當(dāng)歸注射液對氫化可的松誘導(dǎo)的大鼠脾臟細(xì)胞凋亡的影響

1、    當(dāng)歸注射液對氫化可的松誘導(dǎo)的大鼠 脾臟細(xì)胞凋亡的影響        摘要目的：觀察當(dāng)歸注射液對氫化可的松誘導(dǎo)的大鼠脾臟細(xì)胞凋亡的影響。方法：以氫化可的松誘導(dǎo)大鼠脾臟細(xì)胞凋亡為模型，采用流式細(xì)胞儀吖啶橙(AO)染色法檢測凋亡細(xì)胞率。結(jié)果：10-7 mol/L氫化可的松作用大鼠脾臟細(xì)胞6 h,DNA片段率顯著增高，達(dá)27.4%，與對照組(19.4%)相比有極顯著意義（P0.01，n=6)，加入5%當(dāng)歸注射液后，凋亡率降至21.7%，與對照組無顯著差異(P0.05

2、)。結(jié)論：當(dāng)歸注射液可抑制氫化可的松誘導(dǎo)的大鼠脾臟細(xì)胞凋亡，此抑制作用具有劑量依賴性。主題詞當(dāng)歸；氫化可的松；脾 Effect of Angelica Sinensis injection solution on apoptosis ofrat spleen cells induced by hydrocortisoneLU Xiao-Xun, HUANG Yao, WU Xin-Hua, LU Wei-BiaoDepartment of Microbiology and Immunology, Guangdong College of Pharmacy, Guangzhou (510224)

3、Abstract AIM:To invenstigate the effect of Angelica Sinensis injection solution (ASIS) on the apoptosis of rat spleen cells induced by hydrocortisone.METHODS：Flow cytometer with acridine orange straining method was used to observe the rate of cellular apoptosis and the apoptosis of rat spleen cells

4、was induced by hydrocortisone (HYD).RESULTS：When the cells were incubated with 10-7 mol/L HYD for 6 h, the percentage of DNA fragmentation increased to 27.4% compared to the control group 19.4%(P0.01,n=6),but it decreased to 21.7% (P0.05) when 5% ASIS were added.CONCLUSION:ASIS inhibited apoptosis o

5、f rat spleen cells induced by HYD and the inhibition is dose-dependent.MeSHAngelica Sinensis; Hydrocortisone; Spleen當(dāng)歸(Angelica Sinensis)為中醫(yī)常用補血活血藥之一，有養(yǎng)血補虛、化瘀止痛之效，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，當(dāng)歸及提取物在調(diào)節(jié)機體免疫功能方面具有多重作用13。已知糖皮質(zhì)激類藥物對機體免疫功能有顯著的抑制作用，并可誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡4。本文以氫化可的松與大鼠脾臟細(xì)胞共同孵育，誘發(fā)大鼠脾臟細(xì)胞凋亡為模型，探討當(dāng)歸注射液在體外對大鼠脾細(xì)胞凋亡的影響。材料和方法(一

6、)實驗動物：成年Spague-Dawleg大鼠(200220 g)，由中山醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，雌雄兼用。(二)藥品：5%當(dāng)歸注射液(Angelica Sinensis injection solution, ASIS)：江蘇盱眙制藥廠，批號980505；氫化可的松(hydrocortisone, HYD):江蘇揚州制藥廠，批號980301。(三)脾臟細(xì)胞培養(yǎng)：成年SD大鼠脫頸椎處死，無菌操作取出脾臟，按常規(guī)制成脾臟細(xì)胞懸液，胎盼藍(lán)檢查細(xì)胞活性，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞至107mL(終濃度)，實驗分3組：A.RPMI 1640組(對照)(Sigma); B.氫化可的松組；C.氫化可的松+當(dāng)歸注射液組

7、。每組均做雙份，各2 mL置于細(xì)胞培養(yǎng)孔，置含5%CO2、37中孵育6 h。(四)流式細(xì)胞術(shù)分析：取已培養(yǎng)6 h樣品，按13與70%乙醇混勻，4過夜后用吖啶(AO)染色，流式細(xì)胞儀(美國Coulter公司)檢測凋亡細(xì)胞率，低于G1期DNA含量的亞二倍體細(xì)胞群體為凋亡細(xì)胞經(jīng)計算機軟件處理后得出細(xì)胞凋亡率，每份樣品檢測細(xì)胞數(shù)1×104。(五)統(tǒng)計處理：細(xì)胞凋亡率用百分?jǐn)?shù)表示， 兩組均數(shù)間的顯著性檢驗用t檢驗。結(jié)果一、氫化可的松對大鼠脾臟細(xì)胞的作用：結(jié)果見表1，對照組大鼠脾臟細(xì)胞體外孵育6 h后，細(xì)胞凋亡率為19.4%，10-5，10-6，10-7mol/L的氫化可的松均有顯著的促進脾臟細(xì)

8、胞DNA片段化或亞二倍體細(xì)胞形成的作用(P0.01)，并具有劑量依賴性。表1氫化可的松對大鼠脾臟細(xì)胞的作用Tab 1 Effect of hydrocortisone (HYD) on spleen cells of rat (n=6)ControlHYD(mol/L)10-510-610-7Apoptosis rate (%)19.4±2.6*39.5±6.1*33.4±5.0*27.4±3.8*     *P0.01, vs control二、當(dāng)歸注射液對大鼠脾臟細(xì)胞凋亡的影響：在含10-6 mol/L HYD

9、的大鼠脾臟細(xì)胞懸液中，加入當(dāng)歸注射液，使其終濃度分別為0.2%，1%，5%(以原5%當(dāng)歸注射液為100%濃度)，相同條件下孵育6 h后，觀察當(dāng)歸注射液對大鼠脾臟細(xì)胞凋亡的作用，結(jié)果如表2所示，5%的當(dāng)歸注射液可明顯阻斷氫化可的松所誘導(dǎo)的大鼠脾臟細(xì)胞凋亡；DNA直方上可見位于G1峰左側(cè)的亞二倍體細(xì)胞峰的峰型，在氫化可的松組中顯著增大(1)。表2當(dāng)歸注射液對大鼠脾臟細(xì)胞凋亡的影響Tab 2 Effect of ASIS on apoptosis of spleen cells of rat (n6)ControlHYD(10-6mol/L)ASIS(%)0.215Apoptosisrate(%)1

10、9.4±2.630.1±4.824.5±3.621.7±2.9*     *P0.05，vs control；P0.05, vs control    Fig 1The effect of HYD and ASIS on apoptosis of spleen cell of rat A: control, apoptosis rate 19.4%B: HYD 10-6mol/L, apoptosis rate 33.4%C: HYD 10-6 mol/L plus ASIS

11、(5%), apoptosis rate 21.7%1HYD和ASI對大鼠脾細(xì)胞凋亡的影響討論細(xì)胞凋亡是體內(nèi)細(xì)胞的一種生理性調(diào)節(jié)機制，在維持機體自身穩(wěn)定方面起重要作用。機體免疫器官的狀態(tài)與免疫功能密切相關(guān)，其細(xì)胞凋亡的活躍或不恰當(dāng)?shù)囊种凭赡芤饳C體免疫系統(tǒng)功能異常，從而導(dǎo)致各種疾病。因此已有許多學(xué)者從細(xì)胞凋亡研究入手，尋找促進或抑制細(xì)胞凋亡的藥物46，以適應(yīng)機體的不同狀態(tài)。已知基因、藥物、傳染、幅射等因素都能誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡，對于臨床應(yīng)用非常廣泛的皮質(zhì)類固醇激素，國內(nèi)外學(xué)者都已證實地塞米松能誘導(dǎo)實驗動物胸腺細(xì)胞凋亡7，8，本文結(jié)果進一步證實，10-7 mol/L氫化可的松可以誘導(dǎo)大鼠脾臟細(xì)胞

12、凋亡，提示皮質(zhì)類固醇激素對機體免疫器官的損傷是多方面的。目前對于凋亡細(xì)胞DNA特征性斷裂的詳細(xì)機制尚不清楚，一般認(rèn)為是激發(fā)了一種Ca2，Mg2依賴的內(nèi)源性限制性核酸內(nèi)切酶，該酶選擇性地切斷核小體間的連接DNA，使之成為不連續(xù)的180200 bp或其整數(shù)倍的DNA片段7，流式細(xì)胞術(shù)分析可直接觀察到細(xì)胞DNA含量變化，染色的小分子DNA在正常的二倍體細(xì)胞DNA峰之前形成一個亞二倍體細(xì)胞凋亡峰，稱Ap峰，根據(jù)Ap峰值即可測得凋亡細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例，本實驗中10-6 mol/L氫化可的松組Ap峰較1 640對照組顯著增大，而同時加有5%當(dāng)歸注射液時Ap峰則與正常對照無明顯差異。當(dāng)歸為中醫(yī)常用名貴中藥

13、之一，在調(diào)節(jié)機體免疫功能上具有多方面的促進作用。文獻(xiàn)表明，當(dāng)歸能促進小鼠白細(xì)胞介素-2(IL-2)的產(chǎn)生，并顯著增加紅細(xì)胞的免疫粘附作用3，當(dāng)歸注射液不僅能使趨化移動的單核細(xì)胞數(shù)量增加，趨化移動距離增大，并能明顯消除氫化可的松對單核細(xì)胞趨化移動的抑制作用1，本文采用氫化可的松誘導(dǎo)大鼠脾臟的細(xì)胞凋亡為模型，進一步證實了當(dāng)歸注射液可顯著抑制氫化可的松對脾臟細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，提示當(dāng)歸注射液對氫化可的松所造成的免疫損害有多重抑制或解除功能，為臨床上應(yīng)用氫化可的松時預(yù)防免疫功能抑制提供了新的實驗依據(jù)。但其機制目前尚不清楚，有待于進一步研究。作者單位：呂小迅吳新華呂偉標(biāo)廣東藥學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室(

14、廣州 510224)黃瑤廣東藥學(xué)院門診部參考文獻(xiàn)1呂小迅，張成武.當(dāng)歸注射液對人單核細(xì)胞趨化移動的作用.廣東醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報，1994，10(4)：240.2徐啟勇，劉衛(wèi)敏，林宇輝，等.當(dāng)歸對博來霉素致鼠急性肺損傷的預(yù)防作用. 湖北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1997，18(1)：20.3呂世靜，黃槐蓮，吳宋廈.當(dāng)歸對實驗動物紅細(xì)胞粘附功能及IL-2免疫調(diào)節(jié)作用.中國實驗臨床免疫學(xué)雜志，1997，9(5)：61.4劉玉濤，周禾，白小薇，等.枸杞多糖對小鼠胸腺細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié).北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 1996， 28(2)：111.5何玉軍，蘇安英，柴錫慶，等.用血清藥理學(xué)方法觀察中藥復(fù)方制劑誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡的研究.綜合臨床醫(yī)學(xué)，1998，14(1)：30.6陳曉莉，胡毅.葛根提取物的體外抗瘤作用及流式細(xì)胞儀分析.中藥藥理與臨床，1997