電針對(duì)慢性癲癇大鼠海馬新生神經(jīng)元生長(zhǎng)抑素表達(dá)的影響

1、電針對(duì)慢性癲癇大鼠海馬新生神經(jīng)元生長(zhǎng)抑素表達(dá)的影響         11-01-10 09:09:00     作者：溫曉妮，黃遠(yuǎn)桂    編輯：studa20【摘要】  目的 探討電針對(duì)慢性癲癇大鼠海馬新生神經(jīng)元生長(zhǎng)抑素(SS)表達(dá)的影響。方法 應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)記和激光共聚焦顯微鏡觀察了電針慢性癲癇大鼠督脈穴位“大椎”與“百會(huì)”后海馬新生神經(jīng)元生長(zhǎng)抑素的表達(dá)情況。結(jié)果 海馬新生神經(jīng)元有SS的表達(dá)，且電針后的癲癇大鼠表達(dá)比未電

2、針的癲癇大鼠減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 電針可抑制海馬新生神經(jīng)元SS的表達(dá)，而SS有致癇作用。由此推測(cè)電針的抑癇機(jī)制可能是通過(guò)海馬新生神經(jīng)元SS的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。 【關(guān)鍵詞】  癲癇；海馬；新生神經(jīng)元；電針；5-溴脫氧尿核苷；生長(zhǎng)抑素ABSTRACT: Objective  To explore influence of electroacupuncture on somatostatin expression of newborn neurons in the hippocampus of chronic epilepsy rats. Methods

3、  The double-label immunofluorescence with confocal microscope was used to observe somatostatin expression of newborn neurons in the hippocampus of chronic epilepsy rats after electroacupuncture stimulation of Dazhui (GV14) and  Baihui (GV20) in DuMai. Results  Somatostatin expression

4、 of newborn neurons was found in the hippocampus. Moreover, in somatostatin expression of newborn neurons, epileptic rats with electroacupuncture had less than epileptic rats in the hippocampus.The former had an obviously significant difference compared with the latter (P<0.05). Conclusion 

5、Somatostatin is involved in proconvulsion. Electroacupuncture inhibits somatostatin expression of newborn neurons in the hippocampus of chronic epilepsy rats. Electroacupuncture inhibits epileptogenesis by decreasing somatostatin colocalized with newborn neurons in hippocampus.KEY WORDS: epilepsy; h

6、ippocampus; newborn neuron; electroacupuncture (EA); BrdU (bromodeoxyuridine); somatostatin早在20世紀(jì)中期就有人報(bào)道，成年哺乳動(dòng)物海馬區(qū)能生成一定數(shù)量的新神經(jīng)元。近年來(lái)隨著神經(jīng)干細(xì)胞研究的逐步深入以及5-溴尿嘧啶核苷(5-bromo-deoxyuridine, BrdU)這一增殖細(xì)胞標(biāo)記物的廣泛應(yīng)用，研究者發(fā)現(xiàn)成年海馬區(qū)不但確實(shí)存在可分化為神經(jīng)元的增殖細(xì)胞，而且其數(shù)目遠(yuǎn)多于人們的想象。該部位神經(jīng)干細(xì)胞微環(huán)境的改變將能阻抑或增強(qiáng)海馬齒狀回的神經(jīng)發(fā)生。既往的研究已證實(shí)反復(fù)的癇性發(fā)作可引起海馬新生神經(jīng)元增加1

7、-5，但這些新生神經(jīng)元究竟有無(wú)功能及發(fā)揮哪種功能至今仍不清楚。    許多研究表明，在各種癲癇動(dòng)物模型的腦組織和癲癇患者病灶腦組織中生長(zhǎng)抑素(somatostatin, SS)的含量有異常變化，提示SS可能參與了癲癇的發(fā)作過(guò)程。為此，本實(shí)驗(yàn)擬采用匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus, SE)后慢性癲癇模型，一方面觀察了海馬新生神經(jīng)元是否有SS的表達(dá)，另一方面觀察了電針干預(yù)后對(duì)海馬新生神經(jīng)元SS表達(dá)的影響，并探討了電針對(duì)海馬新生神經(jīng)元影響的可能作用機(jī)制。1  材料與方法1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠22只，

8、體重180-200 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)于12-12 h(8:00-20:00)光暗環(huán)境，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料及飲水。1.2  主要試劑 鹽酸匹羅卡品、小鼠抗BrdU抗體、兔抗SS抗體、FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體、Cy3標(biāo)記的驢抗兔抗體均購(gòu)自Sigma公司；標(biāo)記有絲分裂活動(dòng)細(xì)胞的BrdU粉劑購(gòu)自Boehringer Mannheim公司；氯化鋰購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海試劑公司。1.3  主要儀器 恒冷冰凍切片機(jī)(美國(guó))；激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV300)；G6805型電針儀(上海醫(yī)用電子儀器廠)。1.4  方法造模大鼠

9、先腹腔注射新鮮配制的氯化鋰，劑量為3 mmol/kg，20 h后腹腔注射鹽酸匹羅卡品，劑量為30 mg/kg。對(duì)照組大鼠注射等量的生理鹽水。出現(xiàn)SE后60 min腹腔注射地西泮注射液(4 mg/kg)以終止SE，降低死亡率。電針處理動(dòng)物均在匹羅卡品或生理鹽水處理后3 d時(shí)開(kāi)始予以電針刺激，并連續(xù)刺激28 d。電針刺激參數(shù)：電針督脈穴位“大椎”與“百會(huì)”，取穴參考獸醫(yī)針刺學(xué)6，采用疏密波。密波：6.25 Hz，1.8-4.9 mA，時(shí)間2.08 s；疏波：3.85 Hz，1.4-2.0 mA，時(shí)間1.28 s。持續(xù)20 min。為了防止動(dòng)物掙扎，在針刺前稍給乙醚麻醉，然后將動(dòng)物固定于針刺操作臺(tái)上

10、，選用1寸毫針進(jìn)行針刺，“百會(huì)”穴平刺，“大椎”穴斜向上刺，約0.7寸。癲癇組8只，均先腹腔注射新鮮配制的氯化鋰(3 mmol/kg)，20 h后腹腔注射鹽酸匹羅卡品(30 mg/kg)，未行電針刺激；對(duì)照組4只，均注射等量的生理鹽水，未行電針刺激；癲癇+電針組共6只，均先腹腔注射新鮮配制的氯化鋰(3 mmol/kg)，20 h后腹腔注射鹽酸匹羅卡品(30 mg/kg)，并行電針刺激；對(duì)照+電針組共4只，均注射等量的生理鹽水，并行電針刺激。實(shí)驗(yàn)大鼠在匹羅卡品或生理鹽水處理后3 d時(shí)分別腹腔注射4次BrdU(50 mg/kg，溶解于0.007 mol/L NaOH/生理鹽水)，間隔12 h注射1

11、次。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均在最后一次注射BrdU后的28 d以戊巴比妥(50 mg/kg)深麻醉，先經(jīng)升主動(dòng)脈灌注生理鹽水100 mL，40 g/L多聚甲醛液(pH 7.4)快速灌注200 mL后，再慢速灌注300 mL。取腦后，將腦組織入40 g/L多聚甲醛后固定過(guò)夜，再入200 g/L蔗糖4冰箱沉底。選擇背側(cè)海馬部位應(yīng)用恒冷冰凍切片機(jī)冠狀位連續(xù)切片，腦片漂片厚30 m，行免疫熒光標(biāo)記者收集于0.01 mol/L KPBS中，余置于60%(體積分?jǐn)?shù))甘油凍存液中-20 保存?zhèn)溆谩Ｈ∏衅?0%(體積分?jǐn)?shù))甲酰胺/2×SSC中65 2 h，2×SSC漂洗后，入2 mol/L HCl中37 30 min，0.01 mol/L(pH 8.5)硼酸液中和10 min，浸入含0.3%(體積分?jǐn)?shù))Triton X-100的0.01 mol/L KPBS 30 min后，采用雞尾酒法進(jìn)行雙標(biāo)記染色。首先入小鼠抗BrdU抗體(1200)和兔抗SS抗體(1500)，4 孵育48 h后，0.01 mol/L KPBS漂洗，然后入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1200)和Cy3標(biāo)記的驢抗兔IgG(1300)，避光孵育2 h，漂洗后常規(guī)貼片、緩沖甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。每只大鼠取6張非連續(xù)的背側(cè)海馬一側(cè)腦片進(jìn)行觀察，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組大鼠根據(jù)