核素標(biāo)記化合物

1、第四章 核素標(biāo)記化合物第一節(jié) 概述一、標(biāo)記化合物的概念凡是分子中某一原子或某些原子（或基團(tuán)）被放射性核素或穩(wěn)定核素所取代，而成為 一類易被識(shí)別的化合物，則稱之為核素標(biāo)記化合物（以下簡(jiǎn)稱標(biāo)記化合物）。如CH3 14COOH是放射性14C的標(biāo)記化合物；ch13coo則是穩(wěn)定核素13C的標(biāo)記化合物。其中14C和13C均 為標(biāo)記原子。本章側(cè)重介紹放射性標(biāo)記化合物（ radionuclide labeled compound ） , 僅在 第三節(jié)中對(duì)穩(wěn)定核素標(biāo)記化合物和其他標(biāo)記化合物作扼要說(shuō)明。二、常用的術(shù)語(yǔ)及標(biāo)記化合物的命名（一）標(biāo)記化合物的分類按照取代原子與被取代原子的關(guān)系，可把放射性標(biāo)記化合物分為

2、兩類：1同位素標(biāo)記化合物（ isotopic labeled compound ）化合物中某元素的穩(wěn)定同位素原子被同一元素的放射性同位素或穩(wěn)定同位素原子取 代，稱為同位素標(biāo)記化合物，取代前后的化合物，在理化性質(zhì)上完全相同（同位素效應(yīng)除 外），這類標(biāo)記稱為同位素標(biāo)記（isotopic labeling ）。如葡萄糖分子中的 C、H分別被14C、 3h取代，二氧化碳中的碳被 14C或13C取代，都得到同位素標(biāo)記化合物。2. 非同位素標(biāo)記化合物（ nonisotopic labeled compound）該類標(biāo)記化合物是用化學(xué)性質(zhì)相似或根本不同的放射性核素取代原化合物中所含的某 元素的穩(wěn)定核素原子

3、, 這種標(biāo)記稱非同位素標(biāo)記（ nonisotopic labeling ）。此類標(biāo)記化合 物即非同位素標(biāo)記化合物，如125I-IgG （免疫球蛋白） 。非同位素標(biāo)記亦稱非理想標(biāo)記，得到的標(biāo)記化合物在理化和生化性能上與原化合物有一定的差異，但嚴(yán)格控制質(zhì)量，仍能在 醫(yī)學(xué)中得到廣泛應(yīng)用。標(biāo)記化合物也可按標(biāo)記核素是放射性核素還是穩(wěn)定核素分成放射性核素標(biāo)記化合物 和穩(wěn)定核素標(biāo)記化合物，統(tǒng)稱為核素標(biāo)記化合物。（二）標(biāo)記化合物的命名及常用術(shù)語(yǔ)1標(biāo)記化合物的命名 對(duì)放射性標(biāo)記化合物的命名尚缺少統(tǒng)一法則。一般情況下，有機(jī)標(biāo)記化合物的命名， 通常先指出標(biāo)記位置，再列出標(biāo)記核素，最后是化合物的名稱，如l- 14C-

4、醋酸。必要時(shí)，可在核素符號(hào)的右下角注明分子內(nèi)標(biāo)記原子的數(shù)目，如DL-苯丙氨酸-環(huán)2Hs, a -2Hs。無(wú)機(jī)標(biāo)記化合物命名，通常在化合物的前面注明放射性核素，也可把標(biāo)記核素直接寫在分子 式內(nèi)，如 125I- 碘化鈉或 Na125I ）。2常用術(shù)語(yǔ)標(biāo)記分子的具體情況常用下列術(shù)語(yǔ)或符號(hào)來(lái)說(shuō)明：(l )定位標(biāo)記( specific labeling ) 即分子中的標(biāo)記原子限定在指定的位置上。常用“ S”表示，如1-14C( S)-乙酸或1-14C-乙酸。表示1位碳原子被14C標(biāo)記。(2) 準(zhǔn)定位標(biāo)記( nominal labeling ) 在 3H 標(biāo)記中，理論上應(yīng)獲得預(yù)期的定位標(biāo)記分 子，實(shí)際上，

5、3H在預(yù)期位置上的分布， 有時(shí)低于化合物中3H總量的95%,或百分比值不詳。 此類標(biāo)記稱準(zhǔn)定位標(biāo)記，用“ n”表示。是一種名義上的定位標(biāo)記。(3) 均勻標(biāo)記( uniform labeling ) 是一種非定位標(biāo)記( non-specific labeling ), 指整個(gè)分子中的某元素所有的原子均被放射性核素取代,或是放射性原子在分子中均勻地分布或者是達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的均一性。用“U”表示，如U-14C-乙酸。(4) 全標(biāo)記( general labeling ) 是非定位標(biāo)記,指分子內(nèi)所有相同的氫原子都可被314H取代，機(jī)遇各不相同。不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的均一性。用“G'表示，如G- C-乙

6、酸。(5) 雙標(biāo)記或多標(biāo)記(double labeling or multiple labeling) 指在標(biāo)記化合物內(nèi)引入兩種或兩種以上的元素的同位素,或引入一種元素的兩種或兩種以上的同位素原子,1514如 NH CHCOQH生物醫(yī)學(xué)示蹤研究中，有時(shí)將一種化合物的兩種或兩種以上單標(biāo)記物混合 起來(lái)應(yīng)用,通常也稱為雙標(biāo)記或多標(biāo)記物。第二節(jié) 制備標(biāo)記化合物的基本技術(shù)一 、放射性核素的選擇及標(biāo)記要求由于放射性核素有其自身的特點(diǎn),因此選擇核素時(shí)應(yīng)注意：( 1)有合適的核性質(zhì)。例如發(fā)射丫射線的核素容易測(cè)量，往往成為制備標(biāo)記化合物的首選；半衰期不能太短，以便 完成制備和實(shí)驗(yàn)；但是太長(zhǎng)的壽命給處理放射性廢物

7、帶來(lái)諸多麻煩, 以及比活度偏低,不易測(cè)量。( 2)得到的產(chǎn)物應(yīng)與被示蹤化合物性質(zhì)盡量接近,以便得到可信的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié) 論。( 3)標(biāo)記方便,得到的化合物穩(wěn)定。放射性標(biāo)記化合物在標(biāo)記時(shí)也有一些特殊的要求： ( 1)標(biāo)記時(shí)應(yīng)充分利用放射性核素, 標(biāo)記率應(yīng)盡量高,未標(biāo)記的核素應(yīng)注意回收利用。( 2)放射性核素標(biāo)記是一種微量化學(xué)過(guò)程,需用微量或超微量方法進(jìn)行標(biāo)記、 純化和鑒定。 標(biāo)記時(shí)應(yīng)盡量減少放射性核素的稀釋, 避免加入不必要的載體。 ( 3)選擇標(biāo)記方法時(shí), 最好用同位素標(biāo)記； 如使用非同位素標(biāo)記, 則標(biāo)記核素的位置應(yīng)以不影響整個(gè)標(biāo)記分子的特定功能為佳；各種放射性核素的化學(xué)狀態(tài) 不同,標(biāo)記方法也有

8、差別。( 4)標(biāo)記過(guò)程應(yīng)簡(jiǎn)單、快速；最好在標(biāo)記的最后階段加入放射性核素,以減少損失和污染；有條件時(shí),在標(biāo)記前作冷實(shí)驗(yàn),以取得經(jīng)驗(yàn)。二、標(biāo)記方法制備放射性標(biāo)記化合物的常用方法歸納如下：(一) 化學(xué)合成標(biāo)記法( chemical synthesis ) 此方法是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將放射性核素引入化合物中。換言之,就是將放射性核素 的初始原料,通過(guò)選定的工藝步驟,合成所需要的標(biāo)記化合物。此法可定位標(biāo)記,但合成 步驟較多。 14C， 3H 標(biāo)記化合物常用此法進(jìn)行合成標(biāo)記。（ 二 ） 同位素交換標(biāo)記法（ isotope exchange ） 一般系指兩種不同分子之間同一元素的同位素相互替代的過(guò)程，利用這個(gè)交換

9、過(guò)程直 接把某種特定的放射性核素引入化合物中。該方法操作快速、簡(jiǎn)便。在放射性核素半衰期 短、化學(xué)合成步驟多的情況下，該方法的實(shí)用意義更大。適用于大量有機(jī)化合物或天然產(chǎn) 物的3h標(biāo)記，是制備3h標(biāo)記化合物的重要方法。（ 三 ） 生物合成標(biāo)記法（ biosynthesis ） 該方法是利用酶、微生物、動(dòng)植物的生理代謝過(guò)程，引入放射性核素合成有機(jī)化合物。 特別是對(duì)目前尚不能用人工方法合成的物質(zhì)，如某些激素、蛋白質(zhì)、抗生素、核酸、維生 素等，生物合成法則成為其惟一的制備方法。在酶的催化下，該方法合成的標(biāo)記化合物大 都是具有旋光性的異構(gòu)體，產(chǎn)物不必經(jīng)過(guò)分離。用微生物或動(dòng)植物進(jìn)行生物合成的缺點(diǎn)是 產(chǎn)額低，

10、標(biāo)記位置不易控制，易造成污染。此外，還有加速離子和熱原子反沖標(biāo)記法。實(shí)際上，這種反沖標(biāo)記法與中子活化標(biāo)記、 輻射誘發(fā)激活標(biāo)記一樣、都屬于輻射合成標(biāo)記法。一般它們多用于化合物的3H 標(biāo)記，如甾族化合物、激素和維生素的 3H標(biāo)記。三、常用的標(biāo)記化合物及其制備常用的標(biāo)記化合物通常指 3H、 14C 和放射性碘標(biāo)記的化合物，目前碘標(biāo)記化合物用得比 較多。（一）放射性碳的標(biāo)記化合物碳是構(gòu)成生命物質(zhì)的基本元素。在碳的放射性同位素中，生物醫(yī)學(xué)中用得最多的是14C和11Co 14C由反應(yīng)堆生產(chǎn)，半衰期為 5, 730年，只發(fā)射3粒子（0.159 MeV ）,用液閃測(cè)量 很方便，外照射較弱，易防護(hù)。用于自顯影時(shí)

11、，影像清晰。半衰期長(zhǎng)，能保證連續(xù)實(shí)驗(yàn)， 又不需要進(jìn)行放射性衰變校正。理論上，14C標(biāo)記化合物的放射性比活度可高達(dá)2.3088 TBq/g，豐度可達(dá)100%（商品達(dá)80%以上）。與3H相比，14C標(biāo)記化合物輻射自分解速度低。由于構(gòu)成物質(zhì)的 c c鍵比較牢固，標(biāo)記化合物中的14c原子也比較穩(wěn)定，所以在生物示蹤研究中很有用。11C標(biāo)記化合物用于核醫(yī)學(xué)診斷，由加速器生產(chǎn)，它發(fā)射3 +射線，半衰期為20.1 min ,需要用快速標(biāo)記和分離方法制備相應(yīng)的化合物。由于11C的良好核性質(zhì)，因此它的化合物，如11C-蛋氨酸、11C-甲基螺環(huán)哌啶酮等是 PET （proton emission tomograph

12、y，正電子發(fā)射 斷層術(shù)）顯像中所用的主要放射性藥物之一 。放射性碳的標(biāo)記常從最簡(jiǎn)單的化合物（如11CQ或Ba14CG）開(kāi)始，然后逐步合成得到所需的產(chǎn)品，可定位標(biāo)記，純化方便，放射性比活度高。14c標(biāo)記化合物的制備方法，基本上分為化學(xué)合成法、生物合成法和輻射合成法3類。14C標(biāo)記化合物制備工藝復(fù)雜，要求設(shè)備條件高和防護(hù)措施全。一般放射性實(shí)驗(yàn)室從事14c標(biāo)記有一定的困難。11C的標(biāo)記通常用全自 動(dòng)裝置，在幾分鐘內(nèi)可得到所需的產(chǎn)品。（二）3h標(biāo)記化合物3H為弱3輻射體（Ema=18.4 keV ）,半衰期為12.35年，可適用于各類實(shí)驗(yàn)。3H 的比活度可達(dá)1077.44GBq/mmol,比較容易獲得

13、高比活度的標(biāo)記化合物。并可借助核磁共振儀鑒定3h在標(biāo)記物中的標(biāo)記結(jié)構(gòu)。3h的豐度高，標(biāo)記化合物的制備方法較 14c容易。 一些難以用14c標(biāo)記的化合物，如肽類、蛋白質(zhì)等，?？捎?h標(biāo)記。此外，還能作為碳骨架結(jié)構(gòu)的示蹤劑，這點(diǎn)是14c所不及的。所以，3h標(biāo)記化合物的用途較廣，用化學(xué)合成法、同位素交換法和生物合成法均可制備。（三）放射性碘標(biāo)記化合物在醫(yī)學(xué)中常用的放射性碘有131I、1251、123l、1241等，其核性質(zhì)如表 4-1，其中1251和131|是生物醫(yī)學(xué)中最常用的放射性核素。不少有機(jī)化合物都可以進(jìn)行碘標(biāo)記，方法簡(jiǎn) 單，適合制備比活度高的化合物。123|和124|標(biāo)記化合物主要用于臨床功

14、能檢查，131|用125于甲狀腺疾病和各種腫瘤的治療，I標(biāo)記化合物則主要用于生物醫(yī)學(xué)研究與體外分析中。表4-1醫(yī)學(xué)中常用的放射性碘核素半衰期衰變方式王要射線能量， MeV （分支比）123I13.0 hEC丫 :0.159(82.9%)125I60.2 dEC丫 :0.035(6.7%) , X : 0.027131I8.04 d3 -3 -:0.606(86%), 0.336(13%)丫 :0.364(81%) , 0.637(8.94%)120I1.4 h+3丫 :+0.511, 3 : 4.6122I3.6 m+3丫 :+0.511, 3 : 3.1124I4.2 d+3丫 :+0.51

15、1, 3 : 2.11. 放射性碘標(biāo)記的蛋白質(zhì)和多肽放射性碘標(biāo)記的蛋白質(zhì)和多肽方法很多，如一氯化碘法、電解標(biāo)記法、氯胺-T法、乳過(guò)氧化物酶法、lodogen法和聯(lián)接標(biāo)記法等。后四種方法應(yīng)用較多。（I ）氯胺-T （Chloramine T , Ch-T）法這是一種微量標(biāo)記方法，最初由Greenwood和Hun ter建立。該方法標(biāo)記率高，重復(fù)性好，是常用的經(jīng)典標(biāo)記方法。Ch-T是一種較溫- +和的氧化劑，在水溶液中形成次氯酸，將陰離子I氧化為分子態(tài)的碘或I，在pH為7.5的環(huán)境里能與蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基苯環(huán)上的H發(fā)生置換反應(yīng)，制得碘標(biāo)記物。具體操作方法舉例：在5卩g/50卩L蛋白質(zhì)（0.5 mo

16、l/ L的磷酸緩沖液，pH 7.5 ）中，依次加入 74MBq /50卩L碘I化鈉（Na I ）, 100卩g /50卩L Ch-T , 4C下快速攪拌 Imin后，加入 200卩g /100 卩L偏重亞硫酸鈉（NqS205）終止反應(yīng)，加入 I mg /100 卩L碘化鉀（KI ）, 然后用Sephadex G-25凝膠柱分離標(biāo)記蛋白質(zhì)和游離碘。一般游離碘不超過(guò)5%。其反應(yīng)式為：«JRT)2CHj>-90i < N + 2N*+2Cl+Mj(1>HO-Q" CHj-CH -CO-+2'ItNH,畫白廣威雰駄中的ncsas) *iH0-O-CH,-C

17、H-C0-4-2H+ 2*1；#Inh(氯胺-T法標(biāo)記125I反應(yīng)式Ch-T 水溶液對(duì)光和氧不穩(wěn)定，易分解，和Na2S2O5 樣，使用前臨時(shí)配制。Ch-T的實(shí)125際用量超過(guò)理論值（按氧化74 MBq新鮮無(wú)載體的I計(jì)算，理論上僅需 Ch-T O.15卩g）,Ch-T的濃度越高，標(biāo)記率也越高，但用量過(guò)高會(huì)引起標(biāo)記物的生物活性和免疫活性降低； 用量過(guò)低或局部濃度過(guò)高也能導(dǎo)致標(biāo)記率降低。嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度，能減少Ch-T對(duì)蛋白質(zhì)的損傷作用。加入 KI是為了充分分離游離碘。反應(yīng)時(shí)間由待標(biāo)記物質(zhì)的性質(zhì)決定。綜上所 述，控制Ch-T的濃度、反應(yīng)時(shí)間和溫度有利于蛋白質(zhì)的標(biāo)記。（2 ）乳過(guò)氧化物酶法即用乳過(guò)氧化

18、物酶（lactoperoxidase , LPC）催化過(guò)氧化氫（H2O2）釋放出活潑的新生態(tài)氧，使125I離子活化并標(biāo)記在蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上的一種標(biāo)記方法。此類酶催化反應(yīng)速度很快。以標(biāo)記蛋白質(zhì)為例，其方法舉例如下：37 MBq /50卩L Na I , 210 卩 g /10 卩 L 蛋白質(zhì)，20100 ng /10 卩 L LPQ 200500 ng /10 卩 L H2O2 混勻，反應(yīng)1030 min，加入10 mmol/L的巰基乙醇（或緩沖液）0.5 mL終止反應(yīng)。10 min后加入0.1 mmol/L的Nal載體溶液100卩L,按常規(guī)方法純化分離。其反應(yīng)式為：CT3+H0- 00*

19、NH,<_CHlCH_OO_NHt丄.乳過(guò)氧化物酶法125I標(biāo)記反應(yīng)式此法反應(yīng)溫和，對(duì)蛋白質(zhì)的活性損傷較小，但標(biāo)記率低。反應(yīng)期間可能出現(xiàn)LPO自身碘化和H2O2對(duì)LPO的抑制作用。目前對(duì)此法作如下的改進(jìn)：采用固相酶法，將LPO交聯(lián)在Sepharose 4B （瓊脂糖凝膠）固相上，解決了LPO碘化后分離難的問(wèn)題；采用乳過(guò)氧化物酶-葡萄糖氧化酶（LPO-GO ）法，利用反應(yīng)過(guò)程中葡萄糖氧化產(chǎn)生的小量H2O2，毋須外加H2O2,使得標(biāo)記物能保持其生物學(xué)活性。由于標(biāo)記位置僅限于LPO接近的部位，即蛋白質(zhì)分子的表面，遠(yuǎn)離活性中心，所以對(duì)保持酶、激素和抗體的活性有利。與Ch-T法一樣，LPO法標(biāo)記的

20、主要是酪氨酸殘基和少量組氨酸殘基；不同點(diǎn)是Ch-T法不限分子表面，分子的空間因素對(duì)Ch-T法的碘化效率影響不大，但空間因素對(duì) LPO法標(biāo)記率卻有著重要影響。此外， LPO法不僅可以碘化標(biāo)記蛋白多肽，也能碘化標(biāo)記各種脂肪、細(xì)胞和細(xì)胞膜。成為研究細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的重要方法，尤其是 固相LPO法標(biāo)記僅限于酶分子達(dá)到的部位，可作為大分子探針，是研究免疫應(yīng)答過(guò)程中細(xì) 胞膜變化的有力手段。（3） 固相氧化法（lodogen標(biāo)記法）1978 年由Fraker和Speck建立的碘標(biāo)記方法。Iodogen （l , 3, 4 , 6-四氯-3 a , 6 a -二苯基甘脲，1, 3 , 4, 6-Tetrachlor

21、o-3 a , 6 a -diphe nlglycoluril,氯甘脲）不溶于水，能溶于氯仿、二氯甲烷、二甲基亞砜等有機(jī)溶劑,在碘標(biāo)記過(guò)程中起催化作用。lodogen為固相催化劑，毋須新鮮配制。催化反應(yīng)終止時(shí)不需加還原劑。具體標(biāo)記方法舉例如下：1 mg Iodogen溶于25 mL二氯甲烷中，取 50 L涂漬在試管底部，用氮?dú)獯蹈桑芊獗４嬗?20 C待用。標(biāo)記時(shí)向試管中加入10卩g /10卩L欲標(biāo)記蛋白質(zhì)（0.05 mmol/L磷酸緩沖液體系，pH為7.4 ）和37 MBq /10卩L Na I，輕輕 搖勻，冰浴中反應(yīng)10 min，用250卩L的緩沖液稀釋，以終止反應(yīng)。取出液相，通常用葡聚糖

22、凝膠（Sephadex）柱純化標(biāo)記品。Iodogen標(biāo)記法具備Ch-T法和LPO法的優(yōu)點(diǎn)，即標(biāo)記酪氨酸殘基不受空間位置的影響。 同時(shí)因固相l(xiāng)odogen不與蛋白質(zhì)密切接觸，反應(yīng)過(guò)程中的氧化損傷小，反應(yīng)時(shí)間易控制，這 一方法越來(lái)越為人所接受。此外， 利用lodogen不溶于水的特點(diǎn)，可直接對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行碘 標(biāo)記，方法簡(jiǎn)便。將蓋片涂lodogen的一面向下漂浮在含有細(xì)胞的培養(yǎng)液上，然后向培養(yǎng)液 中加入Na25i，細(xì)胞膜蛋白被標(biāo)記。注意不應(yīng)使用含血清和酪氨酸的培養(yǎng)液。此法已用于研 究網(wǎng)織紅細(xì)胞、紅細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。（4） 聯(lián)接標(biāo)記法（conjugation labeling ）這是一種間接標(biāo)記方法。先

23、使放射性碘與聯(lián) 接劑相結(jié)合，然后碘標(biāo)記的聯(lián)接劑再結(jié)合到蛋白質(zhì)或多肽分子上，成為標(biāo)記化合物。此方法的基本原理是：在 Ch-T作用下，先用 Na125|使?；瘎?-（對(duì)-羥基苯）丙酸-N琥珀亞胺酯（HPNS，即Bolton-Hunter試劑）碘化。125l -HPNS通過(guò)一個(gè)酰氨鍵，與蛋白質(zhì)末端的氨基 聯(lián)結(jié)，制得標(biāo)記物。其反應(yīng)式為：CHikocc cio/宀HS。YHPOHLbO?yrCCHt-cDw0pH 8 - JOHCH* O占"U C NH 90 IS'l-HPNS的苯溶液已有市售商品。標(biāo)記方法如下：取一定量I- HPNS （每 卩mol蛋白用35卩mol碘標(biāo)試劑），用氮

24、氣吹去保存劑后，加入 510卩g （10卩L）預(yù)冷至0C的欲 標(biāo)記蛋白，混勻，調(diào)至 pH 88.5為宜。在冰浴中反應(yīng) 1530 min，加入0.5 mL0.2 mol/L 甘氨酸終止反應(yīng)。欲標(biāo)記蛋白質(zhì)與甘氨酸均用 0.l mol/L硼酸緩沖液配制，用Sephadex G-50 凝膠柱進(jìn)行分離純化。Bolto n-Hu nter試劑能與血清蛋白結(jié)合，因此過(guò)柱前不能用蛋白質(zhì)飽 和柱子，去除游離碘后標(biāo)記物可加蛋白質(zhì)保護(hù)。此法的優(yōu)點(diǎn)是能避免蛋白質(zhì)與氧化劑和125I 的直接接觸， 防止標(biāo)記過(guò)程中引起蛋白質(zhì)變性失活，并適用于缺乏酪氨酸的蛋白質(zhì)的標(biāo)記。但此法操作比較麻煩，須經(jīng)過(guò)兩步反應(yīng)， 碘利用率低。標(biāo)記小

25、分子會(huì)引起空間構(gòu)型的破壞，較適合標(biāo)記分子量10, 000的蛋白質(zhì)。2核酸的體外碘標(biāo)記標(biāo)記原理：加熱把 DNA解析成單股，在三氯化鉈（TICI 3）氧化作用下，使125|原子與 胞嘧啶環(huán)上5位碳原子以穩(wěn)定的共價(jià)鍵相結(jié)合，而形成5-碘胞嘧啶。標(biāo)記方法：將8卩L（4卩g） DNA水溶液和15卩L含肝素（200卩g/mL）的0.2 mol/ L 的醋酸鈉緩沖液（pH 125為5）混勻；加入 2卩L Na I （7.4 MBq ）和I卩L TlCl 3 （6 mg/ mL） 再次混勻，45C 保溫45 min后，冷卻至0C,加入2-巰基乙醇終止反應(yīng)。用含有10%甘油和10卩g DNA的0.6 ml醋酸緩

26、沖液（0.l mol/L , pH為5）稀釋；經(jīng) Sephpdex G-25柱純化，除去游離 碘和核酸以外的成分。合并含核酸的組分；用苯酚 -氯仿萃取一次，再用乙醇沉淀，保存?zhèn)?用。本方法采用的條件溫和，可避免核酸裂解、變性和電泳遷移率的改變。（四）32p及35s標(biāo)記化合物32P及35S均為3 -發(fā)射核素。磷和硫是核酸和蛋白質(zhì)本身所含有的元素，32P標(biāo)記的核苷酸用于DNA序列測(cè)定，35S-胱氨酸和35S-蛋氨酸用于研究蛋白質(zhì)代謝過(guò)程，它們均為生物3235醫(yī)學(xué)中不可缺少的試劑。P （T1/2=14.3 d, Emax=1.71MeV）和 S （T2=87d, Emax=0.167MeV）標(biāo)記物的

27、制備主要用化學(xué)合成、生物合成、酶促法和同位素交換法等。例如分子生物學(xué)中很重要的丫-32P-ATP（32P-三磷酸腺苷）用酶促法制備過(guò)程：反應(yīng)液：6mmol/LMgCl2,2mmol/L L- 半胱氨酸， 0.73mmol/L 無(wú)水硫酸鈉 , 0.33mmol/L 5' -ATP-Na, 0.1 mmol/L 輔酶 I,0.33mmol/L 甘油酸-3磷酸鈉鹽；酶液：200卩L甘油酸-3-磷酸激酶,60卩L甘油醛磷酸 脫氫酶,2 mmol/L 谷胱氨酸，0.1 mmol/L 輔酶I ;標(biāo)記反應(yīng)：反應(yīng)液、酶液和H332PO4混合，在pH8.0的0.05mol/Ltris-HCl緩沖液中,3

28、7 ° C反應(yīng)30min :純化：將反應(yīng)產(chǎn)物用0° C 蒸餾水稀釋至 18mL， 用 強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂柱純化， 先用 0.02mol/L NHCI-0.02mol/LHCI 緩沖液洗去雜質(zhì)，然后用0.25mol/L HCl將丫 -32P-ATP洗脫出來(lái)，用活性 炭吸附濃縮；放化純度測(cè)定：硅膠G板為固定相，用叔丁醇：異丙醇：20%三氯醋酸=13： 10： 10： 0.1 （V/V）展開(kāi) 68h。（ 五） 金屬放射性核素的標(biāo)記化合物金屬放射性核素包括 99Tcm、 67Ga、 111In、 90Y、 186Re、 188Re、 153Sm 等，它們的生物制 劑被廣泛用于醫(yī)學(xué)

29、診斷和治療中，成為標(biāo)記化合物中不可缺少的一部分。其標(biāo)記方法主要 有直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩類。1 直接標(biāo)記法直接標(biāo)記法即將金屬放射性核素直接標(biāo)記到生物大分子上，如99Tcm和186Re、188Re的標(biāo)記有時(shí)采用這種方法。該法操作步驟包括：金屬核素變成能與生物大分子結(jié)合的狀態(tài)。 99Tcm 和 186Re、 188Re 均需預(yù)先進(jìn)行還原，并加入合適的絡(luò)合劑以使其低價(jià)態(tài)保持穩(wěn)定。常 用的還原劑有亞錫 （Sn2+）、連二硫酸鈉（Na2S2O4）等，絡(luò)合劑有檸檬酸鹽、葡萄糖酸鈉等。生物大分子：用抗壞血酸、Sn2+、Na2S2O4等打開(kāi)二硫鍵，得到還原態(tài)氫。低價(jià)態(tài)的金屬核素與打開(kāi)二硫鍵的生物大分子反應(yīng)，一般

30、用醋酸緩沖液體系，pH 5左右，得到所需的標(biāo)記化合物。直接標(biāo)記法的優(yōu)點(diǎn)為標(biāo)記率高，方法簡(jiǎn)單，通常不必進(jìn)一步純化；缺點(diǎn)是打 開(kāi)了二硫鍵，降低了標(biāo)記物的生物活性。2間接標(biāo)記法間接標(biāo)記法是通過(guò)連接劑將放射性核素與生物大分子連接而達(dá)到標(biāo)記目的。操作步驟為：連接劑與生物大分子連接，連接劑常用雙功能螯合劑，如DTPA （二乙基三氨基五乙酸）、DOTA（ 1，4，7, 10-四氮雜環(huán)十二烷-N, N', N'', N'”四乙酸）、2-IT（2-亞氨基四氫 噻吩）、2-ME（ 2-巰基乙醇）、MAG 3 （巰基乙?；拾彼幔┑?；用Sephadex柱除去多余的螯合劑，得到生物大

31、分子 -螯合劑聯(lián)結(jié)物；有的金屬核素如99Tcm和186Re、188Re需要在絡(luò)合劑存在下還原，與直接標(biāo)記相同，而67Ga> 111In、90Y等則可直接與生物大分子-螯合劑聯(lián)結(jié)物反應(yīng)，得到相應(yīng)的標(biāo)記物；純化，除去未標(biāo)記的放射性核素和其他雜質(zhì)。間接 標(biāo)記法的優(yōu)點(diǎn)是可用于不含二硫鍵的配體標(biāo)記；缺點(diǎn)是得到合適的雙功能螯合劑較困難， 對(duì)于不同的核素需要針對(duì)性地合成不同的連接劑，否則容易產(chǎn)生標(biāo)記物不穩(wěn)定、標(biāo)記產(chǎn)率 低等問(wèn)題。另外，制備過(guò)程步驟多，放射性核素?fù)p失大。四、標(biāo)記化合物的純化與質(zhì)量鑒定（一）標(biāo)記化合物的純化各種方法得到的標(biāo)記化合物都含有一定量的雜質(zhì)，放存一段時(shí)間的標(biāo)記化合物也會(huì)出 現(xiàn)分解產(chǎn)

32、物，所以在使用前必須分離純化。常用的純化方法有沉淀法、萃取法、離子交換 分離法和層析分離法等。純化方法的選擇主要依據(jù)標(biāo)記化合物的化學(xué)性質(zhì)，副反應(yīng)生成的 化合物的性質(zhì)，標(biāo)記化合物的產(chǎn)額，標(biāo)記時(shí)已存在的或反應(yīng)中生成的雜質(zhì)的性質(zhì)與量。（二）標(biāo)記化合物的質(zhì)量鑒定標(biāo)記化合物的質(zhì)量鑒定指標(biāo)應(yīng)包括：放射性核素純度、放射化學(xué)純度、放射性比活度及 生物學(xué)指標(biāo)。1.放射性核素純度（radio nuclide purity）放射性核素純度指標(biāo)記化合物所需要的放射性核素的活度占樣品中各種核素總放射性 活度的百分比，計(jì)算公式：放射性核素純度% =所需放射性核素的活度樣品的總放射性活度100%般要求標(biāo)記化合物的放射性核素

33、純度應(yīng)在98%以上。常用的檢查方法有兩種：半衰期測(cè)定法，適用半衰期短的核素，一般跟蹤時(shí)間為35個(gè)半衰期；射線能量測(cè)定法,利用各種放射性核素固有的能譜，檢查測(cè)定放射性核素的純度。2. 標(biāo)記率（labeling efficiency ）和放射化學(xué)純度（radiochemical purity ）所謂標(biāo)記率是指所標(biāo)記的物質(zhì)（有可能包括一種以上的化學(xué)形態(tài)）的放射性活度占樣 品中總放射性活度的百分比。放射化學(xué)純度是指某一特定化學(xué)形態(tài)的標(biāo)記物的放射性活度占總放射性活度的百分比。放射化學(xué)純度一般應(yīng)達(dá)到95%以上方可使用。常用的檢查方法有放射性層析法，包括電泳法、薄層色譜、紙色譜及高效液相色譜法等，有時(shí)也用放

34、射性核素稀釋法和放射自顯影法。標(biāo)記率標(biāo)記物的放射性活度 二樣品的總放射性活度100%放射化學(xué)純度特定化學(xué)形態(tài)的某種核素的放射性活度該核素的總放射性活度MBq/ mmol 或3. 放射性比活度(specific activity )放射性比活度簡(jiǎn)稱比活度，是指單位質(zhì)量物質(zhì)所含的放射性活度。用GBq/mmol表示。測(cè)定方法有直接測(cè)定計(jì)算法、層析掃描面積計(jì)算法等。4. 生物學(xué)鑒定生物學(xué)鑒定包括生物活性和免疫活性等的測(cè)定，這對(duì)體內(nèi)示蹤劑尤為重要。一般說(shuō)來(lái), 受體的生物活性可通過(guò)受體和配基結(jié)合率測(cè)定，免疫活性可通過(guò)抗體和抗原結(jié)合率測(cè)定。五、標(biāo)記化合物的貯存放射性標(biāo)記化合物除具有化合物本身的不穩(wěn)定性外，還

35、具有放射性原子所引起的不穩(wěn) 定性。用于標(biāo)記的放射性核素所發(fā)出的射線能使標(biāo)記化合物自身分解，稱之為輻射自分解(autoradiolysis )。輻射自分解常分為 3類：初級(jí)內(nèi)部自分解：即標(biāo)記化合物由于放射 性標(biāo)記原子的核衰變而引起的原子組成的變化或化學(xué)鍵斷裂。這類分解作用是放射性核素 固有的物理特性，無(wú)法人為地控制和防止。初級(jí)外輻射分解：即放射性標(biāo)記原子發(fā)射的 射線直接作用于化合物分子，引起分子化合鏈斷裂，造成化合物分解。這類外輻射分解作 用與標(biāo)記化合物的濃度有關(guān)。次級(jí)輻射分解：放射性標(biāo)記化合物或其周圍介質(zhì)的分子， 由于射線與物質(zhì)相互作用而產(chǎn)生一系列活性游離基團(tuán)，如H、OH、HO2 等，這些活性

36、基團(tuán)又與標(biāo)記化合物分子相互作用，使得化合物分解。次級(jí)輻射分解作用對(duì)3h和14c標(biāo)記化合物更重要。標(biāo)記化合物的輻射自分解主要與標(biāo)記化合物吸收射線能量的效率、標(biāo)記化合物 的濃度和比活度有關(guān)。 標(biāo)記化合物發(fā)生輻射分解的百分?jǐn)?shù)用G值表示，即以系統(tǒng)每吸收100eV射線能量后發(fā)生變化(不論生成或破壞)的分子數(shù)目表示。應(yīng)指出，除了輻射自分解以外，標(biāo)記化合物還會(huì)發(fā)生化學(xué)分解，標(biāo)記化合物本身的不 穩(wěn)定性引起儲(chǔ)存過(guò)程中發(fā)生分解，如水解、氧化、聚合等。對(duì)于氚，還會(huì)發(fā)生同位素交換 反應(yīng)，標(biāo)記化合物分子的某些基團(tuán)，如-SH、-NH2、-COOH = NH中的標(biāo)記氚原子都不穩(wěn)定(稱為不穩(wěn)定氚)，在極性溶劑中能與氫或其他元

37、素發(fā)生交換而失去氚。標(biāo)記化合物的儲(chǔ)存原則：降低標(biāo)記物比活度。固體純品貯存輻射自分解最嚴(yán)重，以 液態(tài)貯存較好。稀釋。在貯存高純度的標(biāo)記化合物時(shí)常用非標(biāo)記的化合物稀釋。選擇稀 釋劑時(shí)，主要采用不易產(chǎn)生自由基的溶液作稀釋劑，如苯。惰性氣體環(huán)境，以防止標(biāo)記 物氧化。低溫保存。以低溫度但不結(jié)冰條件下(2 0C4 °C)避光貯存標(biāo)記化合物為好。對(duì)3H的標(biāo)記化合物來(lái)說(shuō)也可采用深凍(-140 °C)保存。第三節(jié)穩(wěn)定核素及其他標(biāo)記化合物、穩(wěn)定核素標(biāo)記化合物穩(wěn)定核素( stable nuclide )是一類原子核不發(fā)射射線的核素，包括不自發(fā)地發(fā)生核 內(nèi)成分或能級(jí)變化或發(fā)生概率非常小(通常指Ti

38、/2 > 109a ,也有人定義為Ti/2 > 1015a )的核素。醫(yī)學(xué)生物學(xué)中最有用的穩(wěn)定核素(H C、N、O S)大多數(shù)為輕元素的重同位素；少數(shù)為輕同位素。自然界存在的各種元素，大多數(shù)不止有一種穩(wěn)定核素，它們相互混合，以恒 定的比例存在于各種化合物之中。習(xí)慣上把其中比例最高的核素稱為主要核素，如16q其余比例較低的稱為主要核素的穩(wěn)定同位素(stable isotope ),如17Q和18O天然存在的穩(wěn)定核 素的原子 數(shù)與該元素總 原子數(shù)的 百分比，即該 穩(wěn)定核素 的天然豐度( natural abundanee )。它是穩(wěn)定核素測(cè)量時(shí)的本底來(lái)源之一，能直接影響測(cè)量的靈敏度。所

39、以，應(yīng) 用時(shí)應(yīng)盡量地選擇天然豐度低的核素。穩(wěn)定核素的生產(chǎn)，與放射性核素不同，主要是通過(guò)理化方法，從天然存在的某一元素 的各種穩(wěn)定核素的混合物中分離出所需的核素。常用的方法有質(zhì)量分離法、同位素交換法 和富集法( enriehment )等。穩(wěn)定核素的標(biāo)記化合物( labeled eompound of stable nuelide)的制備，與放射性核素標(biāo)記物的制備方法基本相似，也分為化學(xué)合成法、生物合成法及同位素交換三大類。穩(wěn)定核素標(biāo)記化合物制備規(guī)模相對(duì)比較大，多在數(shù)10 mg到100 g之間，要求穩(wěn)定核素豐度高。因不存在核素衰變問(wèn)題，不要求快速合成，故制備過(guò)程并不完全與放射性標(biāo)記過(guò)程 相同。如

40、用重水為原料，采用反復(fù)交換步驟可獲得豐度很高的氘標(biāo)記化合物。另外，穩(wěn)定 核素大多比較昂貴，因此制備過(guò)程中要求充分利用原料，并盡量回收未標(biāo)記的部分。近年來(lái)，隨著穩(wěn)定核素應(yīng)用的擴(kuò)大，穩(wěn)定核素標(biāo)記技術(shù)已向多標(biāo)記發(fā)展，并越來(lái)越多 采用分子內(nèi)標(biāo)記技術(shù)，即一個(gè)分子上標(biāo)記多個(gè)同種或不同種類的穩(wěn)定核素的原子。同時(shí)， 對(duì)標(biāo)記的部位也提出了更嚴(yán)格的要求，并注意到標(biāo)記化合物的立體特異性。除化學(xué)純度外，標(biāo)記化合物的豐度成為穩(wěn)定核素標(biāo)記化合物的主要質(zhì)量指標(biāo)。標(biāo)記化合物的豐度有兩個(gè)含義：原子豐度(atomic abundanee)和分子豐度(molecular abundance )。原子豐度是指標(biāo)記分子某一特定位置上的原子中標(biāo)記原子所占的百分比。原子豐度包 括該標(biāo)記核素的天然豐度，所以有人也用原子百分超(atom excess )來(lái)度量標(biāo)記原子的含量。原子百分超 =原子豐度 - 天然豐度。分子豐度：是指每 100 個(gè)分子中帶標(biāo)記核素的分子有多少。其中包括由天然穩(wěn)定核素 形成的、與標(biāo)記物相同的分子。2H、 13C、 15N、 50Cr 等穩(wěn)定核素標(biāo)記的化合物已廣泛地用于物質(zhì)代謝、血容量及腎功能等 方面的研究。隨著分析技術(shù)