樣量： 25ul/ 次5色譜條件色譜條件1：1色譜柱：普通ODS C18 柱（ 4.6× 250mm， dp

20、5um） ;2流動相：乙腈：四氫呋喃75:253流速： 1ml/min4檢測波長：453nm色譜條件2：1色譜柱： Waters 胡蘿卜專用柱（4.6× 250mm， dp 5um ）2流動相：叔丁基甲醚：甲醇：水49:50:43流速： 1ml/min4檢測波長：453nm色譜學(xué)作業(yè)1. 色譜法定性和定量的依據(jù)是什么？2. 什么叫程序升溫？它有什么作用？3. 什么叫梯度洗脫？它有什么優(yōu)點？4為什么用分離度R 作為色譜柱的總分離效能指標(biāo)？5. 根據(jù)速率理論， 色譜柱的板高 H 由哪些因素決定？試給出最佳流動相流速 U 最佳和最小板高 H 最小的計算公式。6. 以固定相和流動相的極性及組

21、分出峰順序說明什么是正相色譜和反相色譜。.7. 試比較高效液相色譜法與氣相色譜法這兩種分析法之間的異同，并做簡要說明。8. 在一根 3m 長的色譜柱上分離一樣品，空氣出峰的時間為1min ，組分 1 和組分 2 的保留時間分別為14 和 17min ，其中組分2 峰底寬度為1min 。試計算： (1) 該色譜柱分離組分2的理論塔板數(shù)；(2) 若完全達(dá)到分離，所需的最短柱長為幾米？1.高效液相色譜儀一般分為幾個部分？從儀器構(gòu)造、分離原理、 應(yīng)用范圍等方面比較氣相色譜與液相色譜的異同點。2. 在液相色譜中，提高柱效的途徑有哪些？其中最有效的途徑是什么？氨基酸自動分析儀（專一的HPLC離子交換色譜）

22、在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用很廣1。氨基酸 - 含有氨基和羧基的有機化合物蛋白質(zhì)由20 種氨基酸以不同長短和不同排列組合而成，因此自然界蛋白質(zhì)的種類是個天文數(shù)字。組成蛋白質(zhì)的氨基酸有20 種自然界 AA 有上百種（衍生AA ，牛黃酸等）八種體內(nèi)不能合成的，必須由食物供給的必須AA-賴AA，色AA ，異亮AA ，亮AA ，苯丙 AA ，蛋 AA ，蘇 AA ，頡 AA 。賴 AA 是動物營養(yǎng)中的第一限制AA （如缺其，其它AA 再多也是浪費。 ）游離狀態(tài)氨基酸- 生理體液：血液，尿液，植物細(xì)胞液等。2等電點： - 蛋白質(zhì)分子內(nèi)陰，陽電荷相等時的PH值兩性離子的正，負(fù)電荷相等呈中性，偶極離子酸性氨基酸：堿性氨基酸

23、：-COOH 羧基>-NH +2-COO-<NH2+氨基3構(gòu)成蛋白質(zhì)氨基酸的等電點，從2-10 范圍，決定于其結(jié)構(gòu)，氨基酸是兩性物質(zhì)，在不同 PH 值，處于不同物質(zhì)狀態(tài)氨基酸經(jīng)典定量分析法：茚三酮+氨基酸 - 亞氨酸（柱后衍生）（天藍(lán)色復(fù)合物）顏色深淺與氨基酸含量成正比.570NM440 NM （脯氨酸，羥脯氨酸）可見光檢測器(紫外，熒光檢 測器）4分析原理：HPLC離子交換色譜流動相： PH 值不同的緩沖溶液柱子：帶磺基（SO 3）的陽離子（ Na+）交換樹酯分析過程：用PH=2.2HCL溶解樣品，比所有 AA 的等電點都要低有利于（ -NH2 ）電離，不利于（-COOH ）電離所有 AA 呈酸性解離