神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用課件

1、神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用汕大醫(yī)學院病理教研室汕大醫(yī)學院病理教研室神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用n神經(jīng)組織的體外培養(yǎng)方法是由神經(jīng)組織的體外培養(yǎng)方法是由HarrisonHarrison，于于19071907年首年首創(chuàng)的。創(chuàng)的。n由于該方法具有簡化細胞生化環(huán)境、明確生長條件、由于該方法具有簡化細胞生化環(huán)境、明確生長條件、便于施加實驗因素及容易獲得活體直接觀測結(jié)果等優(yōu)便于施加實驗因素及容易獲得活體直接觀測結(jié)果等優(yōu)點，因而已成為研究神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構和功能的有效手段。點，因而已成為研究神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構和功能的有效手段。n九十余年來，這項技術已從組織塊（或植塊）培養(yǎng)九十余年來，這項技術已從組織塊（或植塊）培養(yǎng)（exp

2、lant cultureexplant culture）發(fā)展到分離細胞培養(yǎng)發(fā)展到分離細胞培養(yǎng)( (dissociated cell culture)dissociated cell culture)，并逐漸與多種現(xiàn)代技并逐漸與多種現(xiàn)代技術結(jié)合起來，在神經(jīng)科學各領域發(fā)揮了重大作用。術結(jié)合起來，在神經(jīng)科學各領域發(fā)揮了重大作用。神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用n 組織塊培養(yǎng)組織塊培養(yǎng)分離細胞培養(yǎng)分離細胞培養(yǎng)甚至單一型細胞培養(yǎng)甚至單一型細胞培養(yǎng)神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用神經(jīng)組織的植塊培養(yǎng)法神經(jīng)組織的植塊培養(yǎng)法n懸滴培養(yǎng)方法懸滴培養(yǎng)方法n單蓋玻方法單蓋玻方法n雙蓋玻方法雙蓋玻方法 1925n改良雙蓋玻方法改良

3、雙蓋玻方法n培養(yǎng)物：培養(yǎng)物： CNS灰質(zhì)、白質(zhì)、外周神經(jīng)節(jié)或神經(jīng)小段灰質(zhì)、白質(zhì)、外周神經(jīng)節(jié)或神經(jīng)小段 突起突起 非神經(jīng)元外伸非神經(jīng)元外伸神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用優(yōu)點優(yōu)點n 所需培養(yǎng)液量少，可反應組織代謝中所需培養(yǎng)液量少，可反應組織代謝中 微量生化改變微量生化改變n 保留了植塊內(nèi)組織特征保留了植塊內(nèi)組織特征神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用不足不足n 培養(yǎng)空間小，培養(yǎng)空間小，O2 CO2供少供少n 培養(yǎng)空間濕度難以控制，水分會蒸發(fā)培養(yǎng)空間濕度難以控制，水分會蒸發(fā)n 密封手續(xù)繁雜，不利更換培養(yǎng)液，難密封手續(xù)繁雜，不利更換培養(yǎng)液，難 以觀察單個神經(jīng)元生長。以觀察單個神經(jīng)元生長。神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用神

4、經(jīng)元的分離細胞培養(yǎng)方法神經(jīng)元的分離細胞培養(yǎng)方法1956年，年，Nakai首創(chuàng)了神經(jīng)組織的分離培養(yǎng)方法首創(chuàng)了神經(jīng)組織的分離培養(yǎng)方法材料來源：胚胎動物神經(jīng)組織材料來源：胚胎動物神經(jīng)組織n神經(jīng)元增殖發(fā)生于胚胎期神經(jīng)元增殖發(fā)生于胚胎期n形態(tài)學分化和化學分化程度低，體外存活強，形態(tài)學分化和化學分化程度低，體外存活強，成熟后則相反，且神經(jīng)元會受到大的普遍損傷。成熟后則相反，且神經(jīng)元會受到大的普遍損傷?；屹|(zhì)、灰質(zhì)、PNS神經(jīng)節(jié)，神經(jīng)元集中，密度大神經(jīng)節(jié)，神經(jīng)元集中，密度大 神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用神經(jīng)元的體外培養(yǎng)液神經(jīng)元的體外培養(yǎng)液n 天然合成成分天然合成成分 血清血清 血漿血漿 胚胎撮液胚胎撮液n 人工

5、培養(yǎng)基人工培養(yǎng)基n 無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基 化學限定性培養(yǎng)基化學限定性培養(yǎng)基n 常用的：常用的：DMEM + 添加劑添加劑 F12神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用葡萄糖葡萄糖 為神經(jīng)元能量代謝主要來源為神經(jīng)元能量代謝主要來源 3333mmmmCOCO2 2 NaHCO NaHCO3 3緩沖系統(tǒng)重要緩沖系統(tǒng)重要 HEPESOHEPESO2 2耗量更耗量更高高K K+ + 神經(jīng)元生理活動的重要離子，神經(jīng)元生理活動的重要離子，K K+ +是神是神經(jīng)元存活所必需的，經(jīng)元存活所必需的，K K+ + 24.5mM 24.5mM 能提高能提高神經(jīng)元存活，促分化神經(jīng)元存活，促分化非神經(jīng)元成分的抑制非神經(jīng)元成分的抑

6、制 有有 2-3 2-3天天神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用 神經(jīng)元無血清限定培養(yǎng)液神經(jīng)元無血清限定培養(yǎng)液 人工合成的培養(yǎng)基雖然具備了細胞生長的基人工合成的培養(yǎng)基雖然具備了細胞生長的基本營養(yǎng)物質(zhì)和無機鹽類，但仍無法滿足不同本營養(yǎng)物質(zhì)和無機鹽類，但仍無法滿足不同類型細胞的特殊需要。大多數(shù)神經(jīng)元在基礎類型細胞的特殊需要。大多數(shù)神經(jīng)元在基礎培養(yǎng)液中即使能夠存活也為期不長，更難以培養(yǎng)液中即使能夠存活也為期不長，更難以分裂。因此可根據(jù)神經(jīng)元的特性，給基礎培分裂。因此可根據(jù)神經(jīng)元的特性，給基礎培養(yǎng)中再添加某些特殊物質(zhì)。養(yǎng)中再添加某些特殊物質(zhì)。神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用選擇添加劑的基本過程選擇添加劑的基本過程n

7、限定連續(xù)細胞系的體外生長條件。限定連續(xù)細胞系的體外生長條件。n 試定該細胞系來源的細胞的培養(yǎng)試定該細胞系來源的細胞的培養(yǎng) 液條件液條件。神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用BottensteinBottenstein實驗室經(jīng)過長期研究發(fā)實驗室經(jīng)過長期研究發(fā)現(xiàn)如下添加劑比較好現(xiàn)如下添加劑比較好 人轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛胰島素、硒酸鈉、孕酮、腐人轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛胰島素、硒酸鈉、孕酮、腐胺加入到胺加入到F F1212與與DMEM 1:1DMEM 1:1混液中，可以代替血混液中，可以代替血清添加物，用來培養(yǎng)大鼠清添加物，用來培養(yǎng)大鼠CNSCNS的成神經(jīng)細胞瘤的成神經(jīng)細胞瘤細胞。刪去其中任何一種添加物都可導致成細胞。刪去其中任

8、何一種添加物都可導致成神經(jīng)細胞瘤細胞生長狀況銳減。該實驗室共神經(jīng)細胞瘤細胞生長狀況銳減。該實驗室共列出了三種神經(jīng)元限定性培養(yǎng)添加物的配方，列出了三種神經(jīng)元限定性培養(yǎng)添加物的配方，代號分別為代號分別為N N1 1、N N2 2、N N3 3。 神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用NN1 1的配方為的配方為n 胰島素胰島素5g/mln 轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白5g/mln 孕酮孕酮20 nMn 腐胺腐胺100Umn 硒硒30nM神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用神經(jīng)體外培養(yǎng)的生長基質(zhì)神經(jīng)體外培養(yǎng)的生長基質(zhì) n膠膠 元元 n 多聚賴氨酸多聚賴氨酸 n LN神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用 脊髓后根節(jié)脊髓后根節(jié) 大腦皮質(zhì)大腦皮質(zhì) 孕

9、孕1820天大鼠胚胎天大鼠胚胎 新生新生13天大鼠天大鼠 在在CMF-Hanks液中取出組織除去腦膜液中取出組織除去腦膜 與與CMF-Hanks 液一起移至離心管液一起移至離心管 舍棄舍棄CMF-Hanks液，再加入液，再加入5ml 0.25%胰蛋白酶和胰蛋白酶和5滴滴0.2%Dnase液液 神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用370C，30min舍棄胰蛋白酶，加入舍棄胰蛋白酶，加入5ml培養(yǎng)液和培養(yǎng)液和10滴滴Dnase液液用巴斯德吸管吹打用巴斯德吸管吹打20次，再用套有微量加樣器頭的加樣器吹打次，再用套有微量加樣器頭的加樣器吹打20次次若有組織殘渣，將上清移至新試管再加若有組織殘渣，將上清移至新試管

10、再加3ml培養(yǎng)液反復吹打培養(yǎng)液反復吹打?qū)⒓毎麘乙菏占陔x心管，離心將細胞懸液收集于離心管，離心1200r/min ，8min，舍去上清，向舍去上清，向沉淀加培養(yǎng)液，離心沉淀加培養(yǎng)液，離心1200r/min，8min神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用加入培養(yǎng)液調(diào)整懸液中的細胞濃度，神經(jīng)節(jié)細胞為加入培養(yǎng)液調(diào)整懸液中的細胞濃度，神經(jīng)節(jié)細胞為1 110107 7種入涂有種入涂有poly-D-lysinepoly-D-lysine的蓋片上，每片的蓋片上，每片5050ll放入放入CO2孵箱中過夜孵箱中過夜次日加次日加3ml培養(yǎng)液培養(yǎng)液2 2天后（培養(yǎng)的第三天）換入有天后（培養(yǎng)的第三天）換入有DNADNA合成陰斷劑

11、的培養(yǎng)液合成陰斷劑的培養(yǎng)液 神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用神經(jīng)元的分離培養(yǎng)過程神經(jīng)元的分離培養(yǎng)過程大鼠大腦皮層神經(jīng)組織細胞培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經(jīng)組織細胞培養(yǎng)組織來源組織來源n新生大鼠新生大鼠1-2日齡，碘日齡，碘 酒酒 ，灑精消毒。，灑精消毒。n 斷頭，取出大腦，分離腦斷頭，取出大腦，分離腦 膜膜 ，夾取兩側(cè)大腦皮質(zhì)放，夾取兩側(cè)大腦皮質(zhì)放入接種培養(yǎng)液中，用入接種培養(yǎng)液中，用D-Hanks沖洗二遍。沖洗二遍。n剪碎，剪碎，0.5-1mm3,用用D-Hanks充分洗去殘血充分洗去殘血n加入加入5-10倍量倍量0.25%胰蛋白酶，移入離心管中放到水胰蛋白酶，移入離心管中放到水370C浴箱中消化浴箱中消化2

12、0-25分鐘。分鐘。n終止消化離心洗滌終止消化離心洗滌 2000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分分 ，5分鐘棄上清。吹打分鐘棄上清。吹打制成細胞懸液。制成細胞懸液。n臺盼蘭染色計數(shù)后接種于事先涂好鼠尾膠的臺盼蘭染色計數(shù)后接種于事先涂好鼠尾膠的24孔板中?？装逯小370C 5%CO2培養(yǎng)培養(yǎng)2天后換生長培養(yǎng)液天后換生長培養(yǎng)液神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用大鼠海馬神經(jīng)細胞培養(yǎng)方法大鼠海馬神經(jīng)細胞培養(yǎng)方法 神經(jīng)元體外生長特征神經(jīng)元體外生長特征接種密度與體外存活率接種密度與體外存活率n 當當96孔孔 每孔每孔2000-3000個個 或或 7000-10000個個/cm2幾乎無神經(jīng)元存活幾乎無神經(jīng)元存活 n 當當8000-120

13、00個個/96孔孔 或或 2.8萬萬-4萬個萬個/cm2 存存活率最大?；盥首畲蟆3天后不到接種的一半，故研究某一生長因子天后不到接種的一半，故研究某一生長因子前前3天加藥最好天加藥最好神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用神經(jīng)元的體外存活時間神經(jīng)元的體外存活時間n 短短1-2Wn 長長 4個月個月神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用體外分化標志體外分化標志n 破傷風毒素破傷風毒素 n NSE n NF200,NF160神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用神經(jīng)細胞的特殊染色鑒定方法神經(jīng)細胞的特殊染色鑒定方法n 尼氏體染色尼氏體染色 焦油紫焦油紫 甲苯胺藍甲苯胺藍 硫瑾等組化染色硫瑾等組化染色n 鍍銀染色鍍銀染色 n NAD

14、PH-d特異性神經(jīng)組織化學法特異性神經(jīng)組織化學法神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用1. 化學物質(zhì)，物理因素，生物因素，環(huán)境中化學因子，化學物質(zhì)，物理因素，生物因素，環(huán)境中化學因子， 自由基，外傷、高溫等因素，病毒感染。自由基，外傷、高溫等因素，病毒感染。2. 藥物，細胞因子，對神經(jīng)細胞的作用，各種藥物，如藥物，細胞因子，對神經(jīng)細胞的作用，各種藥物，如 中藥，腦活素，神經(jīng)生長因子，成纖維細胞生長因子中藥，腦活素，神經(jīng)生長因子，成纖維細胞生長因子 （bFGF），），神經(jīng)營養(yǎng)因子神經(jīng)營養(yǎng)因子3. 細胞間相互作用：巨噬細胞，雪旺細胞等。細胞間相互作用：巨噬細胞，雪旺細胞等。4. 各種生理病理狀態(tài)下神經(jīng)元狀態(tài)改

15、變各種生理病理狀態(tài)下神經(jīng)元狀態(tài)改變神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用研究手段及測量指標研究手段及測量指標1. 形態(tài)學觀察：形態(tài)學觀察： 光鏡，相差顯微鏡：細胞數(shù)目，形態(tài)，大體結(jié)構，突觸光鏡，相差顯微鏡：細胞數(shù)目，形態(tài)，大體結(jié)構，突觸 電鏡：超微結(jié)構。電鏡：超微結(jié)構。2. 激光共聚焦掃描顯微鏡（激光共聚焦掃描顯微鏡（laser confocal scanning microscope, LCSM) ：研究細胞內(nèi)成分變化，離子改變研究細胞內(nèi)成分變化，離子改變等，三維重建等，三維重建3. 膜片鉗技術，細胞表面通道和離子流動，電變化。膜片鉗技術，細胞表面通道和離子流動，電變化。神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用研究手

16、段及測量指標研究手段及測量指標4. 聚丙烯酰胺凝膠電泳：細胞內(nèi)蛋白，核酸變化聚丙烯酰胺凝膠電泳：細胞內(nèi)蛋白，核酸變化5. 染色：蘇木素染色：蘇木素-伊紅（伊紅（HE）染色及尼氏（染色及尼氏（Nissl)染色，免疫組化染色。染色，免疫組化染色。6. 顯微測量：胞體平均直徑和胞體橢圓率，突起顯微測量：胞體平均直徑和胞體橢圓率，突起長度及胞徑。長度及胞徑。7. 熒光光度分析儀：熒光光度分析儀：MTT法測定細胞的法測定細胞的OD值值神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法及應用1. 1. 神經(jīng)細胞培養(yǎng)存活的標志：種植神經(jīng)細胞培養(yǎng)存活的標志：種植2424小時后貼小時后貼壁，漸長出幾十微米的突起，神經(jīng)細胞大多壁，漸長出幾十微米的突起，神經(jīng)細胞大多都能存活。都能存活。2. 2. 特殊培養(yǎng)階段：培養(yǎng)的特殊培養(yǎng)階段：培養(yǎng)的9 9到到1212天之間，有較多天之間，有較多神經(jīng)元死亡，以后存活下的細胞突起長而多，神經(jīng)元死亡，以后存活下的細胞突起長而多，互相形成網(wǎng)絡，電鏡下可見突觸。互相形成網(wǎng)絡，電鏡下可