注射用頭孢噻肟鈉細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究

1、    注射用頭孢噻肟鈉細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究        摘要目的：研究注射用頭孢噻肟鈉的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。方法：通過干擾試驗(yàn)證明注射用頭孢噻肟鈉對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有抑制作用。結(jié)果：使用=0.5或0.25Eu/ml的鱟試劑將樣品稀釋至濃度為2.5或1.25mg/ml,可消除其對檢查的干擾。結(jié)論：注射用頭孢噻肟鈉可以用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法取代熱原檢查法。關(guān)鍵詞頭孢噻肟鈉；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查；鱟試劑；干擾試驗(yàn)Study of bacterial endotoxin test for

2、 cefotaxime sodium for injectionChen Jisheng(Chen JS)Guangzhou Railway Central Hospital,Guangzhou 510080ABSTRACTOBJECTIVE：To investigate bacterial endotoxin test for cefotaxime sodium for injection.METHOD:By interfering test,to study the inhibitive action of cefotaxime sodium for injection in bacter

3、ial endotoxin test.RESULTS:All the samples were diluted to 2.5 or 1.25mg/ml with 0.5 or 0.25Eu/ml of TAL the interference was elimipated.CONCLUSION:Cefotaxime sodium for injection can be ecamined by bacterial endotoxin test method instead of the pyrogen test method.KEY WORDScefotaxime,bacterial endo

4、toxin test,TAL,interfering test頭孢噻肟鈉(Cefotaxime)是第3代頭孢菌素類藥物，療效較好，其臨床應(yīng)用廣泛，且多為靜脈給藥。該注射劑中國藥典95版規(guī)定的檢查項(xiàng)是用家兔法做熱原檢查，文獻(xiàn)迄今未見有用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的報(bào)道。本文通過實(shí)驗(yàn)探討以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法取代熱原檢查法檢測注射用頭孢噻肟鈉的可行性。1材料注射用頭孢噻肟鈉(哈爾濱制藥廠,1g/瓶)；鱟試劑：0.1ml/支,=0.5Eu/ml,批號:980421;=0.25Eu/ml,批號:980409;=0.125Eu/ml,批號:980123;=0.06Eu/ml,批號:980109;=0.03Eu/ml,批

5、號:980109(湛江安度斯生物有限公司);0.1ml/支,=0.5Eu/ml(廈門東方鱟試劑廠,批號:980421)；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(廈門東方鱟試劑廠，批號:980105,效價10Eu/支；湛江安度斯生物有限公司，批號:980227，效價12Eu/支)；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(中國藥品生物制品檢定所，批號:960125,10ml/支)。2方法與結(jié)果2.1鱟試劑靈敏度(b)復(fù)核按中國藥典1995年版二部方法進(jìn)行操作1，結(jié)果見表1。2.2初篩試驗(yàn)2.2.1內(nèi)毒素限值(L)的確定采用公式L=K/M(M值是以成人每公斤體重每小時給藥的最大劑量來計(jì)算)，本品人用最大劑量為12g/日，分3次靜脈滴注2

6、,4g/次，滴注500ml按2.5h計(jì)算，中國人平均體重按60kg計(jì)算，則M=4×1000/(2.5×60)=26.7mg/kg.h-1,故本品的細(xì)菌內(nèi)毒素的理論限值為L=5/26.7=0.19Eu/mg。另參考美國藥典(版)注射用頭孢噻肟鈉內(nèi)毒素限值為0.2Eu/mg3,與計(jì)算結(jié)果基本一致，為方便稀釋，我們把注射用頭孢噻肟鈉的內(nèi)毒素限值定為:0.2Eu/mg。表1鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果TAL批號標(biāo)示靈敏度/b/Eu.ml-1復(fù)核靈敏度/c/Eu.ml-1980220(廈門)0.50.5980421(湛江)0.50.71980409(湛江)0.250.25980123(湛江)

7、0.1250.149980109(湛江)0.060.06980314(湛江)0.030.042.2.2樣品最大有效稀釋濃度(CMVD)以鱟試劑靈敏度0.5Eu/ml為基準(zhǔn)，按CMVD=/L=0.5/0.2=2.5mg/ml,并以此為樣品的基準(zhǔn)稀釋濃度，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水以基準(zhǔn)稀釋濃度為起點(diǎn)，將樣品往下倍比稀釋，得樣品的濃度系列溶液，加上半最大有效稀釋濃度(CHMVD)的溶液，即5.0,2.5,1.25,0.625,0.313和0.157mg/ml,記此系列溶液為S。2.2.3取靈敏度b為0.5,0.25,0.125,0.06和0.03Eu/ml的鱟試劑，取同廠家內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，按規(guī)定分別稀

8、釋成2b的濃度，每個濃度做2管，按下面操作：NPC系列:0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水加入鱟試劑中，按不同靈敏度分別加入對應(yīng)的S系列0.1ml。PPC系列:0.1ml含2b細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)液加入鱟試劑中，按不同靈敏度分別加入對應(yīng)的S系列0.1ml。結(jié)果見表2。 表2注射用頭孢噻肟鈉初篩試驗(yàn)結(jié)果鱟試劑(湛江)項(xiàng)目樣品稀釋濃度/mg.ml-15.02.51.250.6250.3130.157NPC-PPC-+靈敏度(Eu/ml)0.50.50.250.1250.060.032.3干擾試驗(yàn)由表2的結(jié)果可知，NPC系列全為陰性，PPC系列在樣品濃度為5.0mg/ml(HMVD)時為陰性，在稀釋濃度為2.5

9、mg/ml(MVD)處開始出現(xiàn)全陽性結(jié)果，表明此樣品對鱟試無干擾的有效濃度在2.5mg/ml以下，在此有效濃度范圍內(nèi)，可以選擇b高于0.5Eu/ml的鱟試劑對相應(yīng)的樣品稀釋濃度作干擾試驗(yàn)。我們選取靈敏度b=0.5Eu/ml和0.25Eu/ml的鱟試劑，將樣品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋至濃度為2.5mg/ml和1.25mg/ml來做干擾試驗(yàn)。干擾試驗(yàn)按中國藥典1995年版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的供試品干擾試驗(yàn)項(xiàng)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，4。 表3注射用頭孢噻肟鈉干擾試驗(yàn)結(jié)果鱟試劑樣品批號內(nèi)毒素濃度/Eu.ml-1陰性對照c/Eu.ml-11.00.50.250.125980220970501+-0.25b=

10、0.5971104+-0.59(廈門)980208+-0.5980421970501+-0.42b=0.5971104+-0.35(湛江)980208+-0.842.4樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查取5批注射用頭孢噻肟鈉分別用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋至0.25mg/ml，使用b=0.5Eu/ml的鱟試劑按細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行檢查，同時增加1管陽性產(chǎn)品對照管(PPC管，即0.1ml鱟試劑+0.1ml含2b濃度內(nèi)毒素的樣品稀釋液。此反應(yīng)結(jié)果應(yīng)為陽性，否則檢查無效)；將上述5批樣品分別稀釋至1.25mg/ml，使用b=0.25Eu/ml的鱟試劑，按上法作細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果見表5。表4注射用頭孢噻肟鈉干擾試驗(yàn)結(jié)果

11、鱟試劑樣品批號內(nèi)毒素濃度/Eu.ml-1陰性對照c/Eu.ml-10.50.250.1250.06980409970501+-0.25b=0.25971104+-0.21(湛江)980208+-0.30表55批注射用頭孢噻肟鈉細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果鱟試劑注射用頭孢噻肟鈉細(xì)菌內(nèi)毒素檢查批號b批號樣品稀釋濃度SSPCNCPPC9804210.59705012.5mg/ml-+-+970809-+-+971104-+-+971206-+-+980208-+-+9804090.259705011.25mg/ml-+-+970809-+-+971104-+-+971206-+-+980208-+-+注：PC

12、為陽性對照管；NC為陰性對照管；S為樣品管；PPC為陽性產(chǎn)品對照管 3討論3.1細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定，不僅對保證被檢物品的安全使用十分重要，而且關(guān)系到正確判斷產(chǎn)品的合格與否，故計(jì)算細(xì)菌內(nèi)毒素限值十分重要，因家兔劑量往往高于人用最大劑量的幾倍甚至10倍，如以家兔劑量計(jì)算細(xì)菌內(nèi)毒素限值，必然會造成對產(chǎn)品內(nèi)毒素要求太嚴(yán)格，使很多合格產(chǎn)品被判為不合格或使藥品的生產(chǎn)成本增加，所以美國藥典、英國藥典和歐洲藥典熱原檢查改為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，一般都是以人用最大劑量而不是以家兔劑量來計(jì)算細(xì)菌內(nèi)毒素限值。如注射用頭孢噻肟鈉按中國藥典1995年版規(guī)定的熱原檢查劑量100mg/kg計(jì)算，其內(nèi)毒素限值應(yīng)為0.05Eu/

13、mg，與美國藥典的限值要求0.2Eu/mg比較有4倍的差距，而用人用最大劑量計(jì)算，其限值為0.19Eu/ml，與美國藥典的限值要求十分接近。3.2初篩試驗(yàn)只是一種預(yù)試驗(yàn)，最終要經(jīng)干擾試驗(yàn)驗(yàn)證，其目的是評價樣品濃度對鱟試劑與內(nèi)毒素凝集反應(yīng)的干擾程度及干擾性質(zhì)，以便初步篩選出對檢查無干擾的樣品濃度范圍及相應(yīng)的鱟試劑靈敏度，從而為干擾試驗(yàn)提供必要的參數(shù)，避免鱟試劑的浪費(fèi)。從表2結(jié)果可看出，樣品對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾性質(zhì)為抑制作用。樣品對鱟試劑無干擾的有效濃度范圍在2.5mg/ml以下，在此有效濃度范圍內(nèi)，可以選擇靈敏度為b=0.5Eu/ml以上的鱟試劑對相應(yīng)的樣品稀釋濃度作干擾試驗(yàn)。本文選擇靈敏度為0.5和0.25Eu/ml的鱟試劑進(jìn)行干擾試驗(yàn)，表3、4干擾試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了初篩試驗(yàn)的結(jié)果。3.3不同廠商生產(chǎn)的鱟試劑在生產(chǎn)工藝、配方、質(zhì)量參數(shù)等各方面都有一定的差異，這就影響到鱟試劑的抗干擾能力，即不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑其抗干擾能力存在差別。故本文采用不同廠家的鱟試劑對3個批號的樣品進(jìn)行干擾試驗(yàn)，由干擾試驗(yàn)結(jié)果可看出，3批樣品分別使用不同廠家的鱟試劑，將樣品稀釋至2.5mg/ml，其c都在0.52b范圍內(nèi)，按照95版中國藥典干擾試驗(yàn)的判斷方法，可認(rèn)為樣品在該濃度下不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查。3.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，注射用頭孢噻肟