TaKaRa 凝膠回收說明書

1、Code No. 9762 研究用TaKaRa MiniBEST AgaroseGel DNA Extraction Kit Ver.4.0說明書v201306Da目錄內(nèi)容頁碼制品說明 1 制品內(nèi)容 1 保存與運(yùn)輸 1 使用前的準(zhǔn)備事項(xiàng) 1 操作方法 1 使用例 3 注意事項(xiàng) 3 Q&A 4制品說明本試劑盒是從瓊脂糖凝膠中回收純化DNA片段的試劑盒。試劑盒采用了獨(dú)特的凝膠溶解Buffer,其具有較強(qiáng)的緩沖性能并含有pH指示劑,方便判斷溶液的pH值是否適合與DNA制備膜結(jié)合,其溶膠能力很強(qiáng),無需加熱,在室溫(15-25條件下即可快速溶解凝膠。本試劑盒結(jié)合DNA制備膜技術(shù),具有高效、快速、

2、方便之特點(diǎn),全套操作只需20分鐘便可完成。使用本試劑盒每次可純化得到多至20 g以上的DNA片段(50 bp20 kb,回收率高達(dá)5080%,2050 kb的DNA片段回收率略低。經(jīng)本試劑盒回收純化的DNA片段純度高,完整性好,可直接用于連接反應(yīng)、PCR擴(kuò)增、DNA測(cè)序等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。制品內(nèi)容(50次量每次處理的膠塊量約為300 mg(1%凝膠濃度時(shí),本試劑盒可使用50次。本試劑盒分試劑Set與Column Set兩部分。試劑SetBuffer GM*1 50 mlBuffer WB*2 24 mlElution Buffer 2 ml ×2*1含有強(qiáng)變性劑,應(yīng)避免與皮膚、衣物

3、等接觸。若不小心接觸到眼睛或皮膚時(shí),請(qǐng)立即到醫(yī)院進(jìn)行處理。*2首次使用前,向Buffer WB中添加56 ml的100%乙醇。Column SetSpin Columns 50支Collection tubes 50支【試劑盒之外所需準(zhǔn)備試劑】無水乙醇滅菌水或Tris-HCl(pH8.0 3 M醋酸鈉溶液(pH5.2保存與運(yùn)輸1. 本試劑盒可以在室溫下(15-25保存。2. 本試劑盒于室溫下(15-25運(yùn)輸。3. 低溫狀態(tài)下Buffer GM可能會(huì)出現(xiàn)沉淀,使用前請(qǐng)于37加熱至沉淀消失并恢復(fù)至室溫后使用。使用前的準(zhǔn)備事項(xiàng)1. 首次使用前,向Buffer WB中添加56 ml的100%乙醇。2.

4、 檢查Buffer GM是否仍為黃色。3. 試劑中含有變性劑,操作時(shí)應(yīng)佩戴手套等防護(hù)用具。操作方法操作流程見圖1,全套操作約需20分鐘,詳細(xì)說明如下。1. 使用TAE緩沖液或TBE緩沖液制作瓊脂糖凝膠,然后對(duì)目的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。2. 在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠,用紙巾吸盡凝膠表面的液體。此時(shí)應(yīng)注意盡量切除不含目的DNA部分的凝膠,盡量減小凝膠體積,提高DNA回收率。膠塊超過300 mg時(shí),請(qǐng)使用多個(gè)Column 進(jìn)行回收,否則嚴(yán)重影響收率。注切膠時(shí)請(qǐng)注意不要將DNA長(zhǎng)時(shí)間暴露于紫外燈下,以防止DNA損傷。-1-3. 切碎膠塊。膠塊切碎后可以加快操作步驟6的膠塊溶解時(shí)間,

5、提高DNA回收率。4. 稱量膠塊重量,計(jì)算膠塊體積。計(jì)算膠塊體積時(shí),以1 mg=1 l進(jìn)行計(jì)算。5.向膠塊中加入膠塊溶解液Buffer GM,Buffer GM的加量如下表: 6.均勻混合后室溫15-25溶解膠塊(膠濃度較大或比較難溶時(shí)可以在37加熱。此時(shí)應(yīng)間斷振蕩混合,使膠塊充分溶解(約510分鐘。注膠塊一定要充分溶解,否則將會(huì)嚴(yán)重影響DNA的回收率。高濃度凝膠可以適當(dāng)延長(zhǎng)溶膠時(shí)間。7.當(dāng)凝膠完全溶解后,觀察溶膠液的顏色,如果溶膠液顏色由黃色變?yōu)槌壬蚍凵?向上述膠塊溶解液中加入3 M醋酸鈉溶液(pH5.210 l,均勻混合至溶液恢復(fù)黃色。當(dāng)分離小于400 bp的DNA片段時(shí),應(yīng)在此溶液中再

6、加入終濃度為20%的異丙醇。8.將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。9.將上述操作步驟7的溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中,12,000rpm離心1分鐘,棄濾液。注如將濾液再加入Spin Column中離心一次,可以提高DNA的回收率。10.將700 l的Buffer WB加入Spin Column中,室溫12,000rpm離心30秒鐘,棄濾液。注請(qǐng)確認(rèn)Buffer WB中已經(jīng)加入了指定體積的100%乙醇。11. 重復(fù)操作步驟10。12. 將Spin Column安置于Collection Tube上,室溫12,000 rpm離心1分鐘。13. 將Spi

7、n Column安置于新的1.5 ml的離心管上,在SpinColumn膜的中央處加入30 l滅菌蒸餾水或Elution Buffer,室溫靜置1分鐘。注將滅菌蒸餾水或Elution Buffer加熱至60使用時(shí)有利于提高洗脫效率。14. 室溫12,000 rpm離心1分鐘洗脫DNA。如果實(shí)驗(yàn)室備有適合于Spin Column接口的負(fù)壓裝置,可從上述操作步驟7以后進(jìn)行以下操作。8.將試劑盒中的Spin Column插到負(fù)壓裝置的插口上。9.將上述操作步驟7的溶液轉(zhuǎn)移到Spin Column中,開啟調(diào)節(jié)負(fù)壓裝置,緩慢吸走Spin Column中的溶液(流速控制在1滴/秒。10.向Spin Col

8、umn中加入700 l的Buffer WB,吸盡SpinColumn中溶液。注請(qǐng)確認(rèn)Buffer WB中已經(jīng)加入了指定體積的100%乙醇。-2- 溶液轉(zhuǎn)移至將新DNA solution圖1. 操作流程簡(jiǎn)圖11. 重復(fù)操作步驟10,然后從負(fù)壓裝置上取下Spin Column ,將其安置于Collection Tube 上。 12. 室溫12,000 rpm 離心1分鐘。13. 將Spin Column 安置于新的1.5 ml 的離心管上,在Spin Column 膜的中央處加入30 l 滅菌蒸餾水或Elution Buffer ,室溫靜置1分鐘。注將滅菌蒸餾水或Elution Buffer 加熱

9、至60使用時(shí)有利于提高洗脫效率。 14. 12,000 rpm 離心1分鐘洗脫DNA 。 使用例1. 500 bp 、2 kb 、5 kb 、10 kb 的PCR 片段起始量分別為3 g 、3 g 、2 g 、2 g 進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳后,使用本試劑盒回收純化各DNA 片段,然后取1/10量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,其結(jié)果見圖2,回收率高達(dá)60%以上。1% Agarose凝膠電泳M1:DL2,000 DNA Marker 1:切膠回收前的500 bp 的DNA 片段 2:切膠回收后的500 bp 的DNA 片段 3:切膠回收前的2 kb 的DNA 片段 4:切膠回收后的2 kb 的DNA 片段

10、 5:切膠回收前的5 kb 的DNA 片段 6:切膠回收后的5 kb 的DNA 片段7:切膠回收前的10 kb 的DNA 片段 8:切膠回收后的10 kb 的DNA 片段 M2:Hin d digest M3:pUC119 DNA2. 18 kb 的PCR 片段起始量為4 g 進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳后,使用本試劑盒回收純化DNA 片段,然后取1/10量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,其結(jié)果見圖3,回收率高達(dá)50%以上。 M 1 2 MM :Hin d digest 1:切膠回收前的18 kb 的DNA 片段 2:切膠回收后的18 kb 的DNA 片段 注意事項(xiàng)1. 使用前請(qǐng)確認(rèn)Buffer WB 中是否

11、加入指定體積的乙醇。2. 切膠時(shí)切忌膠塊過大,應(yīng)盡量減小凝膠體積,否則會(huì)影響DNA 收量。3. DNA 需長(zhǎng)期保存時(shí),建議在Elution Buffer 中保存。4. 純化的DNA 用于DNA 序列分析時(shí),最好使用滅菌水洗脫DNA 。-3-M1 1 2 3 4 5 6 7 8 M2 M3 圖2. DNA 片段回收電泳圖圖3. DNA 片段回收電泳圖 Q&A Q1. 回收 DNA 時(shí)，一般使用多少洗脫液洗脫？ A1. 可以根據(jù)所需濃度計(jì)算使用洗脫液的體積，一般情況下，洗脫液體積大于 30 l 即可洗脫 Column 上 90%以上的 DNA（但要注意洗脫液需直接加至膜中央） ，所以洗脫液

12、體積最好大于 30 l，當(dāng)對(duì) DNA 濃度要求較高時(shí)，也可以適當(dāng)減少洗脫液體積至 20 l，但回收率會(huì)略有下降，應(yīng)注意使用預(yù)熱的洗脫 液洗脫，并在洗脫離心之前靜置 1 分鐘以上，以提高洗脫效率。 Q2. 本試劑盒一次可以回收的 DNA 量的范圍是多少？ A2. 本試劑盒中 Column 一次回收的最大吸附量可達(dá) 20 g 以上，最小 DNA 起始量也可低至 500 ng，所 以使用前請(qǐng)對(duì) DNA 樣品的總量進(jìn)行估算。 Q3. DNA 的收量較低，為什么？ A3. 一般情況下，DNA 的回收率可以達(dá)到 50-80%。DNA 收量較低時(shí)，可以從以下幾個(gè)方面考慮： 膠塊體積過大，單個(gè) Column

13、可以承載的凝膠體積最好小于 300 mg，大于 300 mg 的凝膠，請(qǐng)使 用多個(gè) Column 進(jìn)行回收，否則收率較低。 使用請(qǐng)確認(rèn) Buffer WB 中是否加入了指定體積的乙醇。 溶膠未完全。溶膠時(shí)注意觀察膠塊是否完全溶解，膠塊未完全溶解會(huì)嚴(yán)重影響收量。溶膠時(shí)，間斷 顛倒混勻溶膠液有助于膠塊的快速溶解。 溶膠液 pH 值過高。溶膠后注意觀察溶膠液顏色，若溶膠液的顏色由黃色變?yōu)槌壬蚍凵砻魅苣z 液的 pH 值過高，會(huì)造成 DNA 收量較低，此時(shí)應(yīng)向溶膠液中加入 3 M 醋酸鈉（pH5.2）10 l,混合 后至溶膠液顏色變回黃色時(shí)，再將溶膠液轉(zhuǎn)移至 Column 上進(jìn)行后續(xù)操作。 使用離心

14、方法時(shí)，注意要在常溫下離心，使 DNA 更好地和 Column 上的膜結(jié)合。 洗脫前的空離步驟不可省略， 此步驟可以除去 Column 上殘留的洗液中的乙醇， 否則影響洗脫效率。 洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或 Elution Buffer 加熱至 60后使用有利于提高洗脫效率。 Q4. 長(zhǎng)片段 DNA 回收時(shí)應(yīng)該注意哪些問題？ A4. 當(dāng) DNA 片段長(zhǎng)度較長(zhǎng)（10 kb 以上）時(shí)，回收效率會(huì)有所下降，這是 DNA 切膠回收時(shí)的常見現(xiàn)象。 此時(shí)建議按以下方法解決問題： 適當(dāng)增加待回收 DNA 樣品的添加量（如起始量加至 25 g） 。 由于長(zhǎng)片段 DNA 不易從濾膜上洗脫下來，建議使用加熱至 60的

15、Elution Buffer 洗脫 DNA， 可以提高回收效率。 減少操作過程中對(duì)長(zhǎng)片段 DNA 的物理損傷：如振蕩混合操作不要過于劇烈，切膠時(shí)不要將 DNA 長(zhǎng)時(shí)間暴露于紫外燈下，在進(jìn)行電泳時(shí)可以使用 6×Quadricolor-loading Buffer（Code No. 9171） 判斷核酸的遷移情況，避免使用紫外燈反復(fù)照射觀察核酸遷移情況。 使用適合長(zhǎng)片段 DNA 回收的-Agarase（Code No. 7345）進(jìn)行 DNA 片段的瓊脂糖凝膠回收實(shí)驗(yàn)。 Q5. 回收得到的 DNA 反應(yīng)性能不佳（酶切、連接） ，為什么？ A5. 洗脫液中殘留部分鹽離子， 加入 Buffe

16、r WB 后室溫靜置 5 分鐘， 有助于徹底清洗掉 Column 上殘留 的鹽離子。 洗脫液中殘留乙醇，在向 Column 中加入洗脫液之前，將 Column 在室溫下靜置 2 分鐘有助于使 Column 上殘留的乙醇徹底揮發(fā)，然后再加入洗脫液洗脫。 進(jìn)行 DNA 洗脫時(shí)用滅菌蒸餾水或 Elution Buffer 洗脫。 -4- Note This product is for research use only. It is not intended for use in therapeutic or diagnostic procedures for humans or animals.

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