第八章DNA序列測(cè)定ppt課件

1、第十章第十章DNA序列測(cè)定序列測(cè)定主要方法主要方法n雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法nPCRPCR法法n芯片法芯片法n化學(xué)降解法化學(xué)降解法 雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法1 1、根本原理、根本原理n利用利用DNADNA在體外合成過程中，當(dāng)雙脫氧在體外合成過程中，當(dāng)雙脫氧核苷酸參與后，核苷酸參與后，DNADNA鏈合成會(huì)被終止，鏈合成會(huì)被終止，并產(chǎn)生了一系列長(zhǎng)度不等，末端不同并產(chǎn)生了一系列長(zhǎng)度不等，末端不同的的DNADNA片段，經(jīng)過電泳分別后，即可從片段，經(jīng)過電泳分別后，即可從膠片上讀出相關(guān)的序列。膠片上讀出相關(guān)的序列。n在一個(gè)模板在一個(gè)模板DNADNA的測(cè)序反響中，設(shè)置一套四種反的測(cè)序反響中，設(shè)置一套

2、四種反響體系，每一種反響體系除了加不同種類的響體系，每一種反響體系除了加不同種類的ddNTPddNTP外，其他成分一樣。外，其他成分一樣。n如在如在A A管中除參與管中除參與dATPdATP、dCTPdCTP、dGTPdGTP、dTTPdTTP外，外，還需參與一定濃度的還需參與一定濃度的ddATP ddATP 32P32P標(biāo)志標(biāo)志 。n每種反響中可得到一套長(zhǎng)度不等的的每種反響中可得到一套長(zhǎng)度不等的的DNADNA片段，片段，經(jīng)變性電泳分別，放射自顯影，用只讀法從經(jīng)變性電泳分別，放射自顯影，用只讀法從下至上即可從圖譜上讀出下至上即可從圖譜上讀出DNADNA序列。序列。待測(cè)序列待測(cè)序列3，5，雙脫氧

3、酶法測(cè)定雙脫氧酶法測(cè)定DNADNA順序順序1 1引物及固定端引物及固定端加引物加引物3，5，3，5，3，5，以以2，、，、3，雙脫氧三，雙脫氧三磷酸磷酸 2，、，、3， dNTP)來中止來中止DNA的復(fù)制反響的復(fù)制反響加加32PdATP， dTTP， dGTP ，dCTP分成四份進(jìn)展反響分成四份進(jìn)展反響雙脫氧酶法測(cè)定雙脫氧酶法測(cè)定DNADNA順序順序2 2加加ddATP/klenow片斷片斷加加ddTTP /klenow片斷片斷加加ddGTP /klenow片斷片斷加加ddCTP /klenow片斷片斷3，5，5，5，3，3，3，5，5，5，3，3，3，5，5，5，3，3，3，5，5，5，3，

4、3，加在序列加在序列膠之膠之A行行加在序列加在序列膠之膠之T行行加在序列加在序列膠之膠之G行行加在序列加在序列膠之膠之C行行單鏈模板單鏈模板DNA引物引物ddTTPddCTPddGTPddATP A C G T5C 35CA 35CAG 35CAGA 35CAGAT 35CAGATT 35CAGATTA 35CAGATTAG35CAGATTAGC35CAGATTAGCT35CAGATTAGCTC35CAGATTAGCTCA35CAGATTAGCTCAG3donghua PCR法法 n直接測(cè)序直接測(cè)序n循環(huán)測(cè)序循環(huán)測(cè)序n 直接測(cè)序直接測(cè)序n可以直接從粗制的生物樣品中測(cè)出目的可以直接從粗制的生物樣

5、品中測(cè)出目的DNADNA序列。序列。 n首先經(jīng)過首先經(jīng)過PCRPCR從樣品中擴(kuò)增出目的從樣品中擴(kuò)增出目的DNADNAn隨后經(jīng)過電泳將擴(kuò)增產(chǎn)物的雙鏈隨后經(jīng)過電泳將擴(kuò)增產(chǎn)物的雙鏈DNADNA同反響剩余同反響剩余的的dNTPdNTP及引物分開，回收及引物分開，回收PCRPCR擴(kuò)增的擴(kuò)增的DNADNA片段。片段。n對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)展測(cè)序反響。測(cè)序引物可以是擴(kuò)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)展測(cè)序反響。測(cè)序引物可以是擴(kuò)增靶增靶DNADNA一對(duì)引物中的一條，也可以是能與一對(duì)引物中的一條，也可以是能與PCRPCR產(chǎn)物雜交的其他引物。產(chǎn)物雜交的其他引物。 循環(huán)測(cè)序循環(huán)測(cè)序循環(huán)測(cè)序循環(huán)測(cè)序普通普通PCRPCR引物引物一條引物一條引物

6、二條引物二條引物 底物底物脫氧核苷三磷酸、脫氧核苷三磷酸、雙脫氧核苷三磷酸雙脫氧核苷三磷酸 脫氧核苷三磷脫氧核苷三磷酸酸 擴(kuò)增方式擴(kuò)增方式 線性線性指數(shù)指數(shù)原理單引物原理單引物PCR第一步，第一步，PCRPCR擴(kuò)增的擴(kuò)增的DNADNA經(jīng)變性成單鏈方式，經(jīng)變性成單鏈方式，第二步，第二步，32P32P標(biāo)志的引物與其中的一條鏈退火，標(biāo)志的引物與其中的一條鏈退火，第三步，在第三步，在DNADNA聚合酶的催化下發(fā)生鏈延伸聚合酶的催化下發(fā)生鏈延伸終止反響。終止反響。循環(huán)循環(huán)3030次左右次左右變性變性退火退火延伸終止延伸終止ddNTP化學(xué)降解法化學(xué)降解法n一個(gè)末端標(biāo)志的一個(gè)末端標(biāo)志的DNADNA片段在片段

7、在4 4組或組或5 5組互為組互為獨(dú)立的化學(xué)反響中得到部分降解，其中獨(dú)立的化學(xué)反響中得到部分降解，其中每一組反響特異性的針對(duì)某一種或某一每一組反響特異性的針對(duì)某一種或某一類堿基。經(jīng)過化學(xué)降解的分子具有共同類堿基。經(jīng)過化學(xué)降解的分子具有共同起點(diǎn)和不同的終點(diǎn)。將各組反響產(chǎn)物進(jìn)起點(diǎn)和不同的終點(diǎn)。將各組反響產(chǎn)物進(jìn)展電泳，經(jīng)放射自顯影即可讀取其序列。展電泳，經(jīng)放射自顯影即可讀取其序列?；瘜W(xué)降解法測(cè)序系統(tǒng)中的特異修飾方法化學(xué)降解法測(cè)序系統(tǒng)中的特異修飾方法堿基堿基條件與特點(diǎn)條件與特點(diǎn)GpH8.0pH8.0下，用硫酸二甲酯對(duì)下，用硫酸二甲酯對(duì)N7N7進(jìn)展修飾，使進(jìn)展修飾，使C8-C9C8-C9鍵對(duì)堿基裂解具有

8、特異的敏感性鍵對(duì)堿基裂解具有特異的敏感性A+GpH2.0pH2.0哌啶甲酸使嘌呤環(huán)的哌啶甲酸使嘌呤環(huán)的N N原子質(zhì)子化，導(dǎo)原子質(zhì)子化，導(dǎo)致脫嘌呤，消弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵致脫嘌呤，消弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵C+T肼可翻開嘧啶環(huán)，后者重新環(huán)化成五元環(huán)后肼可翻開嘧啶環(huán)，后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易于除去易于除去C在在1.5mol/L NaCl1.5mol/L NaCl存在下，只需胞嘧啶可與存在下，只需胞嘧啶可與肼發(fā)生明顯可見的反響肼發(fā)生明顯可見的反響AC在在9090，用，用1.5mol/L NaOH1.5mol/L NaOH處置，可使處置，可使A A位點(diǎn)位點(diǎn)發(fā)生猛烈斷裂反響，而發(fā)生猛烈斷裂反響，而C C位點(diǎn)斷