磷霉素與14種抗菌藥物分別聯(lián)用的體外抗菌活性研究

1、磷霉素與14種抗菌藥物分別聯(lián)用的體外抗菌活性研究中國抗生素雜志2005年4月第3O卷第4期?233?文章編號:10018689(2005)04023305磷霉素與14種抗菌藥物分別聯(lián)用的體外抗菌活性研究佟金平王鎮(zhèn)山薛欣顧俊明(1大連大學附屬醫(yī)院,大連1160212大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院,大連116023)摘要:目的研究磷霉素與14種常用抗菌藥物分別聯(lián)用在體外抗耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)過程中的相互作用關系,為臨床聯(lián)合用藥提供實驗依據(jù).方法將磷霉素等15種抗菌藥物單獨以及磷霉素與14種抗菌藥物分別聯(lián)用作用于163株MRS菌株,通過測定最低抑菌濃度(MIC),計算部分抑菌濃度(FIC)指數(shù),測

2、定不同作用時間的細菌菌落數(shù),繪制殺菌曲線,掃描電鏡觀察細菌形態(tài)學改變,以評價磷霉素和這些抗菌藥物聯(lián)合應用的體外相互作用關系.結果磷霉素與頭孢唑林,頭孢呋辛,頭孢噻肟,頭孢哌酮,頭孢甲肟,氧氟沙星,環(huán)丙沙星,左氧氟沙星,加替沙星,紅霉素,羅紅霉素,克拉霉素,慶大霉素,阿米卡星在體外分別聯(lián)合應用后,MIC值均比單獨應用時下降,FIC指數(shù)均2;聯(lián)合應用可增強殺菌活性.掃描電鏡觀察,1/4MIC濃度的阿米卡星或氧氟沙星單獨作用于MRS菌時,細菌形態(tài)學無改變,1/4MIC濃度的磷霉素單獨應用時細菌腫脹,變形,同樣濃度兩藥聯(lián)用后,細菌發(fā)生變形和破壞,細菌數(shù)量明顯減少.結論磷霉素與14種抗菌藥物分別聯(lián)用對M

3、RS具有協(xié)同抗菌作用,尤其能夠提高頭孢唑林,阿米卡星,氧氟沙星對MRS的殺菌速度.關鍵詞:磷霉素;耐甲氧西林葡萄球菌(MRS);體外抗菌活性;相互作用中圖分類號:R965文獻標識碼:AInvitroantibacterialactivityoffosfomycinincombinationwith14antimicrobialagentsTongJinping,WangZhenshan,XueXinandGuJunming.(1TheHospitalAffiliatedtODalianUniversity,Dallan116021;2TheSecondAffiliatedHospitalofD

4、alianUniversityofMedicalSciences,Dalian116023)ABSTRACT0bjectiveTostudytheinvitrointeractionsoffosfomycincombinedwithother14commonlyusedantibacterialagentsintheirbactericidalprocessesagainstmethicillinresistantStaphylococcus(MRS),andprovideexperimentalevidenceforclinicalcombinationapplication.Methods

5、OnehundredandsixtythreestrainsofMRSweretreatedby15antibacterialagentsincludingfosfomycinanditScombinationswithcefazolin,cefuroxime,cefotaxime,cefoperazone,cefmenoxime,ofloxacin,levofloxacin,gatifloxacin,ciprofloxacin,erythromycin,roxithromycin,clarithromycin,gentamicinandamikacin.Invitt0antibacteria

6、lactivityandinteractionwereevaluatedbytestingminimalinhibitoryconcentration(MIC),calculatingthefractionalinhibitoryconcentration(FIC)index,countingthecolonyformingunits,drawingthetimekillingcurveandobservingthemorphologicalchangeofbacteria.ResultsTheinvitroantibacterialactivityof15antibacterialsincl

7、udingfosfomycinanditscombinationswithother14agentswereinvestigated.MICsofcombinationswerelowerthanthoseof14drugstestedaloneandFICindex2.Theantimicrobialactivitiesofcombinationwereincreased.Scanningelectronmicroscopyshowedthat1/4MICoffosfomycincombinedwith1/4MICoramikacinor1/4MICofloxacin(substancest

8、hatdonotcausemorphologicalalterationswhengivenalone)resulteddistortionandthenumberdecreasing.ConclusionSynergisticantibacterialeffectswasobservedinfosfomycinincombinationwith14antibacterialsagainstMRS.KEYWORDSFosfomycin;MethicillinresistantStaphlOcOccus;Invitroantibacterialactivity;Interaction收稿日期:2

9、004-0706修回日期:2004一l217作者簡介:佟金平.女,生于l969年.碩士,主治醫(yī)師.?234?磷霉素與14種抗菌藥物分別聯(lián)用的體外抗菌活性研究佟金平等隨著新型抗菌藥物的不斷開發(fā)和臨床應用,細菌耐藥日益突出,尤其是院內(nèi)耐甲氧西林葡萄球菌(methicillinresistantstaphylococcus,MRS)的感染日益受到重視,MRS感染的治療問題也成為臨床棘手問題.在現(xiàn)有藥品中探索高效,低毒的聯(lián)合用藥方案成為研究熱點.磷霉素具有獨特的化學結構,與其它抗菌藥物一般不產(chǎn)生交叉耐藥性.國外有學者報道磷霉素與其它抗菌藥物聯(lián)合在體外具有協(xié)同抗菌效應】,國內(nèi)此方面研究很少.本文旨在研究

10、磷霉素與14種抗菌藥物分別聯(lián)用對臨床分離的MRS菌株的體外抗菌活性,為臨床聯(lián)合用藥提供實驗依據(jù).1材料與方法1.1材料1.1.1菌株收集自2002年1月至2004年1月大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院和大連市中心醫(yī)院的臨床標本,經(jīng)APIStaph系統(tǒng)試條鑒定,凝固酶初篩,按NCCIS332002年標準,瓊脂二倍稀釋法檢測為MRS菌株(MRSAMIC4gg/ml,MRCNSMIC0.5gg/m1)163株.標準參考菌株ATCC25923及ATCC25922由中國藥品生物制品檢定所提供.1.1.2培養(yǎng)基MH瓊脂及肉湯為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品,批號分別為20030507與20030827.1.1.3

11、抗菌藥物磷霉素(fosfomycin,FOM)由東北制藥總廠生產(chǎn),效價75.76,批號20030201;頭孢唑林(cefazolin,CEZ)由哈藥集團制藥總廠生產(chǎn),每支0.5g,批號B03067018;阿米卡星(amikacin,AMK)為上海禾豐制藥有限公司產(chǎn)品,每支0.2g,批號20030916;克拉霉素(clarithromycin,CI)由輝瑞制藥公司提供,每支300mg,批號20030901;頭孢呋辛(cefuroxime,CXM,效價92),頭孢噻肟(cefolaxime,CTX,效價9O.6),頭孢哌酮(cefoperazone,CPZ,效價94.4),頭孢甲肟(cefmeno

12、xime,CMX,效價87),氧氟沙星(ofloxacin,OFIX,效價99.9),左氧氟沙星(1evofloxacin,IVIX,效價99.5),加替沙星(gatifloxacin,GTIX,效價98),環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CP1X,效價84.2),紅霉素(erythromycin,EM,效價88.5%),羅紅霉素(roxithromycin,RO,效價95.2),慶大霉素(gentamicin,GM,效價63.1)為中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品.1.2方法1.2.1聯(lián)合抑菌試驗(1)瓊脂二倍稀釋法測定15種藥物的最低抑菌濃度(MIC).(2)按1:1的濃度比例,瓊脂二倍稀

13、釋法測定磷霉素與14種藥物分別聯(lián)用的MIC.(3)計算部分抑菌濃度(FIC)指數(shù).FIC指數(shù)一A藥聯(lián)合時的MIC/A藥單尉時的MIC+B藥聯(lián)合時的MIC/B藥單用時的MIC判定標準FIC指數(shù)<O.5為協(xié)同作用;0.51為相加作用;12為無關作用;>2為拈抗作用.1.2.2時間一殺菌曲線(1)瓊脂二倍稀釋法測定擬實驗藥物單藥的MIC.(2)無菌試管分別加入終濃度為2MIC,1/4MIC濃度的單藥及1/4MIC濃度的兩藥聯(lián)合的抗菌藥液,并設立生長對照管.(3)每管中加入0.1ml稀釋后的菌液,加入MH肉湯至10ml,細菌終濃度為1OCFU/ml.(4)分別于0,2,4,

14、6,8,24h將試管搖勻后取出50gl,稀釋后涂布于MH瓊脂平板上,孵育過夜后計數(shù)菌落數(shù).(5)根據(jù)各時問點計數(shù)的菌落數(shù)的對數(shù)值在坐標紙上繪制殺菌曲線圖.1.2.3電鏡掃描技術將孵育過夜(18h)的含有1MIC濃度的磷霉素(128gg/m1),1/4MIC濃度的磷霉素(32gg/m1)及聯(lián)合用藥(2藥均為1/4MIC濃度)的MH肉湯低轉(zhuǎn)速離心,棄去上清液,用2.5的戊二醛固定,再次離心,沉淀物經(jīng)0.1PBS緩沖液清洗3次后,鋨酸固定1h,再用0.1PBS緩沖液清洗3次,然后用叔丁醇脫水干燥,粘臺,鍍膜后用Jem一1200ex型掃描電鏡觀察細菌形態(tài)變化.2結果2.1聯(lián)合抑菌實驗結果2.1.1磷霉

15、素等15種抗菌藥物單獨應用對163株MRS的體外活性表1提示,磷霉素,頭孢唑林:頭孢呋辛,頭孢噻肟,頭孢哌酮,頭孢甲肟,紅霉素,羅紅霉素,克拉霉素,阿米卡星,慶大霉素,環(huán)丙沙星,左氧氟沙星對MRS的MIC.均顯示耐藥,氧氟沙星,加替沙星對MRS的MIC.顯示中介.2.1.2磷霉素與14種抗菌藥物分別聯(lián)合應用對163株MRS的體外抗菌活性磷霉素與14種抗菌藥物分別按1:1聯(lián)合對163株MRS的MIC.值均有所下降,除加替沙星MIC.值下降至原值的1/2外,其余均降至原值的1/4以下(表2).磷霉素與14種抗菌藥物分別按1:1聯(lián)用后協(xié)同/相加作用大于無關作用的比例見表3,未見拮抗作用.中國抗生素雜

16、志2005年4月第3O卷第4期?235?表1磷霉素等15種抗菌藥物對163株MRS的體外抗菌活性(g/m1)表2磷霉素與14種抗菌藥物聯(lián)合應用對163株MRS的體外抗菌活性(g/m1)藥物聯(lián)合比例為l:l.表3磷霉素與14種抗菌藥物分別聯(lián)用的體外相互作用所占比例*藥物聯(lián)合比例為l:l.2.2殺菌曲線當磷霉素濃度高于MIC(16pg/m1)時,增加磷霉素濃度,對ATCC25923的殺菌曲線無明顯變化.2號菌株實驗當1/4MIC濃度的磷霉素(16g/m1)與1/4MIC濃度的頭孢唑林(16g/m1)聯(lián)合應用時,殺菌作用較2MIC濃度的頭孢唑林(128,ug/m1)及2MIC濃度的磷霉素(128g/

17、m1)強;1/4MIC濃度的磷霉素(16pg/m1)與1/4MIC濃度的頭孢呋辛(32g/m1)聯(lián)合后,殺菌作用與2MIC濃度的頭孢呋辛(256gg/m1)相似,強于2MIC濃度的磷霉素(128g/m1).166號菌株實驗當1/4MIC濃度的磷霉素(32gg/m1)與1/4MIC濃度的頭孢噻肟(32gg/m1)聯(lián)合后,殺菌作用與2MIC濃度的頭孢噻肟(256gg/m1)或2MIC濃度的磷霉素(256g/m1)相似;1/4MIC濃度的阿米卡星(16gg/m1)與1/4MIC濃度的磷霉素(32g/m1)聯(lián)合后,4h即殺滅細菌,后未再生長,遠遠強于2MIC濃度的磷霉素(256g/m1)和2MIC濃度

18、的阿米卡星(128gg/m1);1/4MIC濃度的氧氟沙星(4g/m1)和1/4MIC濃度的磷霉素(32g/m1)聯(lián)合后6h殺滅細菌,后未再生長,遠遠強于2MIC濃度的磷霉素(256g/m1)和2MIC濃度的氧氟沙星(32g/m1).圖1為磷霉素與阿米卡星聯(lián)合的殺菌曲線.2.3電鏡觀察,-應用掃描電鏡技術觀察磷霉素與阿米卡星,氧氟沙星分別聯(lián)合時的細菌形態(tài)學變化.我們看到,1M1C濃度的磷霉素(128g/m1)單獨作用于細菌時,細菌破壞,內(nèi)容物暴露;1/4MIC濃度的磷霉素(32g/m1)單獨作用于細菌時,細菌腫脹,變形,但無細菌破壞.l/4MIC濃度的阿米卡星(16g/m1)單獨應用時細菌細胞

19、完整(圖2左),但當1/4MIC濃度的磷霉素02468244fUj(h)l:對照;2:FOM32/Jg/ml;3:FOM256/Jg/ml;4:AMKl6/Jg/ml;5:AMKl28/Jg/ml:6:FOM32g/ml十AMY,16g/ml圖1磷霉素與阿米卡星聯(lián)合對166號菌株的殺菌曲線?236?醉霉索與l4種抗菌藥物丹別聯(lián)用的體外抗菌恬性研究佟金平等(32.g/m1)與1/4MIC濃度的阿米卡星(16g/m)聯(lián)合應用時,細菌出現(xiàn)了明顯的破壞,細胞壁不完整,細菌的數(shù)量也明顯減少(圖2右).同樣,當l/4MIC濃度的氧氟沙星(4tg/m1)單獨應用時細菌細胞完整(圖3左);1/4M1C濃度的磷

20、霉素(32g/m1)與1/,IMIC濃度的氧氟沙星(4ug/m1)聯(lián)臺應用時,細菌出現(xiàn)了明顯的破壞,細菌的數(shù)量也明顯減少(圖3右).3討論磷霉素屬于細菌繁殖期快速殺菌劑,抗菌譜廣.對革蘭陽性球菌及革蘭陰性桿菌均有殺滅作用:分子量小.易吸收,容易在細菌體內(nèi)形成高濃度;磷霉素具有獨特的化學結構,與其它抗苗藥物一般不產(chǎn)生交叉耐藥性.有報道聯(lián)合用藥可取得滿意的臨床療效,目前國內(nèi)缺乏相應的實驗依據(jù),本研究就磷霉素與臨床常用抗菌藥物的體外聯(lián)合抗菌活性進行了初步探討.本文研究了磷霉索等15種抗菌藥物對MRS菌株的抗菌恬性,瓊脂二倍稀釋法測定結果表明MRS對所有的內(nèi)酰胺類,大環(huán)內(nèi)酯類,氨基糖苷類抗茁藥物均耐藥

21、.其MIC.均大于NCCIS制定的耐藥標準t呈現(xiàn)多重耐藥性,這與文獻報道一致.對少數(shù)氟喹諾酮類呈現(xiàn)中介,對磷霉索耐藥,這與文獻報道不完全一致磷霉索本身雖然對MRS的MIC值較高,但磷霉索與本實驗中的14種抗菌藥物分別聯(lián)合應用后,對MRS均有協(xié)同或相加作用,增強了后者的抗菌活性,尤其是磷霉素與頭孢唑林,頭孢呋辛,頭孢噻肟,阿米卡星聯(lián)合后,使后者由耐藥變成敏感.磷霉素屬于殺菌劑,本實驗時間殺菌曲線提示磷霉素為非濃度依賴性藥物.增大磷霉素濃度(>MIC時)并不能使殺菌速度明顯增快,與內(nèi)酰胺類抗生素相似,提示在臨床抗感染治療中磷霉索應小劑量分次給藥,這種用藥方案既保證了血漿中有效血藥濃度

22、又減少了不良反應.由時問殺菌曲線分析.磷霉索低濃度時本身雖無明顯殺菌作用,但增強了其它抗菌藥物的抗菌活性,使其它抗菌藥物的殺菌速度明顯增快,以頭孢唑林,阿米卡星,氧氟沙星為明顯,可能與這幾種藥物自身對葡萄球菌的抗菌活性較強有關.正常葡萄球菌產(chǎn)生5種青霉素結合蚤白(PEP):PBPL,PBP1,PBPu,PBP和PBP.,而MRS則產(chǎn)生一種新的PBP,即PBP:.PBP與內(nèi)酰胺類抗生素親和力極低,很少或不被內(nèi)酰胺類抗生素結合,當其他PBP活性被抑制時,PBP起到合成細胞壁的作用,從而對p內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥”】.Usui等應左圖為阿米卡星濃度為161g/ml;右圈為阿米卡望(1filg/m1)

23、與磷霉豢(32Pgm【)聯(lián)臺圖2阿米卡星單獨以及與磷霉素聯(lián)臺作用于MRS(】66號菌株)的形態(tài)學改變左同:氧氟抄星澉度為g!ml;右圈氧氟抄星l4lJg/ml】與酶霉素(32Iiml】聯(lián)臺圖3氧氟沙星單獨以及與磷霉素聯(lián)臺作用于MRS(166號菌株)的形態(tài)學改變中國抗生素雜志2005年4月第3O卷第4期?237?用HC標記法測定PBP.,顯示應用磷霉素后可使PBP抽明顯減少,說明磷霉素能夠與PBPz結合,且增強了p一內(nèi)酰胺類抗生素的抗菌活性.磷霉素作用于細菌細胞壁合成的第一步,因其化學結構與細菌細胞壁粘肽合成初期的烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)移酶(EP轉(zhuǎn)移酶)的底物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)相似,競爭性抑制使該

24、轉(zhuǎn)移酶失活,從而抑制細菌細胞壁的早期合成,破壞其完整性,有利于其它抗菌藥物進入細菌體內(nèi)5.掃描電鏡觀察結果提示,低于MIC濃度的磷霉素使細菌腫脹變形,推測細菌細胞壁通透性增加,增加了其它抗菌藥物進入細菌體內(nèi)的量,獲得協(xié)同或相加的抗菌療效.本研究發(fā)現(xiàn),阿米卡星與氧氟沙星等雖然對細菌細胞壁無影響,當與磷霉素聯(lián)合后則細菌破壞,這與文獻報道一致1”“.說明磷霉素與這類抗菌藥物聯(lián)合應用可增強這類抗菌藥物的抗菌活性.有報道Ll磷霉素能夠破壞生物被膜或抑制其形成,因此,磷霉素可以聯(lián)合其它抗菌藥物治療生物被膜病.另外,磷霉素與環(huán)丙沙星1聯(lián)合應用抗生素后效應(PAE)呈相加作用,提示磷霉素與環(huán)丙沙星臨床聯(lián)合應用

25、時可以減少藥物的單劑量,延長用藥間隔.綜上所述,磷霉素本身抗菌活性雖然不強,但若合理地與其它抗菌藥物(如內(nèi)酰胺類,氨基糖苷類,氟喹諾酮類,大環(huán)內(nèi)酯類)聯(lián)合使用可取得良好的體外抗菌效果,尤其能夠提高頭孢唑林,阿米卡星,氧氟沙星對MRS的殺菌速度.今后需進一步進行動物實驗和臨床療效觀察.參考文獻1GrifK,ManfredPD,PfallerK,eta1.Invitroactivityoffosfomycinincombinationwithvariousantistaphy1occa1substancesJ.JAntimicrobChemother.2001,48:20923UtsuiY,Ohy

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