流式細胞術(shù)樣本制備.

1、樣本制備實例：纟田胞表面蛋白熒光染色 (Im muno fluoresce nee Staining原理：對細胞表面蛋白質(zhì)的染色可以分為直接染色 (DIF和間接染色(IIF兩種。直接 染色是指用直接聯(lián)有熒光的抗體染色；而間接染色則是采用一級抗體和蛋白先結(jié)合， 然后再用帶有熒光的與一級抗體有親和力的二級抗體進行染色。熒光染色的方法 在蛋白質(zhì)檢測 中使用非常普遍，因為只要采用合適的抗體，幾乎任意的蛋白都可以用 指定的熒光標記。但是由于各種蛋白表達的強度和熒光染料自身熒光強度不同，以及臨近通道串色的問題，多色實驗的基本原則是：最強的染料配表達最弱的蛋白，最 弱的染料配表達最強的蛋白；如果使用染料的數(shù)

2、量不大則應(yīng)盡量避免使用臨近通 道。還需要考慮染料之間的溢漏、以及偶聯(lián)染料已降解的問題?，F(xiàn)出現(xiàn)了 405nm的激光激發(fā)的新型染料如 BV421、BV605等為多 色實驗提供了更多的選擇空間。材料：?被檢測細胞FACS Lysing Solution (細胞裂解液,1倍或10倍,10倍的要先稀釋到1倍后使用?相應(yīng)的蛋白熒光染色抗體 (e.g. CD4 FITC, CD8 PE, CD3 APC步驟：1. 在100毎外周血加入抗體：a. 同型對照:PB 100 k+Isotope FITC 20 L+Isotope PE 20 L+Isotope APC 5 L 卩b. 單陽管:PB 100 L +

3、CD4 FITC 20 L+lsotope PE 20 L+Isotope APC 5 L ic. 單陽管:PB 100 L +Isotope FITC 20 L+CD8 PE 20 L+ Isotope APC 5 L id. 單陽管：PB 100 h+lsotope FITC 20 L+ (sotope PE 20 L+QD3 APC 5 丄e. 樣品管:PB 100 L +CD4 FITC 20 L+CD8 PE 20 L+CD3 APC 5 丄2. 避光 15mi n3. 在每管中加入2mL裂解液，室溫下避光孵育10min4. 將裂解好的外周血離心1200rpm , 5mi n，去上清

4、液5. 加入2mL鞘液，混勻6. 離心1200rpm , 5min，去上清液7. 加入500 h鞘液，混勻8. 3小時內(nèi)上機（如果不能立刻上機,2? C -8? C避光保存樣本對照：a. 同型對照（和使用的抗體同源、同亞型、同熒光標記:Isotope*3b. 單陽 CD4 加 Isotope PE & APCc. 單陽 CD8 加 Isotope FITC & APCd. 單陽 CD3 加 Isotope FITC & PE細胞周期（Cell Cycle原理：細胞在有絲分裂的過程中，核內(nèi)的DNA會進行復制，造成DNA含量的波動。如 果把 處于G0/1期的細胞的DNA含量看做1倍的話，處于G2/

5、M期的細胞的DNA 含量則為2倍。熒光染料propidium iodide （PI是一種核染料。因為每一個 PI分子 只能插在兩組相鄰的 堿基對中，所以PI染料的熒光強度與被染的 DNA的數(shù)量成正 比。根據(jù)PI的這種特性，我們常常用它來揭示細胞內(nèi)DNA倍性的關(guān)系，從而推導出 細胞所處的周期。然而，流式細胞術(shù)只能檢測在某一時刻穿過激光的細胞的熒光強度，但無法直接 判斷在這一時刻到底穿過了幾個細胞。如果有細胞粘在一起或是正巧同時穿過激 光，流式細胞儀則會讀取其整個熒光強度，從而導致對單個細胞DNA含量測定上的 誤差。為了解決這 個問題，我們常常做一張以FL2-W和FL2-A分別為橫縱坐標的 散點圖

6、。FL2-W指的是第二通道（PI里該細胞通過時的時間，而FL2-A指的是第二 通道里該細胞的總熒光強度。當細胞粘聯(lián)時，期總體積與質(zhì)量變大，導致通過激光時 間變長，所以FL2-W的值會比單個細胞大出很多。通過這種方式，我們可以將FL2- W比較統(tǒng)一（小的細胞用門圈出，以排除粘聯(lián)體,從而確保周期分析的準確性（如下圖 所示。然后我們就可以在 FL2-A的直方圖 上直觀地對細胞倍性進行分析了。DEBRIS/DIPLOID CONTINUUMIAGGREGATES SINGLE CELLSDEBRIS02004006008001000FL2-WW :1hDEBRIS/DIPLOID CONTINUUMA

7、GGREGATES* SINGLE CELLS材料:?被檢測細胞?FACS Lysing Solution (細胞裂解液,1倍或10倍,10倍的要先稀釋到1倍后使 用?BD CycletestTM Plus DNA Reage nt Kit (340242TSolutio n A (10mL 1 “ryps in in Sperm ine Tetrahydrochloride Deterge nt BufferSolution B (8mL 1 孤Nase A and trypsin Inhibitor in Spermine Buffer?Solution C (8mL x 1 (Propi

8、dium Iodide (PI in Spermi ne Buffer ?Buffer Solution (50mL X (DMSO in Sucrose-Sodium Citrate注意:Solution A, B, C中含有sperm ine tetrahydrochloride對皮膚和粘膜有刺激 性；Solution C中PI有毒,并具有潛在的致癌性；Buffer Solution中含有DMSO ,具有潛在的致畸性。操作時戴手套，注意避免眼睛，皮膚和衣服與以上試劑的接觸。Solution A 和 B 在室溫下使用(20? C-25? C , Solution C 要在 2? C -8?

9、C 下避 光保存。步驟：1. 在200毎外周血加入2mL裂解液，室溫下孵育10min2. 將裂解好的外周血離心1200rpm , 5mi n，去上清液3. 加入2mL鞘液，混勻(如不含紅細胞樣本無需裂紅，從此步驟開始，取106細胞4. 離心1200rpm , 5min，去上清液5. 加入250 L Solution A,輕輕混勻（不要渦旋，室溫下孵育10min6. 加入200 L Solution B,輕輕 混勻（不要渦旋 室溫下 孵育10min7. 加入200 L Solution C,混勻,在冰上或者冰箱里避光孵育 10mi n8. 將樣本用35-50 m的濾網(wǎng)（300目過濾9. 3小時內(nèi)

10、上機（如果不能立刻上機,2? C -8? C避光保存樣本對照：1內(nèi)參:樣本內(nèi)含有已知倍性的細胞亞群2外參（optio nal :同類已知倍性的細胞。細胞凋亡（Apoptosis原理：細胞程序性死亡/凋亡（apoptosis是機體移除不需要的細胞的一種常見的機制。 細胞凋亡早期的標記之一是 PS （phosphatidylseri ne自胞膜內(nèi)表面到外表面的轉(zhuǎn)移。 Annexin V （AV和PS有很強的親和力，所以被熒光標記后常常在流式中被用來檢測 外翻的PS。在細胞凋亡后期，細胞膜常常會破裂。這種現(xiàn)象在流式中可以用 propidium iodide （PI檢測。PI是一種核染料。當細胞膜完整

11、時，PI無法穿透胞膜，故 無法對細胞核進行 染色。AV與PI共同使用時,可以對細胞凋亡的各個時期進行檢 測:正?；罴毎@示AV和PI的共陰性;早凋細胞顯示AV陽性和PI陰性;晚凋細胞 則顯示AV和PI的雙陽性。然而,可以被AV和PI共同染色的細胞并不一定處于凋亡晚期。壞死的細胞在 晚期也會被AV和PI共同染色。所以要想做到對細胞凋亡精確的檢測則需要對整 個凋亡過程進行監(jiān)測，即AV陰性& PI陰性AV陽性& PI陰性AV陽性& PI 陽性。材料:?被檢測細胞?BD Pharmi ngenTM FITC Ann exin V Apoptosis Detectio n Kit I (556547?I

12、OX Ann exi n V Bi nding Buffer (50mL1 51-66121E ?FITC Ann exi n V (AV(0.5mL 1 51-65874X ?Propidium Iodide (PI Staining Solution (2.0mL-66211EX 1 51注意：PI有毒,并具有潛在的致癌性。操作時注意安全，要戴手套。步驟：1. 將10倍的Ann exin V Bi ndi ng Buffer稀釋為1倍(將1容積的Buffer加到9容積的蒸餾水中2. 用冷PBS把細胞溶液清洗2次(離心1200rpm/5min -去上清液 +2mLPBS 混勻離心1200rp

13、m/5mi n 去上清液 +2mL PBS 混勻離心 1200rpm/5mi n 去上清液3. 將清洗好的細胞加入 1倍Ann exin V Bi ndi ng Buffer中(終濃度106細胞/mL4. 在5mL的流式管中加入100毎步驟3的細胞溶液(應(yīng)含105細胞5. 在每一管樣本溶液中加入 5 L的FITC Ann ex in V和5 L的PI6. 將溶液輕輕地震蕩后，避光在室溫下(25? C孵育15min7. 加入 400 毎1 倍 Annexin V Binding Buffer8. 在1小時內(nèi)上機對照：1. 未染色細胞(全陰2. 單染 FITC Ann ex in V3. 單染PI

14、4. 正常細胞（未經(jīng)凋亡藥物處理加 AV和PI6-C TBNK 檢測原理：人類的淋巴細胞按照表面抗原的表達可以被分成三大類:T細胞（CD3+, B細胞（CD19+和NK細胞（Natural Killer自然殺手（CD16+CD56+。這些淋巴細胞表面還會 表達一些其他的抗原。根據(jù)這些抗原的表達，我們可以做出對某些疾病的檢測和診 斷。例 如:CD3+CD4+淋巴細胞的比例和絕對數(shù)量是檢測 HIV階段的重要指標（隨 著HIV的加重，患者血液中CD3+CD4+淋巴細胞的數(shù)量會逐漸減少；CD3+CD4+淋 巴細胞的比例和絕對數(shù)量以及T細胞和B細胞的總量也常常是診斷其他免疫缺失 疾病和自免疫疾病的依據(jù)；

15、表達CD3-CD16+/CD56+的NK細胞往往對某些腫瘤細胞 和被病毒感染的細胞有殺傷力，所以其數(shù)量是個體對該癥狀抵抗力的量化表達。BD MultitestTM 6-color TBNK 試劑是為 BD FACSCantoTM 和 BDFACSCantoTM II設(shè)計的專 門測量T , B和NK細胞比例與總數(shù),T細胞CD4和CD8亞群的試劑。（各類細胞絕對數(shù) 的統(tǒng)計需使用BD Trucount的計數(shù)管。材料:?外周血?BD MultitestTM 6-color TBNK Reage nt with BD Trucou nt Tubes (337166 或?BDMultitestTM 6-c

16、olor TBNK Reage nt without BD Trucou nt Tubes (644611o CD3 FITC (T細胞檢測o CD16 & CD56 PE (NK 細胞檢測o CD45 PerCP-Cy5.5淋巴細胞分群o CD4 PE-Cy7 （T助細胞檢測o CD19 APC （B細胞檢測o CD8 APC-Cy7 （細胞毒性T細胞亞群檢測注意:試劑中含有疊氮化鈉作為防腐劑，請勿吞食。步驟：1. 把50皿外周血加入上樣管中。（可以使用一般的流式管 也可以是Trucount管子。如果使用Trucount的管子，則要確保底部的微粒的完整性。使 用Trucount可以算比例和絕

17、對計數(shù)，使用一般流式管只能算比例2. 在樣本中加入20 “BD MultitestTM 6-color TBNK 試劑，用移液槍混勻。3. 避光在室溫下孵育15mi n。4. 避免直射光，在樣本中加入450 L 一倍的FACS lysing solution（裂解液,混勻。5. 避光在室溫下孵育15mi n。6. 6小時（避光室溫內(nèi)上機。注意:上機前 FACSCa no 或 FACSCa ntoll 要先用 BD FACS 7-color setup beads（335775調(diào)質(zhì)控。檢測結(jié)果實例:1N8_L04yui :w JololV* lw jcajMQSJIOG? s 30_fei _s

18、s 運殺i# US55 s 總S=EOEada.1tEra-lgQn EUEX 塔“aBnE 3IWP 0 xqes * JmAHs二$* s 囂kllmokuyhl *0Er 43i3 war s #fanWE Es.ri- 尊 fs科m8S s- 1- 0k-fttoo-713peulfr-imeb.ZN JQ-EJIaBAI 2- S5HWwzBl b-sJ I s e M p4aQcrodB PSUU5 QM _ra _B eirp 亠口 Q-OE3Ai3K1JUoO0aO5HI5T2e黑g&1ire8.林 a7E掃Vir7.ILs 二 孚 s0 # STSX 8nJ Jo-HBD M

19、ultitestTM IMK 試劑是為 BD FACSCaliburTM , BD FACSCantoTM 和 BDFACSCanto TM II設(shè)計的專門測量T , B和NK細胞比例與總數(shù)的試劑。(各類 細胞絕對數(shù)的統(tǒng)計需使用BD Trucount的計數(shù)管。材料：?外周血?BD MultitestTM 4-color TBNK Reage nt with BD Trucou nt Tubes (340504o BD Multitest? CD3 FITC / CD8 PE / CD45 PerCP / CD4 APC reage nto BD Multitest CD3 FITC / CD1

20、6 PE + CD56 PE / CD45 PerCP / CD19 APC reage nt o BD FACS? Lysi ng Solutiono BD Truco unt? tubes或?BD MultitestTM 4-color TBNK Reage nt without BD Trucou nt Tubes (340503o BD Multitest? CD3 FITC / CD8 PE / CD45 PerCP / CD4 APC reage nto BD Multitest CD3 FITC / CD16 PE + CD56 PE / CD45 PerCP / CD19 AP

21、C reage nt oBD FACS? Lysi ng Solution注意:試劑中含有疊氮化鈉作為防腐劑，請勿吞食。步驟：1. 每一管病人的樣品準備兩個空的流式管，標記為A和B。2. 在A和B管中各加入50皿外周血。（可以使用一般的流式管，也可以是Trucount管子。如果使用Trucount的管子，則要確保底部的微粒的完整性。使 用Trucount可以算比例和絕對計數(shù)，使用一般流式管只能算比例3. 在A樣本管中加入10 0BD MultitestTM CD3/CD8/CD45/CD4 試劑,用移液 槍混勻。4. 在 B 樣本管中加入 10 虹BD MultitestTM CD3/CD16

22、+CD56/CD45/CD19 試 劑，用移液槍混勻。5. 避光在室溫下孵育15mi n。6. 避免直射光，在樣本中加入450 L 一倍的FACS lysing solution（裂解液，混勻。7. 避光在室溫下孵育15mi n。8. 6小時（避光室溫內(nèi)上機。注意:上機前 FACSCa no 或 FACSCa ntoll 要先用 BD FACS 7-color setup beads （335775調(diào)質(zhì)控。Calibur 要用 BD Calibrite3 和 APC beads（340486, 340487調(diào) 質(zhì) 控。HLA-B27 檢測原理：HLA-B27是MHC class I的一種。HLA-B27抗原的表達與強直性脊柱炎以及 其他一些免疫性風濕病有很強的關(guān)聯(lián)。90%的強直性脊柱炎病人表達HLA-B27而 正常人中只有8%表達