血液制品去除滅活病毒技術(shù)方法及驗證指導(dǎo)原則

1、血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗證指導(dǎo)原則目前已知經(jīng)血液制品傳染的病毒主要有HBV、HCV、HIV-1、HIV-2、HTLV和細小病毒B19。尚未發(fā)現(xiàn)經(jīng)血液制品傳染CJD。但有少數(shù)研究報告發(fā)現(xiàn)有實驗性傳染現(xiàn)象，因此要密切關(guān)注CJD，特別是vCJD的發(fā)展動向。    為了提高血液制品安全性，生產(chǎn)工藝要具有一定的去除/滅活部分病毒能力，生產(chǎn)過程中應(yīng)有特定的去除/滅活病毒方法。本技術(shù)指導(dǎo)原則是對血液制品（指以人血漿為原料制備的制品）生產(chǎn)過程以及特定的去除/滅活病毒方法驗證的指導(dǎo)原則，包括指示病毒和病毒去除/滅活方法的選擇、驗證方案的設(shè)計、結(jié)果判定以及附錄所列技術(shù)驗證申報的程序。

2、    一、去除/滅活病毒方法的選擇    由于不同類血液制品潛在的污染病毒的可能性不同，為此選擇病毒去除/滅活方法的側(cè)重點也應(yīng)有所不同：    （一）凝血因子類制品    生產(chǎn)過程中應(yīng)有特定的能去除/滅活脂包膜和非脂包膜病毒的方法，可采用一種或多種方法聯(lián)合去除/滅活病毒。    （二）免疫球蛋白類制品    對于免疫球蛋白類制品（包括靜脈注射用人免疫球蛋白、人免疫球蛋白和特異性人免疫球蛋白）生產(chǎn)過程中應(yīng)有特定的滅活脂包膜病毒方法。但從進一步提高這類制品安全性考慮，提倡生產(chǎn)過

3、程中加入特定的針對非脂包膜病毒的去除/滅活方法。    （三）白蛋白    采用低溫乙醇生產(chǎn)工藝和特定的去除/滅活病毒方法，如巴斯德消毒法等。    二、常用的去除/滅活病毒方法評價    （一）巴斯德消毒法（巴氏消毒法）    1人血白蛋白制品    幾十年臨床應(yīng)用結(jié)果表明，白蛋白的巴氏消毒法對HIV和肝炎病毒是安全的。其病毒滅活條件已很完善，可不要求進行病毒滅活驗證。但是必須對巴氏消毒法所用設(shè)施進行驗證，使巴氏消毒各參數(shù)符合要求（包括制品內(nèi)溫度分布的均一性和滅活時間）。&

4、#160;   2其它血液制品（液體制劑）    由于制品的組成、穩(wěn)定劑（如：氨基酸、糖、枸櫞酸鹽等）及其濃度的不同，均會對滅活病毒效果有一定的影響。因此在采用巴氏消毒滅活病毒方法時必須進行病毒滅活效果驗證。    （二）干熱法（凍干制品）    80加熱72小時，可以滅活HBV、HCV、HIV和AV等病毒。但應(yīng)考慮制品的水分含量、制品組成（如：蛋白質(zhì)、糖、鹽和氨基酸）對病毒滅活效果的影響。應(yīng)確定允許的制品瓶間各參數(shù)的差異。病毒滅活用的干熱箱至少每半年驗證一次。驗證時干燥箱內(nèi)應(yīng)設(shè)多個測溫點（包括制品內(nèi)、箱內(nèi)最高和最低溫度點）

5、。    （三）有機溶劑/去污劑（S/D）處理法    有機溶劑，如：磷酸三丁脂（TNBP）和非離子化的去污劑，如：ritonX-100或吐溫-80結(jié)合可以滅活脂包膜病毒，但對非脂包膜病毒無效。常用的滅活條件是0.3% TNBP和1%吐溫-80，在24處理至少6小時；0.3%TNBP和1%riton X-100，在24處理至少4小時。S/D處理前應(yīng)先用1m濾器除去蛋白溶液中可能存在的顆粒（顆?？赡懿啬洳《緩亩绊懖《緶缁钚Ч?。加入S/D后應(yīng)確保是均一的混合物。在滅活病毒全過程中應(yīng)將溫度控制在規(guī)定的范圍內(nèi)。如果在加入S/D后過濾，則須檢測過濾后S/D的濃

6、度是否發(fā)生變化，如有變化應(yīng)進行適當(dāng)調(diào)整。吐溫-80應(yīng)采用植物源性，并應(yīng)采用稱量法量取。    （四）膜過濾法    膜過濾技術(shù)只有在濾膜的孔徑比病毒有效直徑小時才能有效除去病毒。該方法不能單獨使用，應(yīng)與其它方法聯(lián)合使用。    驗證研究時應(yīng)考慮蛋白溶液的濃度、濾速、壓力和過濾量等重要參數(shù)。在過濾前及過濾后應(yīng)測試濾膜的完整性。    （五）低pH孵放法    研究表明，免疫球蛋白生產(chǎn)工藝中的低pH（如pH=4）處理（有時加胃酶）能滅活幾種脂包膜病毒。滅活條件（如：pH值、孵放時間和溫度、胃酶含量、

7、蛋白質(zhì)濃度、溶質(zhì)含量等因素）可能影響病毒滅活效果，驗證試驗應(yīng)該研究這些參數(shù)允許變化的幅度。    三、特定的去除/滅活病毒方法驗證    （一）指示病毒的選擇    首先，應(yīng)該選擇經(jīng)血液傳播的相關(guān)病毒（如：HIV），不能用相關(guān)病毒的，要選擇與其理化性質(zhì)盡可能相似的指示病毒；第二，所選擇的病毒理化性質(zhì)應(yīng)有代表性（病毒大小、核酸類型以及有無包膜），其中至少應(yīng)包括一種對物理和/或化學(xué)處理有明顯抗性的病毒。在進行去除/滅活病毒驗證時，應(yīng)根據(jù)制品的特性及所采用的病毒去除/滅活工藝，參照下表列舉的病毒選擇適宜的指示病毒。所選擇的指示病毒至少應(yīng)包括

8、HIV-1、HBV和HCV模擬病毒以及非脂包膜病毒。水皰性口炎病毒（VSV）耐受的p范圍比較廣，驗證低p孵放法滅活病毒效果時可選用此指示病毒。經(jīng)血液傳播疾病的相關(guān)病毒及驗證可選用的指示病毒（舉例）病毒        基因組        脂包膜        大?。╪m）        指示病毒舉例HIV        RNA        有 

9、      80-100        HBV        DNA        有        45        鴨乙型肝炎病毒、偽狂犬病毒HCV        RNA        有        40-60    &

10、#160;   牛腹瀉病毒、Sindbis病毒HAV        RNA        無        27       HAV、脊髓灰質(zhì)炎病毒、腦心肌炎（EMC）病毒B19        DNA        無        20        犬細小病毒、豬細

11、小病毒（二）方案設(shè)計l    1去除/滅活病毒驗證研究應(yīng)符合GLP的要求。    2研究影響去除/滅活病毒效果的參數(shù)（包括機械參數(shù)和理化參數(shù)）允許變化的幅度。    3研究病毒滅活動力學(xué)，包括病毒滅活速率和滅活曲線。    4指示病毒滴度應(yīng)該盡可能高（病毒滴度應(yīng)106/ml）。    5加入的病毒與待驗證樣品體積比不能高于19。    6如可能，驗證過程中每步取出的樣品應(yīng)盡快直接進行病毒滴定，不做進一步處理（如超離心、透析或保存、除去抑制劑或毒性物質(zhì)等）。如果樣品必須做進一步

12、處理，或不同時間取出的樣品要在同一時間進行測定，應(yīng)考慮這些處理方法對病毒檢測結(jié)果的影響。    7檢測方法可包括蝕斑形成、細胞病變（如合胞體或病灶形成）、終點滴定或其他方法。這些方法應(yīng)該有適宜的靈敏度和可重復(fù)性，每一個取樣點應(yīng)取雙份樣品并設(shè)有對照以保證結(jié)果的準確性。    8如果制品的生產(chǎn)工藝中包含了兩步或兩步以上病毒去除/滅活方法，應(yīng)該分別進行病毒滅活效果驗證。    （三）觀察指標    1病毒方面    （1）去除/滅活病毒滴度；    （2）滅活病毒速率、滅活曲線。以

13、列表和做圖形式報告驗證結(jié)果。    2病毒去除/滅活各參數(shù)允許變化范圍    3蛋白質(zhì)方面    （1）制品質(zhì)量應(yīng)符合中國生物制品規(guī)程或有關(guān)規(guī)定；    （2）采用適當(dāng)方法測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能活性的變化。如：制品比活性、HIVIG的Fc功能分析可了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是否發(fā)生了變化；凝膠色譜法可檢測蛋白質(zhì)分子大小和形狀的變化；蛋白質(zhì)形狀變化可導(dǎo)致擴散系數(shù)、沉降常數(shù)和粘度的改變；SDS-PAGE，特別是等電聚焦和PAGE結(jié)合（雙向電泳）也是檢測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的很好方法。    （3）如果采用新的去除/滅活

14、方法（包括更換使用已認可的病毒滅活方法或國內(nèi)外未曾采用過的病毒去除/滅活方法），需對蛋白質(zhì)半衰期和新免疫原性進行研究。要求如下：半衰期：用適宜動物（如大鼠或家兔）和未經(jīng)病毒去除/滅活的相同制品進行半衰期比較；新免疫原性：新免疫原性用來檢查蛋白質(zhì)較高級別結(jié)構(gòu)上的變化。這些變化不一定損害蛋白質(zhì)功能，但是會引起受體免疫反應(yīng)。實驗室檢測新免疫原性是非常困難的。可用經(jīng)和未經(jīng)病毒滅活的蛋白分別免疫動物（如家兔），所產(chǎn)生的抗體交叉用未經(jīng)和經(jīng)病毒滅活的蛋白結(jié)合。如果經(jīng)病毒滅活的蛋白抗體被未經(jīng)病毒滅活的蛋白完全結(jié)合，說明不含新抗原。由于不能保證人類免疫系統(tǒng)識別的表位與實驗動物相同，因此推薦在期臨床（獲得生產(chǎn)文號

15、后）開展是否有新抗原產(chǎn)生的研究。    （四）效果的判定    判斷病毒去除/滅活的有效性須綜合考慮，不能僅以病毒去除/滅活的量來確定。在確定有效之前，必須考慮如下因素，審慎評價每次驗證結(jié)果。    1驗證試驗所選擇的病毒是否適宜，病毒驗證的設(shè)計是否合理。    2病毒降低量（log10  ）4 logs，表示該步驟去除/滅活病毒有效。如因檢測方法造成病毒降低量4 logs時，應(yīng)盲傳三代，如無病毒檢出，可認定是有效的滅活病毒方法。    3病毒滅活動力學(xué)可更好的顯示病毒滅活的

16、效果。病毒滅活通常不是簡單的一級反應(yīng)。往往是起始反應(yīng)速率快，其后變慢。如果病毒滅活速率隨時間明顯降低，表示該方法可能無效，或者殘留的指示病毒對該滅活方法有抵抗力，說明該步病毒滅活方法無效。    4病毒實際滴度為基礎(chǔ)病毒，指示病毒與樣品19的比例混勻后零點取樣的病毒滴度，通過與經(jīng)去除/滅活病毒后的測定的實際病毒殘留量的比較，作為該病毒去除/滅活方法（步驟）實際的滅活病毒的量。    5病毒檢測敏感度的限值。    舉例說明：    （1）加入6 logs 病毒，剩余4 logs 病毒，可將去除/滅活病毒的log數(shù)計

17、算在生產(chǎn)全過程中去除/滅活病毒總量之中，但是就此步（方法）去除/滅活病毒能力而言是無效的。    （2）加入6 logs 病毒，但由于制品本身的細胞毒作用使得檢測靈敏度限值為4 logs ，僅證明除去2 logs 的病毒。在此種情況下需改變試驗設(shè)計重新進行驗證。    （3）加入6 logs 病毒，但仍可測定2 logs 的剩余病毒，且清除病毒的量可重復(fù)出，并不受工藝的影響，應(yīng)認為是有效的去除/滅活病毒的方法。    （4）加入 6 logs病毒 ，之后未檢測出病毒。但是由于檢測靈敏度限值為2 logs ，僅能認為大約清除或滅活了4

18、logs 病毒。事實上可能等于或大于4 logs ，因此應(yīng)判定此方法清除的病毒量4 logs。    （5）病毒滅活動力學(xué)是非常重要的觀察指標。如巴氏消毒法（60，10小時），如果病毒殘留量很快降到最低檢出限度值，說明此方法滅活病毒效果很好。如果病毒滅活速率緩慢，在滅活結(jié)束時才達到最低檢出限度值，不能認為是一個有效的病毒滅活方法。這就是說，評價驗證結(jié)果不能僅考慮病毒降低量，同時也要考慮病毒滅活動力學(xué)。    四、生產(chǎn)工藝去除/滅活病毒能力的驗證    生產(chǎn)工藝去除/滅活病毒能力驗證參照特定的去除/滅活病毒方法驗證的要求進行。需要特殊考

19、慮的問題有以下幾方面：    （一）只對可能有去除/滅活病毒作用的生產(chǎn)步驟進行驗證。    （二）模擬的生產(chǎn)工藝各種參數(shù)應(yīng)盡可能與實際的生產(chǎn)工藝相一致，如p、溫度、蛋白質(zhì)和其他組成成分的濃度、反應(yīng)時間、層析柱的柱床高度及流速與床高的比例、洗脫圖譜及該步驟的生產(chǎn)效果（如產(chǎn)量、比活性、組成成分）。應(yīng)分析生產(chǎn)工藝中各種參數(shù)的偏差對病毒去除/滅活效果的影響。    （三）生產(chǎn)各步驟對不同類型病毒去除/滅活的選擇性。    （四）核酸擴增技術(shù)（如PCR）檢測病毒核酸的靈敏度比較高，但是該檢測技術(shù)最大的局限性是不能區(qū)別被滅活了

20、還是未被滅活的病毒。因此該技術(shù)不能用于滅活病毒量的驗證，只能用于生產(chǎn)過程中病毒去除量的驗證。    （五）通常在生產(chǎn)過程中去除/滅活病毒量是可以計算在清除病毒總量中，但不能認定是有效病毒去除步驟。因為生產(chǎn)過程通常有一些變化，很難控制及驗證，而且，病毒分配完全取決于病毒特異的理化性質(zhì)，這些理化性質(zhì)影響了病毒與凝膠介質(zhì)相互作用和沉淀的性質(zhì)。因此由于病毒表面特性的微小差異（如：糖基化），指示病毒與靶病毒分配形式可能完全不同。在實驗室增殖的相關(guān)病毒可能在分配上與野生株不同。然而，如果病毒降低量可重復(fù)，如果影響病毒分配的各生產(chǎn)參數(shù)可以適當(dāng)?shù)卮_定和控制，所要的組份能可靠的與一般公認的含

21、病毒組份分開，就可以符合有效步驟的標準（即，認為是有效去除/滅活病毒步驟）。    （六）驗證的目的是為了確定生產(chǎn)工藝去除/滅活病毒的能力，獲得生產(chǎn)全過程中估計去除/滅活病毒的總量。一般降低的總量是各步降低病毒量的總和。但是由于病毒驗證的局限性，如分步驟中病毒降低量1 log則不應(yīng)將其計算在總量中。    五、去除/滅活病毒方法的再驗證    以下幾種情況需進行病毒去除/滅活方法的再驗證：    （一）首次生產(chǎn)者，需對生產(chǎn)工藝中特定的去除/滅活病毒方法進行再驗證；    （二）采用新工藝或?qū)υ?/p>

22、生產(chǎn)工藝進行了重大改革時，需對生產(chǎn)工藝進行清除病毒能力驗證；對特定的去除/滅活病毒方法進行去除/滅活病毒效果驗證；    （三）工藝改變但不屬重大工藝改革時，需對特定的去除/滅活病毒方法進行再驗證；    （四）被滅活的中間品組成成分或p值發(fā)生改變時，需對特定的去除/滅活病毒方法進行再驗證。    附錄血液制品病毒去除/滅活驗證申報程序    1國家藥品監(jiān)督管理局授權(quán)中國藥品生物制品檢定所及其它認定的檢測實驗室進行病毒去除/滅活效果的驗證工作。    2血液制品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)按本技術(shù)指導(dǎo)原則的要求對其生產(chǎn)工藝和特定的病毒去除/滅活方法進行驗證。如無條件，可委托其它單位進行去除/滅活病毒效果的驗證。    3血液制品生產(chǎn)企業(yè)在完成去除/滅活病毒效果驗證后，向中國藥品生物制品檢定所提出驗證申請，并附制品生產(chǎn)工藝、質(zhì)量標準、病毒滅活方法及其標準操作細則（SOP）、至少中試規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)的三批病毒滅活前中間品（去除/滅活病毒