分子生物學(xué)實驗2015

1、分子生物學(xué)實驗 華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗?zāi)夸?基本原理 1. 基因組DNA 的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫、Southern 雜交及PCR 分離基因等。 2.不同生物（植物、動物、微生物）的基因組DNA 的提取方法有所不同; 不同種類或同一種類的不同組織因其細胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，分離方法也有差異。 3. 在提取某種特殊組織的DNA 時必須參照文獻和經(jīng)驗建立相應(yīng)的提取方法, 以獲得可用的DNA 大分子。尤其是組織中的多糖和酚類物質(zhì)對隨后的酶切、PCR 反應(yīng)等有較強的抑制作用,因此用富含這類物質(zhì)的材料提取基因組DNA 時, 應(yīng)考慮除去多糖和酚類物質(zhì)。4.核酸是生物有機體中的重要成分，在生物體

2、中核酸通常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分為DNA和RNA，在真核生物中，前者主要存在于細胞核中，后者主要存在于細胞質(zhì)和核仁里。在制備核酸時，通過研磨破壞細胞壁和細胞膜，使核蛋白被釋放出來。5. 植物基因組DNA的提取程序： （1）破碎組織 （2）破壞細胞膜 （3）去除雜質(zhì) （4）沉淀基因組DNA6. DNA的檢測方法 （1）紫外分光光度法 （2）電泳檢測DNA的質(zhì)量 本實驗是通過SDS法提取擬南芥基因組DNA。1.通過SDS提取擬南芥基因組DNA;2.為從擬南芥基因組DNA克隆目的基因作準備二 實驗?zāi)康膬x器及耗材： 研缽、微量移液器及吸頭、EP管、臺式離心機。材 料： 擬南芥小

3、苗試 劑： DNA Extract Buffer (0.2M NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS, pH 7.5); 70%乙醇；酚；氯仿；異丙醇;RNase儀器、材料和試劑實驗步驟 1. 取一定量的擬南芥組織; 2. 加入600 l抽提緩沖液（0.2M NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS, pH 7.5），室溫下快速研磨; 3. 把抽提液從研缽中移至1.5 ml 離心管中，混勻; 4. 12,000 rpm, 離心10 min (RT)。取上清，加等體積的酚/氯仿（1：1）混合液，上下顛倒混勻； 5. 12,000 rpm, 5min (RT) ，取上清，加等

4、體積的異丙醇，上下顛倒混勻； 6. 12,000 rpm, 10min (RT) ，棄上清，倒置于吸水紙上待壁上液體流盡后加入1ml的70%乙醇洗沉淀； 7. 12,000 rpm, 5 min (RT) ，棄上清，倒置于紙巾上待其干燥； 8 加20 l ddH2O溶解沉淀; 9.在溶解DNA中加入3-5 l RNase，37消化2-3h； 10.補充ddH2O至總體積400 l ，加入等體積的酚/氯仿，混勻； 11.12000rpm，5min（RT）， 12.取上清，加入1/10體積的乙酸鈉和2倍體積的無水乙醇，-20 放置10min; 13.12000rpm，4 離心10min； 14.去

5、上清，70%乙醇洗滌沉淀,12000rpm，4 離心5min; 15.去上清，沉淀干燥后，加入20 l ddH2O溶解DNA； 16.分光光度計法檢測DNA的濃度和純度。實驗報告分析A260=1時相當于50 g的雙鏈DNA。A260/A280=1.8，DNA純度高。A260/A2801.9,有RNA的污染或者降解。A260/A230在2.02.5，DNA純度高。A260/A2302.0,有糖類，鹽類或者有機溶劑污染。注意事項（1）選用幼嫩植物組織，可減少淀粉類的含量。（2）植物組織充分勻漿。（3）DNA的二級結(jié)構(gòu)和雙鏈易受多種因素的影響引起雙鏈解開，即“變性”，因此抽提時避免使用變性的條件。（

6、4）抑制內(nèi)外源DNase的活力。（5）防止化學(xué)降解。（6）防止物理因素降解。思考題.1在擬南芥基因組提取緩沖液中，EDTA和SDS的作用分別是什么？ 1溶液I溶菌液： 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當溶液中pH小于8時，溶菌酶作用受到抑制。 葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械剪切力作用而降解。 EDTA：（1）螯合Mg2、Ca2等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用（DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應(yīng)要求有較低的離子強度的環(huán)境。

7、2溶液IINaOHSDS液： NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。 但當pH12或pH3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。 在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1L，加抽提液時，該系統(tǒng)的pH就高達12.6， 因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。 SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有： （1）溶解細胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。 （2）解聚細胞中的核蛋白。 （3）SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-R-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。 但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中

8、 （用RNase去除RNA時）受到干擾。 3. 溶液III-3molL NaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。 所以該溶液實際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調(diào)回pH至中性， 使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3molL NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、 RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合， 后者是因為鈉鹽與SDS蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。 4為什么用無水乙醇沉淀DNA？

9、 用無水乙醇沉淀DNA，這是實驗中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點是可以任意比和水相混溶， 乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。 DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67左右。 因而也可改用95乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠遠比95乙醇昂貴）。 但是加95的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大， 一 實驗原理 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈式

10、反應(yīng))是一種選擇性體外擴增DNA 的方法.它包括三個基本步驟: (1) 變性(Denature):目的雙鏈DNA 片段在94下解鏈; (2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當溫度(56左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對; (3) 延伸(Extension):在TaqDNA 聚合酶合成DNA 的最適溫度下,以目的DNA 為模板進行合成. 由這三個基本步驟組成一輪循環(huán),理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA 擴增一倍,這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA 又可作為下一輪循環(huán)的模板,所以經(jīng)25-35 輪循環(huán)就可使DNA 擴增達待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。PCR原理FLASH演示PCR技術(shù)發(fā)展 PCR是2

11、0世紀80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍。 PCR技術(shù)是生物科學(xué)領(lǐng)域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。 1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。 Mullis因發(fā)明了“聚合酶鏈式反應(yīng)”而獲得1993年度諾貝爾化學(xué)。 Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點是：Klenow酶不耐高溫， 90會變性失活，每次循環(huán)都要重新加。引物鏈延

12、伸反應(yīng)在37下進行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。 Klenow這些缺點給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。 Taq DNA Polymerase 1988年Saiki 等從水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取耐高溫的Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase) ， 此酶在93下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%。 缺點： Taq DNA Polymerase只有53 聚合酶活性，但沒有3 5外切活性，無法消除突變和錯配，堿基錯誤摻入率可達10-4/

13、堿基/循環(huán) Pfu DNA Polymerase Pfu DNA 聚合酶是已知保真度最高的聚合酶，來自于Pyrococcus furiosis 菌株，不僅具有摻入反應(yīng)迅速及熱穩(wěn)定性高的優(yōu)點，更是當前市場上所有DNA聚合酶中摻入出錯率最低的一種。 優(yōu)點：Pfu具有3 5校閱功能，其錯配率分別僅為10-7。 缺點：效率低，擴增片段較短 Taq Plus DNA Polymerase 是Taq和Pfu DNA 聚合酶的混合物，與Taq DNA聚合酶相比，具有擴增長度增加（簡單模板可有效擴增20kb,復(fù)雜模板可有效擴增10kb), 保真度好的特點；與Pfu DNA 聚合酶相比，具有擴增速度快，反應(yīng)效率

14、高的優(yōu)勢。 PCR反應(yīng)體系組成 模板 5引物和3引物 4 種dNTP DNA 聚合酶 Mg2+ 反應(yīng)緩沖液1. 模板 PCR 反應(yīng)必須以DNA 為模板進行擴增, 模板DNA 可以是單鏈分子,也可以是雙鏈分子,可以是線狀分子,也可以是環(huán)狀分子 就模板DNA 而言,影響PCR 的主要因素: 純純 度度: 蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)會抑制蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)會抑制PCR反應(yīng)反應(yīng) 完整性完整性: 模板降解會導(dǎo)致模板降解會導(dǎo)致PCR擴增無產(chǎn)物擴增無產(chǎn)物 濃濃 度度: 加量過多導(dǎo)致非特異性擴增增加加量過多導(dǎo)致非特異性擴增增加2. 引物 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR

15、成敗的關(guān)鍵 引物影響因素：特異性：特異性： 長度適當、避免二級結(jié)構(gòu)和二聚體長度適當、避免二級結(jié)構(gòu)和二聚體完整性：完整性： 避免反復(fù)凍融避免反復(fù)凍融濃濃 度：度： 應(yīng)適當應(yīng)適當,過高導(dǎo)致非特異性增加過高導(dǎo)致非特異性增加,過低則過低則 擴增產(chǎn)物太少擴增產(chǎn)物太少引物設(shè)計原則(1) 引物長度： 約為16-30b(2) G+C含量： G+C含量通常為40%-60%, 較短引物可粗略估計Tm4(G+C)+2(A+T).(3) 四種堿基隨機分布，在3端不存在連續(xù)3 個G 或C,因這樣易導(dǎo)致錯誤引發(fā)。(4) 在引物內(nèi)及兩引物之間, 尤其在3端應(yīng)不存在二級結(jié)構(gòu)。(5) 引物5端對擴增特異性影響不大, 可在引物設(shè)

16、計時加上限制酶位點。 (6)引物不與模板結(jié)合位點以外的序列互補4 種 dNTP 濃度適當，避免反復(fù)凍融濃度適當，避免反復(fù)凍融 dNTP 原液配成10mM或者2.5mM分裝,-20oC貯存。 一般反應(yīng)中每種dNTP 的終濃度為20-200M。當dNTP 終濃度大于50mM 時可抑制Taq DNA 聚合酶的活性. 4 種dNTP 的濃度應(yīng)該相等,以減少合成中由于某種dNTP 的不足出現(xiàn)的錯誤摻入。Mg2+ 過高非特異性嚴重，過低無擴增產(chǎn)物過高非特異性嚴重，過低無擴增產(chǎn)物 Mg2+濃度對DNA 聚合酶影響很大,它可影響酶的活性,影響引物退火和解鏈溫度, 影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。 通常

17、Mg2+濃度范圍為0.5-3mM。 試劑公司通常會將Mg2+加入到DNA 聚合酶的反應(yīng)緩沖液中： 10Reaction Buffer (including Mg2+) 10Reaction Buffer (without Mg2+)DNA 聚合酶Taq DNA Polymerase活性半衰期為95 40min, 97 5min.Taq DNA 聚合酶的酶活性單位定義為74下,30min,摻入10nmol/L dNTP 到核酸中所需的酶量。Taq DNA 聚合酶的一個致命弱點是它的出錯率,一般PCR 中出錯率為210-4 核苷酸/每輪循環(huán),100l PCR 反應(yīng)中,1.5-2 單位的Taq DN

18、A 聚合酶就足以進行30 輪循環(huán). 反應(yīng)結(jié)束后，如果需要利用這些產(chǎn)物進行下一步實驗,需要預(yù)先滅活Taq DNA 聚合酶, 滅活Taq DNA 聚合酶的方法有：(1) PCR 產(chǎn)物經(jīng)酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L 的EDTA螯合Mg2+ 。 (3) 99-100加熱10min.目前已有直接純化PCR 產(chǎn)物的Kit 可用。Taq /Pfu /Taq Plus DNA Polymerase DNA 聚合酶單位定義：1個酶單位是指在以下分析條件下，于74，30min內(nèi)使10nmol/L的dNTP摻入核酸中所需的酶。 不同公司提供的酶U的定義也不同。反應(yīng)緩沖液 各種DNA聚合酶都

19、有自己特定反應(yīng)緩沖液； Taq DNA Polymerase反應(yīng)緩沖液一般含： 10-50mM TrisCl (20下pH8.3-8.8) 50mM KCl 適當濃度的Mg2+ 緩沖液緩沖液 10 mmol/l Tris.Cl 提供適合反應(yīng)的pH值（pH 8.4） 50 mmol/l KCl促進引物退火 10 g/ml 明膠或血清白蛋白 為Taq酶的保護劑PCR反應(yīng)反應(yīng)主要參數(shù)：主要參數(shù)：1. 預(yù)變性：預(yù)變性：94C， 3-5min2. 變性：變性： 94C，30s-1min3. 復(fù)性：復(fù)性： 56 C，20s-2min4. 延伸：延伸： 72 C，30s-3min5. 總延伸：總延伸：72

20、C， 10min預(yù)變性和變性 在第一輪循環(huán)前,在94下變性35min 非常重要,它可使模板DNA 完全解鏈 。變性不完全,往往使PCR失敗,因為未變性完全的DNA雙鏈會很快復(fù)性,減少DNA產(chǎn)量. 一般變性溫度與時間為94 1min。在變性溫度下,雙鏈DNA 解鏈只需幾秒鐘即可完全,所耗時間主要是為使反應(yīng)體系完全達到適當?shù)臏囟取Ｍ嘶?引物退火的溫度和所需時間的長短取決于引物的堿基組成，引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度.實際使用的退火溫度比擴增引物的Tm 值約低5。 通常退火溫度和時間為55左右,1-2min。延伸 延伸反應(yīng)通常為72,接近于Taq DNA 聚合酶的最適反應(yīng)溫度75.

21、實際上。 延伸反應(yīng)時間的長短取決于目的序列的長度和濃度。Taq DNA 聚合酶每分鐘約可合成2kb 長的DNA。 一般在擴增反應(yīng)完成后,都需要一步較長時間(10-30min)的延伸反應(yīng),以獲得盡可能完整的產(chǎn)物, 這對以后進行克隆或測序反應(yīng)尤為重要。循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA 濃度。一般而言25-30 輪循環(huán)已經(jīng)足夠。 循環(huán)次數(shù)過多,會使PCR 產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。1.通過PCR從擬南芥基因組中擴增目的基因片段2.學(xué)習(xí)PCR儀等儀器的使用實驗?zāi)康牟牧希簲M南芥基因組DNA器材：移液器及吸頭，PCR 管， PCR儀，臺式離心機。實驗材料和器材所需試劑10PCR 反應(yīng)緩沖液 dNTP

22、Mix:每種10 mM 5和3引物：各10 pmol/l （10mmol/L） Taq DNA 聚合酶 5U/l 無菌去離子水；實驗步驟1. 在PCR管中依次混勻下列試劑(總體積50l ) 5 l 10Buffer (Including MgCl2) 1l dNTP mix （各10 mM ） 1l 5上游引物 （ 10M ） 1l 3下游引物 （ 10M ） 模板DNA (1000 ng) 0.25 l Taq DNA聚合酶 補充ddH2 O 至50l 混勻后短暫離心（點離）。2. 將PCR管放置到PCR儀中，蓋好蓋子3. 用94oC預(yù)變性3-5分鐘；94oC變性1分鐘，58oC退火1 分鐘

23、, 72oC延伸2 分鐘, 30個循環(huán)；最后一輪循環(huán)結(jié)束后, 于72oC下保溫10 分鐘，4. 終止反應(yīng)，從PCR儀取出PCR管，放置4oC存 1.PCR 非常靈敏, 盡可能避免污染。吸頭、離心管應(yīng)高壓滅菌, 每次吸頭用畢應(yīng)更換, 不要互相污染試劑； 2.加試劑前, 應(yīng)短促離心10 秒鐘, 然后再打開管蓋, 以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側(cè)面； 3.應(yīng)設(shè)含除模板DNA 所有其它成分的負對照。注意事項思考題 簡述PCR技術(shù)克隆的主要原理。一、實驗原理一、實驗原理瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖

24、的濃度。性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶影響DNA 遷移速率因素DNA分子泳動主要的因素分兩方面：DNA分子特性和電泳條件。1. DNA 的分子大小:2. DNA 分子的構(gòu)象3. 瓊脂糖濃度4. 電源電壓5. 嵌入染料的存

25、在6. 離子強度影響 瓊脂糖是從瓊脂中分離得到，由1,3連接的吡喃型b-D-半乳糖和1,4連接的3,6脫水吡喃型阿a-L-半乳糖組成，形成相對分子量為104105的長鏈。 瓊脂糖加熱溶解后分子呈隨機線團狀分布，當溫度降低時鏈間糖分子上的羥基通過氫鍵作用相連接，形成孔徑結(jié)構(gòu)，而隨著瓊脂糖濃度不同形成不同大小的孔徑 瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.2312.00.12瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍核酸電泳緩沖液有三種Tris-乙酸(TAE) 、Tris-硼酸(TBE)和 Tris-磷酸(TPE). DN

26、A電泳上樣緩沖液電泳上樣緩沖液 DNA Loading Buffer作用 1.螯合Mg2，防止電泳過程中DNA被降解，一般上樣緩沖液中含10mM EDTA。 2. 增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔，一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。 3. 指示劑監(jiān)測電泳的行進過程，一般加入泳動速率較快的溴酚藍指示電泳的前沿，它的速率約與300bp的線狀雙鏈DNA相同。DNA電泳的標準分子量電泳的標準分子量 目前各廠商開發(fā)了各種類型的標準分子量，有廣泛用于PCR產(chǎn)物鑒定的小分子Marker，也有常規(guī)用的大分子Marker常用的DNA標準分子量電泳圖 二、實驗?zāi)康亩嶒災(zāi)康?1

27、 掌握瓊脂糖凝膠電泳分離掌握瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的的原理和方法原理和方法2 通過瓊脂糖凝膠電泳檢測通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCRPCR擴擴增的目的基因增的目的基因儀器及耗材：天平、電泳設(shè)備、臺式離心機、稱量紙、藥勺、微量移液器及吸頭、EP管、封口膜、三角瓶、微波爐、凝膠成像系統(tǒng)。材 料： PCR產(chǎn)物試 劑： 瓊脂糖，1TAE電泳緩沖液電泳緩沖液、溴化乙錠（溴化乙錠（EB）、6Loading buffer、無菌去離子水、DNA Marker；三、實驗儀器、材料和試劑三、實驗儀器、材料和試劑四、實驗步驟四、實驗步驟1. 1g 瓊脂糖加入瓊脂糖加入100ml 0.5TAE電泳緩沖液中，電泳緩沖液中

28、，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。2. 將制膠板放好，插入適當梳子，將溶解的瓊將制膠板放好，插入適當梳子，將溶解的瓊脂糖（約脂糖（約50）倒入，室溫冷卻凝固）倒入，室溫冷卻凝固3. 充分凝固后將膠板取出，小心垂直向上拔出充分凝固后將膠板取出，小心垂直向上拔出梳子，置入電泳槽中，加梳子，置入電泳槽中，加0.5TAE電泳緩沖電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠液至液面覆蓋凝膠1-2mm。4. 用移液器吸取用移液器吸取3l 的的6loading buffer于封口膜上，于封口膜上，再加入再加入5l DNA樣品，混勻后，小心加入點樣孔。樣品，混勻后，小心加入點樣孔。 5

29、. 打開電源開關(guān)，打開電源開關(guān)，一般紅色為正極黑色為負極一般紅色為正極黑色為負極，調(diào)調(diào)節(jié)電壓至節(jié)電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍條帶由負極向，可見到溴酚藍條帶由負極向正極移動，電泳約正極移動，電泳約30min-60min。6. 在瓷盤中加入適量的水，再加入在瓷盤中加入適量的水，再加入5 510l EB10l EB，將凝膠放入盤中將凝膠放入盤中5 510 10 分鐘分鐘 7. 將凝膠置于凝膠成像儀內(nèi)，在紫外燈下檢測將凝膠置于凝膠成像儀內(nèi)，在紫外燈下檢測PCRPCR產(chǎn)物的產(chǎn)物的DNADNA條帶條帶思考題 瓊脂糖凝膠電泳中DNA分子遷移率受哪些因素影響？1、DNA的分子大小及構(gòu)型 2、瓊脂糖濃度3

30、、DNA分子的構(gòu)象4、電源電壓5、嵌入染料的存在 6、離子強度影響 一、實驗原理一、實驗原理目的基因與載體連接 平末端連接 粘性末端連接 T載體策略連接平末端連接 Taq DNA 聚合酶往往在PCR 產(chǎn)物3端加上多余的非模板依賴堿基,在用平末端連接克隆PCR 產(chǎn)物前,可用Klenow 片段或T4 DNA 聚合酶處理補平末端。 有些DNA聚合酶（pfu DNA 聚合酶）擴增的PCR產(chǎn)物為平端，可以直接用于平端連接粘性末端連接 利用引物中附加在5端的限制酶位點,直接將PCR 產(chǎn)物經(jīng)適當?shù)南拗泼盖懈詈螽a(chǎn)生粘性末端,與載體連接,產(chǎn)生重組DNA. 如果下游兩個引物中含有兩個不同的限制酶位點.經(jīng)酶切后定向

31、克隆到載體中。T-載體連接 TaqDNA聚合酶能在平端雙鏈DNA的3末端加一個非模板依賴堿基(A或T),所加堿基多為A。 利用這一特點,可以經(jīng)限制酶(如EcoRV)切割載體,使其產(chǎn)生平末端,再利用Taq DNA聚合酶向載體雙鏈DNA的3末端加上T ,使載體與PCR 產(chǎn)物末端互補并進行連接 pMD18-T Vector pMD18-T Vector是一種高效克隆PCR產(chǎn)物（TA Cloning）的專用載體。用EcoR V進行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3端添加“T”而成。，本制品中的高效連接液Solution I可以在短時間內(nèi)（約30分鐘）完成連接反應(yīng)，大大方便了實驗操作。pMD18-T Vector

32、的結(jié)構(gòu)二、實驗?zāi)康亩?、實驗?zāi)康?1. 通過通過T T載體策略進行目的基因與載體策略進行目的基因與載體的連接載體的連接儀器及耗材：臺式離心機、微量移液器及吸頭、EP管、封口膜、水浴鍋。材 料： PCR產(chǎn)物試 劑： 無菌去離子水；pMD18-T 三、實驗儀器、材料和試劑三、實驗儀器、材料和試劑四、實驗步驟四、實驗步驟 1.將PCR產(chǎn)物移入1.5mLEP管中，加去離子水至400 l，加入1/10倍體積的3MNaAc和2.5倍體積的無水乙醇，混勻，-20放置10min； 2.12000rpm，4，離心10min； 3.去上清，將EP管倒置于吸水紙上； 4.向EP管加入適量70%乙醇，將DNA沉淀重懸；

33、 5.12000rpm， 4，離心5min； 6.去上清，倒置吸水紙上，晾干，加入10 l去離子水溶解DNA。7.測定測定DNA的濃度；的濃度；8.沉淀的目的基因沉淀的目的基因DNA與與T載體連接：載體連接：取一新的取一新的PCR管，加入下列反應(yīng)成分管，加入下列反應(yīng)成分(總體積總體積10l) ： 目的目的 DNA 4.5 ll (0.1 pmol0.3 pmol) pMD18-T Vector 0.5 l 加入加入5 l（等量）的（等量）的 Solution I；9. 16OC水浴中反應(yīng)水浴中反應(yīng)30分鐘。分鐘。10.將連接產(chǎn)物將連接產(chǎn)物-20保存。保存。思考題 簡述目的DNA片段與載體連接的

34、不同策略。實驗五 大腸桿菌感受態(tài)細胞制備一 實驗原理 在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過細菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi),但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中,一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因,因此不能憑自己的能力進入細菌 。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進受體細菌，需誘導(dǎo)受體細菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。 細菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)。感受態(tài)細胞制備方法化學(xué)法: CaCl2 處理后細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞 ;物理法: 大腸桿菌暴露在電荷中時，其細胞膜會不穩(wěn)定而誘導(dǎo)形成孔洞，于是DNA分子可由該孔進入細胞。感受態(tài)細胞制備中應(yīng)注意因素1.細胞生長狀態(tài)和

35、密度 不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于的培養(yǎng)菌，最好從70或-20甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。 細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600 來控制。DH5菌株的OD600 為0.5 時,細胞密度在5107 個/ml 左右(不同的菌株情況有所不同),這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。2. 試劑的質(zhì)量 所用的試劑,如CaCl2 等均需較高純度，冰箱保存。3. 防止雜菌和雜DNA 的污染 整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等最好是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA 酶或雜DNA所

36、污染。二 實驗?zāi)康?.學(xué)習(xí)以 E.coli DH5菌株為受體細胞，用CaCl2處理受體菌使其處于為感受態(tài)；2. 制備大腸桿菌感受態(tài)細胞，為轉(zhuǎn)化實驗作準備。儀器及耗材：培養(yǎng)皿、細菌投布器、三角瓶、牙簽、恒溫搖床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、分光光度計、冷凍離心機、1.5mL離心管、無菌工作臺材 料： E. coli DH5菌株試 劑： LB 固體和液體培養(yǎng)基、 100 mM CaCl2、甘油。三、實驗儀器、材料和試劑三、實驗儀器、材料和試劑LB 液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani)配方： 蛋白胨(Tryptone) 1 g 酵母提取物(Yeast extract) 0.5 g NaCl 1 g 加去離子

37、水至總體積100 mL，用NaOH 調(diào)pH 至7.0,高壓滅菌LB 固體培養(yǎng)基配方：每100mL LB液體培養(yǎng)基中加1.2g 瓊脂粉,高壓滅菌。四 實驗步驟實驗步驟 菌株活化1用接種環(huán)直接取凍存的大腸桿菌DH5，在LB培養(yǎng)基平板表面劃線，于37培養(yǎng)16小時；2挑取一個單菌落，轉(zhuǎn)到10 ml LB培養(yǎng)基中，于37培養(yǎng)35小時；3將培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)到100mlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)23小時，到OD600 0.45-0.55感受態(tài)細胞制備4. 將1.5ml菌液轉(zhuǎn)入離心管中，冰上10 min;5.4oC，4,000 rpm，離心5 min；6. 去上清，將沉淀重懸于0.5 ml用冰預(yù)冷的 100 mM CaCl

38、2中，置于冰上10 min；7. 4oC，4,000 rpm，離心5 min；8. 去上清，將沉淀重懸于100L用冰預(yù)冷的 100 mM CaCl2溶液中，再加入75%甘油至終濃度 為15-20% (25l),混勻；9. 即成感受態(tài)細胞，-70oC冰箱中保存.思考題 感受態(tài)細胞有什么特點？簡述感受態(tài)細胞制備的原理特點：處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài)CaCl2法：操作： 1.將快速生長的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（0）預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，便會造成細胞膨脹，細胞膜通透性發(fā)生變化，極易與外源DNA相粘附并在細胞表面形成復(fù)合物。2.此時，將該體系轉(zhuǎn)移到42下做短暫的熱刺激，外源DNA就可能被細胞

39、吸收。進入細胞的外源DNA分子通過復(fù)制、表達，實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。3.將轉(zhuǎn)化后的細胞在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選出帶有外源DNA分子的陽性克隆。意義：將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞進行表達，不僅可以檢驗重組載體是否構(gòu)建成功，最主要的是感受態(tài)細胞作為重組載體的宿主可以進行后續(xù)實驗，如蛋白質(zhì)表達純化等工作。 實驗六 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌一 實驗原理 轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA 分子引入受體細胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù)。 大腸桿菌感受態(tài)細胞與重組質(zhì)粒DNA放置在冰浴(0oC)，CaCl

40、2低滲溶液中，細菌細胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基鈣磷酸復(fù)合物粘附于細胞表面，經(jīng)突然熱激（42oC）處理，更有利于細胞對DNA復(fù)合物的攝取，外源DNA分子通過吸附、轉(zhuǎn)入、自穩(wěn)而進入細胞內(nèi)，并且開始進行復(fù)制和表達。 將細菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時間，促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得的新的表型(如Ampr等)得到表達，然后將此細菌培養(yǎng)物涂在含有氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基上。 分子轉(zhuǎn)化分以下幾步:吸附雙鏈分子吸附于受體菌表面；轉(zhuǎn)入雙鏈分子解鏈。一條鏈進入受體菌，另一條降解； 自穩(wěn)外源質(zhì)粒分子在細胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈；表達一供體基因隨同復(fù)制子同時復(fù)制，分裂， 轉(zhuǎn)錄翻譯。二 實驗?zāi)康?將目的

41、基因與質(zhì)粒的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌（重組載體的篩選最準備儀器及耗材：培養(yǎng)皿、細菌投布器、三角瓶、恒溫搖床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋、無菌工作臺材 料： 目的基因與載體的連接產(chǎn)物；大腸桿菌感受態(tài)細胞試 劑： LB 固體和液體培養(yǎng)基、氨芐青霉素(100 mg/mL)、IPTG (200 mg/mL) 、X-gal (20mg/mL),。三、實驗儀器、材料和試劑三、實驗儀器、材料和試劑氨芐青霉素(Amp)配置： 無菌水配制氨芐青霉素成100 mg/mL 溶液，過濾除菌，-20oC冰箱保存；X-gal配置： 將X-gal溶于二甲基甲酰胺中，配成20 mg/mL濃度的溶液，裝于玻璃或聚丙烯管中，以錫鉑紙包裹

42、避光保存于-20oC， X-gal不需要過濾除菌；IPTG配置： 將2 g IPTG溶于8 mL水中，用水調(diào)節(jié)體積到10 mL, 過濾除菌， -20oC冰箱保存。固體LB平板的準備1. 固體LB培養(yǎng)基的配置：每100 mL液體LB培養(yǎng)基加入1.2 g瓊脂粉，pH 7.0，高溫滅菌；2. 固體LB培養(yǎng)基融化后，冷卻到50oC，加入氨芐青霉素（100g/mL），再倒入滅菌的平板內(nèi)；3.在LB固體培養(yǎng)基表面均勻投布4L IPTG (200 mg/mL)和40L x-gal (20mg/mL),吹干;四 實驗步驟4. 從-70oC冰箱中取出感受態(tài)細胞,置冰上解凍；5. 在超凈臺上，取 10 l 連接產(chǎn)

43、物加入到感受態(tài)細胞中，充分混勻，冰上放置30 min；6. 42oC熱激處理90 sec，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5 分鐘； 7.加入600800 l無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37oC，5060 rpm溫育45 min，使細菌恢復(fù)正常生長狀態(tài),并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因； 8.菌液均勻涂布到含有抗生素（Amp 100 g/ml,并均勻的涂布有IPTG和X-gal）的LB平板上吹干，將培養(yǎng)皿倒置于37oC，培養(yǎng)16 h； 思考題 觀察實驗結(jié)果，你的平板上出現(xiàn)單菌落沒有？分析總結(jié)一下影響轉(zhuǎn)化效率的因素。4.2.1 細胞的生長狀態(tài)和密度 最好從-70甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的

44、菌液。細胞生長密度以每毫升培養(yǎng)液中的細胞數(shù)在5107個左右為佳。即應(yīng)用對數(shù)期或?qū)?shù)生長前期的細菌，可通過測定培養(yǎng)液的OD600控制。 4.2.2 質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但外源DNA的量過多時，則會使轉(zhuǎn)化率下降。一般來說，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細胞體積的5%，1ng的超螺旋DNA即可使50ul的感受態(tài)細胞達到飽和。對于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低。此外，重組DNA分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高10100倍。 4.2.3 試劑的質(zhì)量 化合

45、物及無機離子的影響：所用的CaCl2等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，分裝保存于4。在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價金屬離子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高。 4.2.4 防止雜菌和雜DNA的污染 整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管、移液槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的制劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。實驗七 陽性克隆的鑒定和篩選 將目的基因與載體進行連接形成重組子并轉(zhuǎn)化后，在連接產(chǎn)物中既有載體和目的基因的連接，也有載體的自連和目的基因的自連，更多

46、的是未發(fā)生連接反應(yīng)的載體和目的DNA片斷。這就需要我們對陽性克隆進行鑒定和篩選，將含有外源DNA的宿主細胞和不含外源DNA的宿主細胞分開，將含有正確重組子的宿主細胞和含有其他外源DNA的宿主細胞分開。一 實驗原理 在我們的實驗中，目的基因與T載體(pMD18-T)連接產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化E. coli DH5菌株。由于pMD18-T 上帶有Ampr 和lacZ 基因,故重組子的篩選首先采用Amp 抗性篩選與-互補現(xiàn)象篩選相結(jié)合的方法。pMD18-T Vector的結(jié)構(gòu) 因pMD18-T帶有Ampr 基因而外源片段上不帶該基因,故轉(zhuǎn)化受體菌后只有帶有pMD18-T DNA 的轉(zhuǎn)化子才能在含有Amp 的LB

47、 平板上存活下來（質(zhì)粒自身環(huán)化和重組載體）;而只帶有自身環(huán)化的外源片段的轉(zhuǎn)化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。-互補 pMD18-TpMD18-T上帶有上帶有-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因(lacZ)(lacZ)的調(diào)控序列的調(diào)控序列和和-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N N 端端146 146 個氨基酸的編碼序列。這個個氨基酸的編碼序列。這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點, ,但并沒有破壞但并沒有破壞lacZ lacZ 的閱讀框架的閱讀框架, ,不影響其正常功能。不影響其正常功能。E. coli DH5E. coli DH5菌株菌株帶有帶有-半乳糖苷酶半乳糖苷酶C C 端部分序

48、列的編碼信息。在各自端部分序列的編碼信息。在各自獨立的情況下獨立的情況下, pMD18-T , pMD18-T 和和DH5DH5編碼的編碼的-半乳糖苷半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。當這種載體轉(zhuǎn)入可編碼酶的片段都沒有酶活性。當這種載體轉(zhuǎn)入可編碼 半半乳糖苷酶乳糖苷酶C C端部分序列的宿主細胞中時，在異丙基端部分序列的宿主細胞中時，在異丙基- - -D-D硫代半乳糖苷（硫代半乳糖苷（IPTGIPTG）的誘導(dǎo)下，）的誘導(dǎo)下，宿主可同時合成這宿主可同時合成這兩種肽段，兩種肽段，雖然它們各自都沒有酶活性，但它們可以雖然它們各自都沒有酶活性，但它們可以融為一體形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。所以稱這種現(xiàn)象融為一體

49、形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。所以稱這種現(xiàn)象為為 - -互補現(xiàn)象?；パa現(xiàn)象。 由互補產(chǎn)生的由互補產(chǎn)生的 半乳糖苷酶半乳糖苷酶( (LacLacZ)Z)能夠作用能夠作用于生色底物于生色底物5 5溴溴4 4氯氯3 3吲哚吲哚 D D半乳糖苷半乳糖苷(X-gal)(X-gal)而產(chǎn)生藍色的菌落，所以利而產(chǎn)生藍色的菌落，所以利用這個特點，在載體的該基因編碼序列之間人用這個特點，在載體的該基因編碼序列之間人工放入一個多克隆位點，當插入一個外源工放入一個多克隆位點，當插入一個外源DNADNA片段時，會造成片段時，會造成LacLacZ(Z( ) )基因的失活，破壞基因的失活，破壞 - -互補作用，就不能產(chǎn)生具有活

50、性的酶。所以，互補作用，就不能產(chǎn)生具有活性的酶。所以，有重組質(zhì)粒的菌落為白色，而沒有重組質(zhì)粒的有重組質(zhì)粒的菌落為白色，而沒有重組質(zhì)粒的菌落為藍色。菌落為藍色。重組重組DNADNA轉(zhuǎn)化細菌過轉(zhuǎn)化細菌過程示意圖程示意圖菌落PCR鑒定陽性克隆 并不是所有白斑菌落是含有重組質(zhì)粒的陽性菌落，存在假陽性現(xiàn)象?？梢酝ㄟ^菌落PCR進一步鑒定含有重組質(zhì)粒的陽性菌落。 常規(guī)的PCR鑒定需要進行細菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取等多步操作后才能進行基因擴增，操作繁瑣，耗時較長，為了簡化操作程序，Gussow和Clackon提出菌落PCR方法，即用無菌牙簽挑取單菌落到TE緩沖液中，煮沸5min，渦旋振蕩后短暫離心，用12L裂解液作D

51、NA模板，這樣就省去了抽提模板DNA這一步，大大節(jié)省了時間和成本。 后來該方法進一步改進，利用牙簽直接沾取一點單菌落作為模板進行擴增反應(yīng)更大量節(jié)省了時間，簡化了操作程序，單菌落PCR可以有效的篩選陽性重組克隆。二 實驗?zāi)康?. 學(xué)習(xí)通過藍白斑篩選陽性重組菌落；2.學(xué)習(xí)菌落PCR技術(shù)及通過菌落PCR鑒定白斑菌落。儀器及耗材：培養(yǎng)皿、電熱恒溫培養(yǎng)箱、無菌工作臺、牙簽、PCR管、各種tip、PCR儀。材 料： 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后的菌落平板三、實驗儀器、材料和試劑三、實驗儀器、材料和試劑試 劑： LB 液體培養(yǎng)基 氨芐青霉素(100 mg/mL) 10PCR 反應(yīng)緩沖液; dNTP Mix(每種2.5mM

52、); 5和3引物（10mM）; Taq DNA 聚合酶 2.5U/l; 無菌去離子水；1.建立PCR體系 (總體積20l ) 可以以小組為單位，現(xiàn)將上述各試劑混合，再分裝，如小組為4人，就在EP管中加入4倍體積的上述各組分（除菌液），在分裝到PCR管，這樣便于試劑取樣。 ddH2O 16.4 82l 10Buffer (Including MgCl2) 2.0 10l dNTP mix （各10 mM ） 0.4 2l 5上游引物 （ 10M ） 0.4 2l 3下游引物 （ 10M ） 0.4 2l Taq DNA聚合酶 0.4 2l2. 用牙簽從LB固體平板上挑取白斑單菌落在PCR管中攪拌

53、。四 實驗步驟3. 將PCR管放置到PCR儀中，蓋好蓋子；4. 用94oC預(yù)變性3-5分鐘；94oC變性1分鐘，58oC退火1 分鐘, 72oC延伸2 分鐘, 32個循環(huán)；最后一輪循環(huán)結(jié)束后, 于72oC下保溫10 分鐘；5. 終止反應(yīng)，從PCR儀取出PCR管，放置4oC存。五 注意事項1. X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖以半乳糖苷酶水解后生成的吲哚衍生物顯藍色。IPTG是異丙基硫代半乳糖苷為非生理性的誘導(dǎo)物，它可以誘導(dǎo)lacZ的表達。3. 在含有X-gal、IPTG的篩選培養(yǎng)基上，攜帶載體DNA的轉(zhuǎn)化子為藍色菌落，而攜帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落，平板如在37培

54、養(yǎng)后放于冰箱3-4小時可使顯色反應(yīng)充分，藍色菌落明顯。思考題 簡述利用藍白斑篩選重組子的原理一、實驗原理一、實驗原理 從細菌中分離質(zhì)粒DNA 方法包括3 個基本步驟: 1.培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增； 2.收集和裂解細胞; 3.分離和純化質(zhì)粒DNA。1. 細菌培養(yǎng) 質(zhì)粒的擴增與質(zhì)粒在細菌細胞內(nèi)的拷貝數(shù)和細菌個數(shù)正相關(guān)。 質(zhì)粒拷貝數(shù)是指在正常生長條件下，每個細菌細胞所對應(yīng)的平均質(zhì)粒數(shù)。在質(zhì)粒復(fù)制子調(diào)控下，質(zhì)粒拷貝數(shù)可隨細菌培養(yǎng)條件變化而在較窄的范圍波動，生長條件恒定，質(zhì)粒增殖速度與宿主細胞增殖速度完全一致，拷貝數(shù)保持不變。2.細菌的收獲與裂解 細菌的收獲可以通過離心來進行； 細菌的裂解可以采用多種方法，

55、這些方法包括非離子型或離子型去污劑、有機溶劑或堿進行處理及加熱處理等。 采用何種方法取決于三個因素：質(zhì)粒的大小、大腸桿菌菌株和裂解后用于純化質(zhì)粒DNA技術(shù)。 大質(zhì)粒（15kb）采用溫和方法 小質(zhì)粒（15kb ）可采用較劇烈方法 有些大腸桿菌菌株不能采用加熱的方法裂解；3. 分離和純化質(zhì)粒DNA 當用強熱或酸、堿處理時，細菌的線性染色體DNA 變性,而共價閉合環(huán)狀DNA的兩條鏈不會相互分開，當外界條件恢復(fù)正常時，線狀染色體DNA 片段難以復(fù)性,而是與變性的蛋白質(zhì)和細胞碎片纏繞在一起,而質(zhì)粒DNA 雙鏈又恢復(fù)原狀,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解狀態(tài)存在于液相中。 在細菌細胞內(nèi),共價閉環(huán)質(zhì)粒以超

56、螺旋形式存在。在提取質(zhì)粒過程中，除了超螺旋DNA 外，還會產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA 兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂,分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力,形成松馳型的環(huán)狀分子,稱開環(huán)DNA；如果質(zhì)粒DNA 的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線狀DNA。當提取的質(zhì)粒DNA 電泳時,同一質(zhì)粒DNA 其超螺旋形式的泳動速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動速度快。二、實驗?zāi)康亩?、實驗?zāi)康?1 了解質(zhì)粒各種提取方法了解質(zhì)粒各種提取方法2 2 通過堿法提取重組質(zhì)粒通過堿法提取重組質(zhì)粒儀器及耗材：三角瓶、超凈工作臺、臺式離心機、微量移液器及吸頭、EP管、DNA振蕩器。材 料： 含有重組質(zhì)粒的培養(yǎng)細菌三、實驗儀器

57、、材料和試劑三、實驗儀器、材料和試劑 堿法提取質(zhì)粒需要的試劑： 溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液配制后高壓滅菌15 分鐘,儲存于4冰箱。 溶液：0.2 mol/L NaOH， 1 SDS(臨用前用10 mol/L NaOH 和10 SDS現(xiàn)配)。 溶液：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高壓滅菌。試 劑（一）、 堿法1. 接種少許通過PCR鑒定含有重組質(zhì)粒DH5菌液到液體LB 培養(yǎng)基(含100 g/ml Amp)中, 37

58、 振蕩培養(yǎng)約12 小時至對數(shù)生長后期；。2、取菌液于1.5mlEP,4，12,000 rpm, 1min;3、棄上清,將管倒置于吸水紙上數(shù)分鐘,使液體流盡；4、每管菌體沉淀重懸浮于100l 溶液中(吸打混勻，務(wù)必充分)；5、每管加入新配制的溶液200l,輕柔上下顛倒EP管數(shù)次,以混勻內(nèi)容物(不要振蕩),冰浴5 分鐘。6、每管加入150l 預(yù)冷的溶液,輕柔上下顛倒EP管數(shù)次，可見白色絮狀沉淀出現(xiàn)，冰浴中5分鐘,4，12,000 rpm, 10 min;四、實驗步驟四、實驗步驟7. 上清液（每管400l）移入干凈EP 管中,加0.8倍體積5M LiCl（每管320l）,混勻,-20, 20 min

59、;8. 4,12,000 rpm，5 min9. 將水相（約700l）移入干凈EP 管中,加入0.6 倍體積的異丙醇（420l）,振蕩混勻后，室溫放置5分鐘，然后4,12,000 rpm，5 min；10. 棄上清,將管口敞開倒置于吸水紙上使所有液體流出,加入70乙醇洗沉淀一次, 4,12,000 rpm，5 min；11. 吸除上清液,將管倒置于吸水紙上使液體流盡, 室溫干燥。12. 將沉淀溶于20l ddH2O 中,加入1-2l RNaseA, 37水浴中溫育2-3 h.思考題 質(zhì)粒提取實驗中，溶液，溶液，溶液各起什么作用？一、實驗原理一、實驗原理 限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制

60、性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。 限制性內(nèi)切酶可分為三類: 類和III酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP 的存在。類酶結(jié)合于識別位點并隨機的距離切割識別位點一定距離的DNA；III類酶在特定的非識別位點上切割DNA 分子,然后從底物上解離。類由兩種酶組成: 一種為限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨立的甲基化酶,它修飾同一識別序列。 分子克隆中廣泛應(yīng)用的是：類中的限制性內(nèi)切酶。 絕大多數(shù)類限制酶識別長度為4 至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoR識別六個核苷酸序列:5- GAATTC-3)