高效液相色譜培訓(xùn)ppt

1、HPLC的使用與維護(hù)分析與制劑研究室 胡鋒基本原理和特點液相色譜儀器部件實驗操作與應(yīng)用日常維護(hù)基本原理和特點基本原理：溶于流動相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過固定相時,由于與 固定相(stationary phase)發(fā)生作用(吸附,分配,離子吸引,排阻,親和)的大小,強 弱不同,在固定相中滯留時間不同,從而先后從固定相中流出.特點：分離效率高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣、操作自動化。一些商品化儀器脫氣裝置 四元泵檢測器柱溫箱樣品盤控溫箱流動相啟動液相色譜儀器的流程 l開啟HPLC系統(tǒng)各個設(shè)備的電源 打開泵、自動進(jìn)樣器、檢測器電源， 待設(shè)備通過自檢后，打開計算機(jī)啟動 色譜管理軟件l準(zhǔn)備

2、流動相 過濾，脫氣l色譜泵排氣 用新配制的流動相灌注泵高效液相色譜儀組成輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng) 色譜泵自動進(jìn)樣器 檢測器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)液相色譜的流動相液相柱-保留值與pH的關(guān)系 pH變化值0.1RS變化值1.6色譜柱：Zorbax StableBond C18 4.6*250mm,5um 流動相：27%甲醇：73%磷酸 pH： 2.5&2.6溫度： 50流速： 1.0mL/min.2. 流動相類別 按流動相組成分：單組分和多組分 按極性分：極性、弱極性、非極性 按使用方式分：等度洗脫和梯度洗脫 對溶劑的要求水： 去離子水 自動純水儀純凈水 商品瓶裝水 溶劑:

3、 色譜純（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，異丙醇）試劑: 分析純 不管采用何種途徑，配制流動相應(yīng)用新鮮水，水質(zhì)要求越高放置時間越短。 理想的HPLC用水應(yīng)為18.2的超純水，并通過0.22um的濾膜，除去熱源、有機(jī)物、無機(jī)離子及空氣等。 l過濾：0.45um或更小孔徑濾膜 目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制的緩沖液。l脫氣：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡 氣泡對測定的影響： 1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積 2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形 3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動 過濾與脫氣過濾與脫氣流動相的保存l有機(jī)溶劑流動相： 室溫下密封，避光保存l緩沖鹽流

4、動相： 當(dāng)日現(xiàn)配現(xiàn)用： 低溫下密封保存，一般不超過3天 防止微生物生長l有機(jī)溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動相： 低溫密封保存 防止有機(jī)相的揮發(fā)l選用適宜的容器1梯度洗脫的特點（1）改善分離, 加快分析速度；（2）改善峰形, 減少拖尾, 有利于痕量組分的檢測；（3）增加峰容量；（4）強烈滯留的組分不容易殘留在柱上, 保持柱性能長期良好；（5）下次分析時, 流動相需要一段平衡時間；不同溶劑的UV吸收程度稍有差異, 可能會引起基線漂移2梯度洗脫的主要條件 A 流動相/弱溶劑組成； B 流動相/強溶劑組成； 梯度時間； 梯度曲線：線性、凸型或凹型等。強溶劑 A%time125梯度洗脫123梯度：低壓混合

5、低壓梯度用單泵產(chǎn)生梯度，泵前（低壓端）混合對脫氣要求高不易調(diào)節(jié)梯度的滯后體積如設(shè)計不當(dāng)，梯度的準(zhǔn)確性受影響滯后體積（系統(tǒng)體積）設(shè)計合理梯度滯后：系統(tǒng)體積的影響死體積/譜帶展寬體積(無色譜柱時)滯后(系統(tǒng))體積滯后(系統(tǒng))體積溶劑輸送系統(tǒng)(泵)檢測器進(jìn)樣器色譜柱色譜柱梯度混合器溶劑輸送系統(tǒng)(泵)高壓梯度注意注意滯后體積包括進(jìn)樣器、阻尼滯后體積包括進(jìn)樣器、阻尼 器、混合器及其管路器、混合器及其管路比例閥檢測器進(jìn)樣器ABCD色譜柱色譜柱溶劑輸送系統(tǒng)(泵)低壓梯度 阻尼器 混合器梯度滯后大小的影響l滯后體積太大會引起梯度變化的延遲例如：滯后體積為2.0ml，流速1.0ml/min實際梯度會比設(shè)置值晚

6、2 分鐘響應(yīng)，沒有問題對微柱色譜影響更大，同上例但流速0.1ml/min實際梯度會比設(shè)置值晚20 分鐘響應(yīng)，不能接受l滯后體積的不同會使方法轉(zhuǎn)換麻煩滯后體積比文獻(xiàn)大或小都會使方法不能重現(xiàn)滯后體積的變化會導(dǎo)致梯度重現(xiàn)性不好l普通分析型液相色譜的滯后體積為24ml滯后體積變化的影響設(shè)計不好的HPLC系統(tǒng)，滯后體積隨反壓變化滯后體積隨反壓變化的后果：梯度的準(zhǔn)確性不好，造成：方法的適應(yīng)性不好用靜態(tài)梯度混合器；固定滯后體積可明顯改善梯度特性梯度百分比保留時間梯度曲線好的梯度滯后曲線保留時間梯度百分比不好的梯度滯后曲線固定滯后體積，改善了梯度性能普通的低壓梯度系統(tǒng)液相色譜的色譜柱色譜柱的連接 Stop_d

7、epth長度不合適造成柱前死體積 錐箍錐度不合適造成滲漏 色譜柱的連接 l除去柱上端固定相變色部分 (約3mm左右)，再補充新的固定相。 l色譜柱吸附未被洗脫成分時，柱效將明顯下降，選合適的溶劑進(jìn)行洗凈。 l采用梯度洗脫時，柱在重復(fù)使用前，用泵把幾倍于柱體積的起始溶劑壓經(jīng)柱子，以重新建立起始的平衡來得到再生。可能提高柱效的方法HPLC檢測器應(yīng)提供的功能對樣品有響應(yīng)并有一個輸出信號應(yīng)該提供在檢測器響應(yīng)值與樣品濃度之間的線性關(guān)系；并且所設(shè)計的校正技術(shù)應(yīng)該促進(jìn)這種關(guān)系理想的HPLC檢測器高靈敏度；可忽略的基線噪音寬的線性范圍獨立于流動相及操作參數(shù)的響應(yīng)對壓力、溫度及流速等變化不敏感長時間操作的穩(wěn)定性

8、低死體積非破壞性選擇性靈敏度：信噪比靈敏度是信號與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比值（S/N）檢測限（LOD）：S/N = 24定量限（LOQ）：S/N = 810好的信噪比有利于：更好的色譜峰確認(rèn)更好的定量更好地完成色譜峰純度/均一性6:1NS吸光度（Absorbance UV/Vis）檢測目前實驗室中最流行的選擇多數(shù)公司約75%的檢測器是吸光度檢測器（其中50%是多波長，25%是PDA）測量通過溶液后的紫外或可見光光強度的損失吸光度與樣品濃度呈線性關(guān)系在被測物的最大吸收波長處檢測時靈敏度最大吸光度檢測器（UV/Vis） 優(yōu)點這種檢測器簡單、可靠多數(shù)人熟悉并喜歡這種技術(shù)可以作梯度實驗并且是非

9、破壞性的大多數(shù)有機(jī)化合物有一定程度的吸光度一般來說靈敏度還可以AU0.000.050.100.15Minutes0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00Parabens at 254 nm吸光度檢測器（UV/Vis） 缺點由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用檢測器對某些化合物的檢測靈敏度不及其他檢測器樣品中不同化合物的最大吸收波長不同時，需要使用多波長檢測，或使用折衷的波長受流動相組成的影響：用截止波長以上至少510nm作為工作波長緩沖鹽、離子對試劑、胺改性劑也會有影響背景吸收對紫外檢測器噪音的影響UV Spectrum of El

10、uents with 0.1% TFA Against HPLC Grade H2O BlankAU0.000.100.200.300.400.500.600.700.800.901.001.101.201.301.401.50nm200.00210.00220.00230.00240.00250.00260.00270.00280.00290.00H20 with 0.1% TFA50% ACN with 0.1% TFA溶劑混合的基線噪音色譜條件色譜柱：C18, 5 m, 3.9x150mm at 35 C.流動相： A: 0.1% TFA in Water.B: 0.1% TFA in

11、Acetonitrile.梯度： 5 - 40% B in 35 min.流速： 1.0 mL/min.樣品： 水（10 L inj. vol.）檢測： 214 nm 圖1；好的梯度系統(tǒng) 圖2；一般的二元梯度系統(tǒng) 圖3；一般的四元梯度系統(tǒng)為何如此重要？五個小肽的5ng進(jìn)樣，好的色譜系統(tǒng)非常容易鑒別出所有峰。在不好的色譜系統(tǒng)中，第一個峰則消失在基線噪音中?；€噪音對積分的影響1.2241.1831.183Caffeine 271 nm維護(hù)流程圖吸濾頭單向閥柱塞密封圈線路過濾器進(jìn)樣器檢測器吸濾頭定期清洗，更換溶劑時單向閥定期清洗，壓力波動大時泵自動清洗在線過濾器壓力大時清洗材料：不銹鋼燒結(jié)，孔徑1

12、0um故障：堵塞表現(xiàn)：管路中不斷有氣泡生成措施：用5稀硝酸，超聲波清洗， 再用蒸餾水清洗吸濾頭吸濾頭故障：寶石球或塑料墊片受污導(dǎo)致密封不好表現(xiàn)：系統(tǒng)壓力波動大措施：打開排液閥，以異丙醇為流動相輸液拆下單向閥，放入異丙醇中，超聲波清洗單向閥單向閥故障：堵塞現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力波動大或壓力 偏高措施：5稀硝酸，超聲波清洗判斷依據(jù)：關(guān)閉排液閥，斷開出口管路，設(shè)定流速1mL/min，如壓力3kgf/cm2，則堵塞。線路過濾器線路過濾器排液閥壓力傳感器線路過濾器流動相泵的保養(yǎng)：使用流動相盡量要清潔；進(jìn)液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗；流動相交換時要防止沉淀； 避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡；每次分析結(jié)束后，要反復(fù)沖洗進(jìn)樣口，

13、防止樣品的交叉污染；柱的保養(yǎng)：柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動；當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時，閥件或管路一定要清洗干凈；要注意流動相的脫氣；避免使用高粘度的溶劑作為流動相；進(jìn)樣樣品要提純；嚴(yán)格控制進(jìn)樣量；每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品；每天分析測定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗蝗舴治鲋L期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存并封閉；色譜柱柱內(nèi)體積和平衡時間單次樣品運行時間單次樣品運行時間 = 分析時間分析時間 + 色譜柱平衡時間色譜柱平衡時間色譜柱平衡時間色譜柱平衡時間 = 10倍柱內(nèi)體積倍柱內(nèi)體積 流速流速4.6 x 500.5 mL5 min4.6 x 300.3 mL3 min4.6 x 150.15 mL1.5 min4.6 x 1501.54 mL15 min2.1 x 500.10 mL5 min60 sec2.1 x 300.06 mL3 min36 sec2.1 x 150.03 mL1.5 min18 sec色譜柱色譜柱柱內(nèi)柱內(nèi) 平衡時間平衡時間 尺寸尺寸體積體積 流速流速(mm)(Vm) 1.0 mL/min色譜柱色譜柱柱內(nèi)柱內(nèi) 平衡時間平衡時間 尺寸尺寸體積體積 流速流速(mm)(Vm) 0.2 mL/min 1.0mL/m