淺論沙眼衣原體主要外膜蛋白生物信息學(xué)分析

1、淺論沙眼衣原體主要外膜蛋白生物信息學(xué)分析               作者：朱珊麗，尤孫武，婁崇潔，龔紅君，張麗芳【摘要】  目的：分析和預(yù)測(cè)E血清型沙眼衣原體(Ct)主要外膜蛋白(MOMP)的結(jié)構(gòu)和功能。方法：采用計(jì)算機(jī)輔助生物軟件和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，從SwissProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中檢索MOMP氨基酸序列，用Expasy服務(wù)器分析預(yù)測(cè)MOMP蛋白理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí)用Pcons服務(wù)器分析模擬蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)。結(jié)果：分析顯示，Ct MOMP蛋白為一跨膜16次

2、的酸性蛋白質(zhì)，其空間結(jié)構(gòu)為-桶狀膜蛋白，推測(cè)其功能為孔蛋白。結(jié)論：通過對(duì)MOMP生物信息學(xué)分析獲得該蛋白的特性，為進(jìn)一步研究Ct的感染與發(fā)病機(jī)制、研制Ct亞單位疫苗以及研究MOMP新的功能域等提供理論依據(jù)。 【關(guān)鍵詞】  沙眼衣原體；主要外膜蛋白；生物信息學(xué)；結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)   Abstract:  Objective: To analyze and predict the structural characteristics of the major outer membrane protein (MOMP) of Chlamydia trachomatis

3、 (Ct) serovar E. Methods: From SwissProt database，amino acid sequences of MOMP were obtained. Physio-chemical properties，secondary structure and tertiary structure of MOMP were analyzed by the computational analysis and bioinformatics webs，Expasy and Pcons，respectively. Results: The results showed t

4、hat Ct MOMP was an acidic protein which transmembrane 16 times， and the tertiary structure was -barrel membrane protein. It probably acted as a porin. Conclusion: The characteristics of Ct MOMP can be obtained by online structure predication software and computational analysis， which provides scient

5、ific proof for the research on its pathogenesis and new subunit vaccines.   Key words:   Chlamydia trachomatis；MOMP；bioinformatics；structure prediction   沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）具獨(dú)特的發(fā)育周期，有原體（Elementary Body）和網(wǎng)狀包涵體（Reticulate Body）兩種形式。其獨(dú)特的生命周期是原體感染細(xì)胞發(fā)育為網(wǎng)狀包涵體，包涵體再

6、分裂為原體釋放，進(jìn)而再次感染細(xì)胞的循環(huán)過程1。Ct是一種在人體內(nèi)長期生存并又廣泛傳播的病原體，是我國性傳播疾病（sexually transmitted diseases，STDs）的主要病原之一，它在一定條件下能引起異位妊娠、早產(chǎn)、流產(chǎn)及尿道感染等多種疾病。研究發(fā)現(xiàn)，Ct感染尚與許多自身免疫疾病發(fā)病有關(guān)，如衣原體感染后可引起反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、Reiter綜合征等。目前，尚無Ct感染的特異性預(yù)防方法，由于其主要外膜蛋白(major outer membrane protein，MOMP)可在機(jī)體內(nèi)誘導(dǎo)出較強(qiáng)的細(xì)胞免疫及產(chǎn)生中和抗體的體液免疫，已成為Ct疫苗的研究熱點(diǎn)3-4，但Ct MOMP的蛋白特

7、性及其主要功能至今尚不清楚。本研究以E血清型Ct MOMP氨基酸序列為基礎(chǔ)，對(duì)MOMP蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究Ct的感染與發(fā)病機(jī)制以及Ct亞單位疫苗的研制等提供理論依據(jù)。   1  材料和方法   1.1  材料  國際互聯(lián)網(wǎng)的生物信息學(xué)資源：SwissProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫、Expasy服務(wù)器、PDB數(shù)據(jù)庫、Pcons服務(wù)器、Spdbv及Rasmol軟件。E血清型Ct MOMP在NCBI的登記號(hào)為DQ064286。   1.2  方法  E血清型Ct MOMP氨基酸序列檢

8、索自瑞士生物信息研究所提供的SwissProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，使用Expasy中的GOR和ProtParam模塊分析后，將Ct MOMP氨基酸序列提交到Pcons服務(wù)器，得到初步的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果。返回的結(jié)果優(yōu)化后用Spdbv及Rasmol軟件進(jìn)行分析。    2  結(jié)果   2.1  Ct MOMP的理化性質(zhì)  ProtParam 分析顯示該蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為42.4 kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為5.07，具體氨基酸組成見圖1，推測(cè)分子式為C1874H2916N498O583S21；不穩(wěn)定系數(shù)(instabili

9、ty index，II)為25.82，表明此蛋白性質(zhì)穩(wěn)定；其疏水性平均值（Grand average of hydropathicity，GRAVY）為-0.088，表明其為親水性蛋白。   2.2  Ct MOMP二級(jí)結(jié)構(gòu)分析  應(yīng)用Expasy服務(wù)器上的GOR預(yù)測(cè)MOMP的二級(jí)結(jié)構(gòu)，提示其二級(jí)結(jié)構(gòu)由29.77%-螺旋（Alpha helix，Hh）、18.22%-片層（Extended strand，Ee）、51.91%無規(guī)卷曲（Random coil，Cc)構(gòu)成，見圖1。二維結(jié)構(gòu)顯示MOMP蛋白有16個(gè)-片層組成的跨膜區(qū)，見圖2。 

10、60; 2.3  Ct MOMP三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬  將其氨基酸序列導(dǎo)入Pcons服務(wù)器，返回的結(jié)果按照分值排序，選擇Pcons和ProQ分值較高的返回?cái)?shù)據(jù)，將其導(dǎo)入Spdbv及Rasmol軟件中，分析推測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示Ct MOMP與腦膜炎奈瑟菌自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)非常相似，兩者都是主要由折疊片層蛋白組成的桶狀結(jié)構(gòu)。Ct MOMP有2個(gè)螺旋，16個(gè)折疊，23個(gè)轉(zhuǎn)角和190個(gè)氫鍵；而來自于PDB數(shù)據(jù)庫（PDB ID:1UYN）的腦膜炎奈瑟菌自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)域，有1個(gè)螺旋，12個(gè)折疊，33個(gè)氫鍵，沒有轉(zhuǎn)角，見圖3。     

11、       3  討論   生物信息學(xué)（bioinformatics）是一門數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、計(jì)算機(jī)與生物醫(yī)學(xué)交叉結(jié)合的新興學(xué)科，它已廣泛地滲透到醫(yī)學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域中，成為生物醫(yī)學(xué)發(fā)展不可缺少的重要組成部分。 隨著人類基因組計(jì)劃的快速發(fā)展，生物信息學(xué)技術(shù)在人類疾病與功能基因的發(fā)現(xiàn)與識(shí)別、基因與蛋白質(zhì)的表達(dá)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能等研究方面都發(fā)揮著重要的作用。 目前許多生物信息學(xué)的分析軟件和數(shù)據(jù)庫可以通過Internet免費(fèi)獲取，已在很多實(shí)驗(yàn)室普及應(yīng)用。 生物信息學(xué)分析可以對(duì)核酸、蛋白質(zhì)等序列進(jìn)行全面、綜合地分析，且分析速度

12、快、效率高，同時(shí)可以節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本，降低人工勞動(dòng)強(qiáng)度，避免實(shí)驗(yàn)的盲目性等。E血清型Ct是國內(nèi)報(bào)道的性病高危人群生殖道標(biāo)本中最常見的血清型，因此我們選擇E血清型Ct MOMP作為本實(shí)驗(yàn)的目的蛋白，分析其結(jié)構(gòu)和功能。   對(duì)MOMP一級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，每個(gè)MOMP分子含有9個(gè)半胱氨酸(Cys)，二硫鍵使這些Cys廣泛交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，用以維持外膜結(jié)構(gòu)的堅(jiān)韌性，從而增強(qiáng)抗機(jī)械作用能力，穩(wěn)定滲透壓。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示MOMP含有16個(gè)-片層組成的跨膜區(qū)，4個(gè)可變區(qū)均位于膜外。MOMP與其他一些革蘭氏陰性菌如腦膜炎奈瑟菌、大腸桿菌外膜蛋白中的孔蛋白（porin）在氨基酸的組成上極為相似，具

13、體表現(xiàn)在：細(xì)胞膜上含量豐富，MOMP占外膜總蛋白的60%以上，與腦膜炎奈瑟菌、大腸桿菌外膜蛋白在細(xì)胞膜上含量豐富相一致；分子量范圍相近，MOMP為41 kDa，腦膜炎奈瑟菌自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為32 kDa，大腸桿菌外膜蛋白為37k Da，皆處于3050k Da范圍；疏水氨基酸含量相對(duì)較低，MOMP為36.6%，腦膜炎奈瑟菌自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為44.2%，大腸桿菌外膜蛋白為40.4%。以上特點(diǎn)提示沙眼衣原體MOMP極有可能成為其自身的跨膜通道孔蛋白7-11。國外學(xué)者Wyllie等10通過膨脹試驗(yàn)（Swelling Assay）證實(shí)了MOMP具有控制外膜通透率的功能。衣原體是一種活細(xì)胞寄生的病原體，本身缺乏供代謝

14、所需的能量，必須利用宿主細(xì)胞的三磷酸鹽和中間代謝產(chǎn)物作為能量來源。為了達(dá)到這種目的，MOMP在RB繁殖期執(zhí)行孔蛋白的功能，源源不斷地向衣原體輸送大量營養(yǎng)物質(zhì)，如Na+、ATP等。由于EB外膜蛋白中存在著大量交聯(lián)的二硫鍵，使得物質(zhì)難以通過外膜；但當(dāng)EB轉(zhuǎn)換為RB后，二硫鍵發(fā)生改變，膜通透性增強(qiáng)，營養(yǎng)物質(zhì)的輸送增加，有利于Ct的繁殖，因此，MOMP執(zhí)行孔蛋白功能的活性主要發(fā)揮在RB期。Sun等11通過liposome swelling實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在衣原體外膜上存在許多直徑約2 nm的小孔，其形成主要是由MOMP形成一種放射狀的小通道。在這點(diǎn)上MOMP功能類似于腦膜炎奈瑟菌的自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和大腸桿菌的孔

15、蛋白o(hù)mpF。由于MOMP在外膜上含量達(dá)60%以上，因而這種小通道在營養(yǎng)物質(zhì)內(nèi)外交換方面仍起著非常重要的作用。   由于Ct培養(yǎng)具有一定的技術(shù)難度，且MOMP蛋白純化困難，阻礙了MOMP天然空間結(jié)構(gòu)和功能的研究，未能在PDB數(shù)據(jù)庫中檢索到有關(guān)Ct MOMP的結(jié)構(gòu)與功能等生物信息。我們利用Pcons服務(wù)器，經(jīng)Spdbv分析后，預(yù)測(cè)分析MOMP蛋白的三維結(jié)構(gòu)模式圖為-桶狀膜蛋白，蛋白理論pI值為5.07，不穩(wěn)定系數(shù)為25.82。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究MOMP結(jié)構(gòu)和功能、致病機(jī)制及其亞單位疫苗研制等提供了理論基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Moulder JW. Intera

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