乳酸左氧氟沙星有關(guān)物質(zhì)方法學(xué)驗(yàn)證

1、左氧氟沙星（Levofloxacin）為氧氟沙星的左旋體，具有抗菌譜廣、抗菌作用強(qiáng)的特點(diǎn)。日本第一制藥株式會(huì)社于1993年在日本上市銷售左氧氟沙星原料及片劑，并現(xiàn)在已在英國(guó)、美國(guó)等多國(guó)上市。目前國(guó)內(nèi)已批準(zhǔn)上市的左氧氟沙星有乳酸鹽、鹽酸鹽和甲磺酸鹽，三種加酸根的左氧氟沙星均有片劑、膠囊劑、注射劑等多種劑型上市。本次驗(yàn)證根據(jù)乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液相關(guān)物質(zhì)方法學(xué)驗(yàn)證方案開展驗(yàn)證工作。有關(guān)物質(zhì)檢查方法的驗(yàn)證主要項(xiàng)目有專屬性、耐用性、精密度等。1、儀器Agilent1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫）；電子天平CP225D（北京賽多利斯儀器公司）; 酸度計(jì)(上海大普儀器公司2、主要試劑表1主要試劑及

2、來源試劑名稱 級(jí)別 來源醋酸銨 AR 天津市優(yōu)譜化學(xué)試劑有限公司高氯酸鈉 AR 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司鹽酸 AR 重慶川東華東（集團(tuán)）有限公司磷酸 AR 重慶川東華東（集團(tuán)）有限公司乙腈 GR 雷尼韋爾（上海）貿(mào)易有限公司3、對(duì)照品來源及批號(hào)表2對(duì)照品來源信息表對(duì)照品名稱來源批號(hào)左氧氟沙星中國(guó)藥品生物制品檢定所130455-200604130455-201005氧氟沙星中國(guó)藥品生物制品檢定所130454-200604環(huán)丙沙星中國(guó)藥品生物制品檢定所130451-200302雜質(zhì)A歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)品Batch 2.0雜質(zhì)E歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)品Batch 3.04、樣品來源及批號(hào)4.1中試產(chǎn)品表3中試產(chǎn)

3、品信息表p 批號(hào) 規(guī)格 包裝形式4.2原研試劑來源及批號(hào)表4原研制劑產(chǎn)品信息表批號(hào) 規(guī)格 來源1205E59 100ml：0.5g 第一三共制藥（北京）有限公司5、方法與結(jié)果5.1色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以醋酸銨高氯酸鈉溶液（取醋酸銨4.0 g和高氯酸鈉7.0 g，加水1300 ml使溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.2）- （8515）為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B；按下表5進(jìn)行線性梯度洗脫。柱溫為40 ；流速為每分鐘1 ml。表5線性梯度洗脫比例表時(shí)間（分鐘）流動(dòng)相A（%）流動(dòng)相B（%）010001810002570303970304010005010005.2雜質(zhì)測(cè)定法 稱取左氧

4、氟沙星對(duì)照品、環(huán)丙沙星對(duì)照品和雜質(zhì)E對(duì)照品各適量，用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋制成每1 ml中約含左氧氟沙星1.2 mg、環(huán)丙沙星和雜質(zhì)E各6 g的混合溶液，取10 l注入液相色譜儀，以294 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，記錄色譜圖，左氧氟沙星峰的保留時(shí)間約為15分鐘。左氧氟沙星峰與雜質(zhì)E峰和左氧氟沙星峰與環(huán)丙沙星峰的分離度應(yīng)分別大于2.0與2.5。取對(duì)照溶液10 l注入液相色譜儀，以294 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%。精密量取供試品溶液、對(duì)照溶液和雜質(zhì)A對(duì)照品溶液各10 l，分別注入液相色譜儀，以294 nm和238 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，記錄色譜圖。供試

5、品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，含雜質(zhì)A（238 nm檢測(cè)）按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，不得過0.3%。其他單個(gè)雜質(zhì)（294 nm檢測(cè)）峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積（0.2%），其他各雜質(zhì)（294 nm檢測(cè)）峰面積的和不得大于對(duì)照溶液主峰面積的2.5倍（0.5%）。供試品溶液色譜圖中任何小于對(duì)照溶液主峰面積0.1倍的雜質(zhì)峰忽略不計(jì)。5.3專屬性試驗(yàn)陰性干擾試驗(yàn)（1）取0.1 mol/L鹽酸溶液，進(jìn)樣測(cè)定；（2）6 mol/L氨溶液1 ml與水適量使溶解，用水稀釋至100ml，進(jìn)樣測(cè)定；（3）輔料空白：按處方配置不含乳酸左氧氟沙星的輔料空白樣品，照供試品制備方法制備樣品，進(jìn)樣測(cè)定；（4）乳酸左氧氟沙星氯化

6、鈉注射液：取本品按供試品制備方法制備，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)論： 檢驗(yàn)人： 復(fù)核人：取乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液分別進(jìn)行高溫降解、酸降解、氫氧化鈉降解、光照降解和過氧化氫氧化降解，方法如下： 表6專屬性試驗(yàn)結(jié)果樣品雜質(zhì)A雜質(zhì)峰總面積雜質(zhì)個(gè)數(shù)雜質(zhì)（%）未降解光照降解氧化降解高溫降解堿降解酸降解結(jié)論：檢驗(yàn)人： 復(fù)核人：5.5耐用性試驗(yàn)柱溫：色譜柱溫采用40，同時(shí)對(duì)30和35進(jìn)行了考察。流速：分別0.8ml/min和1.0ml/min（分別記為低流速、高流速）進(jìn)行考察。流動(dòng)相比例變化醋酸銨高氯酸鈉溶液/乙腈(流動(dòng)相比例：84.5/15.5、85.5/14.5（分別記為低鹽、高鹽）；醋酸銨高氯酸鈉溶液(緩沖鹽P

7、H：2.0、2.4（分別記為低pH，高pH）；不同色譜柱分別用3根不同廠家色譜柱（分別記為1#、2#、3#）進(jìn)行考察。檢測(cè)波長(zhǎng)變化檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為289m,、299nm、233nm、243nm進(jìn)行考察。以上試驗(yàn)以檢測(cè)條件為基準(zhǔn)（即原方法），每次試驗(yàn)僅變動(dòng)一個(gè)因素，其它因素不變。表7 耐用性試驗(yàn)結(jié)果變更條件雜質(zhì)A單雜總雜RSD%原方法柱溫3542流速低流速高流速緩沖鹽PH低PH高PH流動(dòng)相比例低鹽高鹽檢測(cè)波長(zhǎng)289nm299nm233nm243nm色譜柱1#2#3#結(jié)論： 檢驗(yàn)人： 復(fù)核人：5.6檢測(cè)限與定量限（雜質(zhì)A）檢測(cè)限：分別精密吸取不同濃度的雜質(zhì)A對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，依法測(cè)定 ，以信

8、噪比約為3：1時(shí)的進(jìn)樣量為最低檢測(cè)限。定量限：分別精密吸取不同濃度的雜質(zhì)A對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，依法測(cè)定 ，以信噪比約為10：1時(shí)的進(jìn)樣量為最低檢測(cè)限。結(jié)論： 檢驗(yàn)人： 復(fù)核人：5.7線性與范圍（雜質(zhì)A）精密稱取雜質(zhì)A對(duì)照品18mg，置100ml量瓶中，加6mol/L氨溶液1ml與水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻得儲(chǔ)備液；量取該液逐級(jí)稀釋至含雜質(zhì)A對(duì)照溶液的濃度為：0.9g/ml、1.8g/ml、2.7g/ml、3.6g/ml、5.4g/ml 、7.2g/ml，加6 mol/L氨溶液1 ml與水適量使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，的溶液作為線性溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積值

9、，以峰面積對(duì)進(jìn)樣量回歸。表8 線性和范圍試驗(yàn)結(jié)果編號(hào)雜質(zhì)A濃度（g/ml）峰面積（A）10.921.832.743.655.467.2結(jié)論：檢驗(yàn)人： 復(fù)核人：5.8精密度試驗(yàn)精密量取雜質(zhì)A對(duì)照品溶液、對(duì)照溶液各10l，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積值。表9 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果樣品樣1樣2樣3樣4樣5樣6RSD%雜質(zhì)A最大單雜其他雜質(zhì)結(jié)論： 檢驗(yàn)人： 復(fù)核人：由2名實(shí)驗(yàn)人員、不同日期、采用不同儀器設(shè)備進(jìn)樣分析。（樣品制備方法同重復(fù)性試驗(yàn)）表10 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果雜質(zhì)A樣品樣1樣2樣3樣4樣5RSD%1#儀器 （1）1#儀器 （2）2#儀器（1）2#儀器（2）最大單雜1#儀器 （1）1#儀器 （2

10、）2#儀器（1）2#儀器（2）其他雜質(zhì)1#儀器 （1）1#儀器 （2）2#儀器（1）2#儀器（2）注：（1）、（2）代表不同的實(shí)驗(yàn)人員。結(jié)論： 檢驗(yàn)人： 復(fù)核人：精密量取雜質(zhì)A對(duì)照品溶液10l，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積值，計(jì)算平均峰面積和RSD。表11 雜質(zhì)A進(jìn)樣精密度試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)樣數(shù)次123456RSD%雜質(zhì)A結(jié)論： 檢驗(yàn)人： 復(fù)核人：5.9準(zhǔn)確度試驗(yàn)（雜質(zhì)A）量取中試樣品（C130301 01）15ml置25ml量瓶中，加0.1mol/L HCl溶液稀釋至刻度，搖勻，得準(zhǔn)確度樣1。量取“5.7線性及范圍”項(xiàng)下儲(chǔ)備液5ml置50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得雜

11、質(zhì)A對(duì)照品儲(chǔ)備液。量取準(zhǔn)確度樣1樣品5ml置10ml量瓶中，再量取雜質(zhì)A對(duì)照品儲(chǔ)備液1.00ml置該量瓶中，加0.1mol/L HCl溶液稀釋至刻度，搖勻，得低濃度樣品；同法制備3份樣品。量取準(zhǔn)確度樣1樣品5ml置10ml量瓶中，再量取雜質(zhì)A對(duì)照品儲(chǔ)備液2.00ml置該量瓶中，加0.1mol/L HCl溶液稀釋至刻度，搖勻，得中濃度樣品；同法制備3份樣品。量取準(zhǔn)確度樣1樣品5ml置10ml量瓶中，再量取雜質(zhì)A對(duì)照品儲(chǔ)備液3.00ml置該量瓶中，加0.1mol/L HCl溶液稀釋至刻度，搖勻，得高濃度樣品；同法制備3份樣品。取上述各供試液測(cè)定其峰面積， 計(jì)算其回收率。表12雜質(zhì)A方法準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)

12、果樣品測(cè)得濃度加入濃度回收率%平均回收率%RSD%低濃度樣品-1低濃度樣品-2低濃度樣品-3中濃度樣品-1中濃度樣品-2中濃度樣品-3高濃度樣品-1高濃度樣品-2高濃度樣品-3結(jié)論：檢驗(yàn)人： 復(fù)核人：5.10溶液穩(wěn)定性量取中試樣品（批號(hào)）15ml置于50ml量瓶中，加0.1mol/L HCl溶液稀釋至刻度，搖勻，得有關(guān)物質(zhì)測(cè)定供試樣品；取此樣品溶液于0h、4h、12h、16h進(jìn)樣分析。 表13 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果樣品放置時(shí)間(h雜峰數(shù)目主成分峰面積RSD%0h4h12h16h結(jié)論： 檢驗(yàn)人： 復(fù)核人：5.11兩種有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法的對(duì)比研究分別用本公司生產(chǎn)的兩種包裝形式（聚丙烯輸液瓶、聚丙烯共混輸液袋）和本產(chǎn)品原研廠家（第一三共制藥有限公司）樣品進(jìn)行了有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法的對(duì)比測(cè)定，結(jié)果見表。表14 兩種測(cè)定方法的對(duì)比測(cè)定結(jié)果批號(hào)原方法新方法雜質(zhì)個(gè)數(shù)（個(gè)）有關(guān)物質(zhì)量（%）雜質(zhì)個(gè)