石蠟切片和HE染色

1、石蠟切片和HE染色1、 取材頸椎脫臼處死小鼠，打開腹腔，剪去肝組織（或其他組織）。切取得組織不宜太大，以利于固定劑穿透，通常以5mm*5mm*2mm或10*mm*10mm*2mm為宜。取下所需要的肝組織，切成一小塊2-3mm厚。注意事項(xiàng)：1 取材動(dòng)作要迅速，不宜作太久的拖延一面組織細(xì)胞的成分、結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化。2 切片材料應(yīng)根據(jù)需要觀察的部位進(jìn)行選擇，盡可能不要損傷所需要的部分。2、 固定將切好的肝組織用生理鹽水組織洗一下，立即投入4%多聚甲醛中固定，固定30-50min。 注意事項(xiàng)：1 一半固定液，都以新配好為好，配好后應(yīng)儲(chǔ)存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化學(xué)變化，失去固定作用2 有些混合

2、固定液的成分之間會(huì)發(fā)生氧化還原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，失去時(shí)就沒有作用了3 固定材料時(shí)，固定液必須充足，一般為材料塊的20-30倍，有些水分多的材料，中間應(yīng)更換1-2次新液4 材料固定完成后，保存于嚴(yán)密緊塞或加蓋的容器里，同時(shí)在容器外加上標(biāo)簽，并隨同材料在溶液中投入相應(yīng)的標(biāo)簽，一面相互混淆。標(biāo)簽上注明固定液、材料來源、日期等。標(biāo)簽上的文字，應(yīng)用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書寫。3、 脫水50%70%80%95%100%100%酒精。每個(gè)0.5h。注意事項(xiàng)：1 脫水必須在有蓋的玻璃瓶中進(jìn)行，防止吸收空氣中的水分2 在更換高一級(jí)的脫水劑時(shí)，最好不要移動(dòng)材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫

3、水劑，再用吸水吸盡器皿內(nèi)剩余液，然后于皿中加入高一級(jí)脫水劑3 在低濃度酒精中，每級(jí)停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體4 在高濃度或酒精中，每級(jí)停留的時(shí)間也不宜太長，否則會(huì)使組織變脆，影響切片。5 如需過夜，應(yīng)停留在70%酒精中6 脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色渾濁現(xiàn)象。4、 透明1/2二甲苯+1/2無水乙醇（20min）純二甲苯（15min）純二甲苯（25min）。由于乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟，所以脫水后還要經(jīng)過二甲苯以過渡。當(dāng)組織中全部被二甲苯占有時(shí)，光線可以透過，組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀態(tài)。注意事項(xiàng)：1 使用透明劑時(shí)，要隨時(shí)蓋緊蓋

4、子，以免空氣中的水分進(jìn)入。2 更換每級(jí)透明劑，動(dòng)作要迅速，一方面為了不使材料快干涸，另一方面能避免吸收濕氣。3 在透明過程中，如果材料周圍出現(xiàn)白色霧狀，說明材料中的水未被脫干凈，應(yīng)退回純酒精中重新脫水，然后再透明。5、 浸蠟 將處理的材料置于1/2石蠟+1/2二甲苯中，56s水浴鍋40min。再放入石蠟90min、90-120min。透蠟的目的是除去組織中的透明劑，使石蠟滲透到組織內(nèi)部達(dá)到飽和程度以便包埋。透蠟時(shí)間根據(jù)組織大小而定。透蠟應(yīng)在恒溫箱中進(jìn)行，并保持箱內(nèi)溫度在55-60左右，注意溫度不要過高，以免組織發(fā)脆。一般置于恒溫箱0.5h。注意事項(xiàng)：1 盡量保持在較低溫度中進(jìn)行，以石蠟不凝固為

5、度；2 透蠟溫度要恒定，不可忽高忽低；3 操作要迅速，力求在最短的時(shí)間內(nèi)完成石蠟透入過程，以免引起組織變硬、變脆、收縮等。6、 包埋先提升恒溫箱的溫度至60，換純蠟3次，每次1-2h，用包埋盒至于60的燙板上，倒入材料，擺放好材料，吧標(biāo)簽正面向外置于底部，補(bǔ)足石蠟，倒好后輕輕的置于冷水盆中，注意底面要接觸盆中涼水，待石蠟全部凝固后可取出晾干，也可在涼水盆中放置過夜。7、 切片 將已固定和修好的石蠟塊裝在切片機(jī)的夾物臺(tái)上。 將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。 搖動(dòng)推動(dòng)螺旋，使石蠟與刀口貼近，但不可超過刀口。 調(diào)整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約15度左右。 調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片

6、厚度，一般為4-10微米 一切調(diào)整好后可以開始切片。 切成來的蠟帶到20-30cm長時(shí)，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以免卷曲，并牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。 用單刀面切去蠟塊一小段，放在載玻片上加水一滴，置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好。 切片工作結(jié)束后，應(yīng)將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟，把切片機(jī)擦拭干凈妥善保管。8、 粘片 將粘貼劑置薄玻片，再取切片浮值粘片劑上，然后置烘片臺(tái)上，使切片展開燙平，材料不現(xiàn)皺紋為度。最后將切片依次排好，用濾紙吸去多余水分，同時(shí)以記號(hào)筆在玻片上編號(hào)，放入溫箱中烘干，溫度為30-40過夜。9、 脫蠟和染色 純二甲

7、苯（1020min）純二甲苯（510min）1/2二甲苯+1/2純酒精100%純酒精95%酒精85酒精70%酒精50%酒精自來水沖洗10s切片放入蘇木精中染色約10-30min用自來水流水沖洗約15min使片變藍(lán)。10、 分化和漂洗 將切片放入1%鹽酸乙醇液中褪色，約至2s至數(shù)秒。見切片變紅，顏色較淺即可。切片再放入自來水流水中使其恢復(fù)藍(lán)色。11、 脫水和復(fù)染切片如50%乙醇70%乙醇80%乙醇中各3-5min。用0.5%一紅乙醇液對(duì)比染色1-3min。伊紅主要染細(xì)胞質(zhì)，著色濃淡應(yīng)與蘇木精染細(xì)胞核的濃淡相配合，如果細(xì)胞核染色較濃，細(xì)胞質(zhì)也應(yīng)濃染，以獲得鮮明的對(duì)比。反之，如果細(xì)胞核染色較淺，細(xì)胞質(zhì)也應(yīng)淡染?？稍谝良t乙醇液中滴加數(shù)滴醋酸助染，促使細(xì)胞質(zhì)容易著色，并且經(jīng)乙醇脫水時(shí)不易褪色。12、 脫水和透明 將切片放入95%乙醇中洗去多余的紅色，然后放入無水乙醇中3-5min。最后濾紙吸干多余的乙醇，將切片放入二甲苯、中各3-5min。 二甲苯應(yīng)盡量保持無水，應(yīng)經(jīng)常更換