應(yīng)用PVA構(gòu)建妊娠相關(guān)血漿蛋白A固相時(shí)間分辨熒光免疫試劑

1、應(yīng)用PVA構(gòu)建妊娠相關(guān)血漿蛋白A固相時(shí)間分辨熒光免疫試劑    摘要 目的：合成(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物，并用于構(gòu)建妊娠相關(guān)血漿蛋白A固相時(shí)間分辨免疫熒光試劑。方法：用PVA作為載體結(jié)合BCPDAEu3+和生物素親和素，以雙抗體夾心法原理，結(jié)合生物素標(biāo)記抗體和包被抗體建立PAPPA時(shí)間分辨免疫熒光試劑，并進(jìn)行方法律學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果：成功的合成了活性的(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物，構(gòu)建PAPPA試劑檢測(cè)靈敏度為0.7 mIU/L；批內(nèi)變異系數(shù)在3.89%4.96%之間,批間變異系數(shù)在7.35%9.

2、27%之間。結(jié)論：合成的(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物較高的反應(yīng)活性，可以用于多種試劑的構(gòu)建。構(gòu)建的PAPPA試劑靈敏度高，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。 關(guān)鍵詞 妊娠相關(guān)血漿蛋白A；固相時(shí)間分辨熒光免疫；親和素生物素聚乙烯胺4,7二氯磺苯基1，10啡羅啉2，9二羧酸銪復(fù)合物；唐氏綜合征論文格式Develop A Direct Solid Phase Lanthane Timeresolved Fluoroimmunoassay Reagent of PAPPAutilizing PVAAbstract :Objective To develop a direct sol

3、id phase lanthane timeresolved fluoroimmunoassayreagent of PAPPA by synthesizing a complex of (SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+. Methods  Polyvinylamine (PVA) was labeled with biotinstreptavidin and europium chelate of 4,7bis(chlorosulfophenyl)1,10phenanthroline2,9dicarboxylicacid(BCPDA). Using labele

4、d PVA complex,We designed twosite sandwich timeresolved fluoroimmunoassay of PAPPA and evaluated assay characteristics of PAPPA kit .Results We successed synthesizing a conjuagete of (SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+ and a reagent of PAPPA. Detection limits achieved were 0.7mIU/L.The calibration curve was

5、linear 010000mIU/L.Intra and interassay imprecision (CV) was 3.89%4.96% and 7.35%9.27%.Recovery was 95.8%104.2%. Conclusions The conjugate of (SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+ synthesizied was reactive ,highly fouorescent. A sorts of kit could be synthesized ,taking advantage of it. The reagent of PAPPA wa

6、s potentially suited for use in clinical with highly analytical sensitivity.Key words: Pregnancy associated plasma protein A;Direct solid phase lanthane timeresolved fluoroimmunoassay; StreptavidinbiotinPolyvinylamine europium chelate of 4,7bis(chlorosulfophenyl)1,10phenanthroline2,9dicarboxylicacid

7、; Down's Syndrome妊娠相關(guān)血漿蛋白A(Pregnancy associated plasma protein A，PAPPA)是一種高分子2糖蛋白，20世紀(jì)70年代在孕婦血清中被發(fā)現(xiàn)1。在孕婦血中主要PAPPA是胎盤滋養(yǎng)層組織分泌，它是一種異源四聚體，由兩個(gè)分子量為200 000250 000亞基構(gòu)成。PAPPA亞基和兩個(gè)嗜紅細(xì)胞主要基礎(chǔ)蛋白(Proform of eosinophil major basic protein)以二硫鍵結(jié)合而成2，在孕婦血中只存在微量游離單體PAPPA。PAPPA亞基由1 547個(gè)多聚核苷酸構(gòu)成，包括1個(gè)拉長(zhǎng)的鋅指結(jié)構(gòu)，3個(gè)Linnotc

8、h重復(fù)序列，以及5個(gè)短一致重復(fù)序列3。在體內(nèi)PAPPA是一種蛋白酶，主要針對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白4(IGFBP4)和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白5(IGFBP5)起作用。胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGFI)在促進(jìn)細(xì)胞分裂和增殖起重要作用，它主要通過IGF1受體起作用，IGFI、II的生物活性受6個(gè)高親和性IDFBP調(diào)節(jié)4，5。PAPPA主要用于產(chǎn)前篩查唐氏綜合征(Down's Syndrome，DS)，迄今醫(yī)醫(yī)藥學(xué)上對(duì)此病尚無有效的治療和預(yù)防措施，只能通過產(chǎn)前篩查防止DS兒的出生，但目前開展的絨毛活檢,羊水穿刺及臍帶血穿刺均為侵入性檢查,有1%3%的流產(chǎn)率,且方法繁瑣,出報(bào)告時(shí)間長(zhǎng),不適宜大

9、范圍孕婦的普查,僅限于高危人群的診斷。大量報(bào)道認(rèn)為PAPPA可作為DS胎兒產(chǎn)前篩查的的標(biāo)志物。在15周20周通過結(jié)合孕婦孕周、超聲診斷和FreeHCG可以鑒別65%75%，但要在3個(gè)月6個(gè)月結(jié)合AFP、游離E3以及抑制素上述成分可鑒別85%90%6。有文獻(xiàn)7報(bào)道PAPPA在急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)的早期診斷有一定的意義，PAPPA在ACS患者血清含量30 mIU/L，同時(shí)結(jié)構(gòu)不同于孕婦體內(nèi)的PAPPA且存在動(dòng)態(tài)變化，必須使用超靈敏的方法進(jìn)行檢測(cè)。國(guó)內(nèi)PAPPA的診斷試劑大多為ELISA和PerkinElmer公司生產(chǎn)的解離增強(qiáng)時(shí)間分辨熒光免疫探析(dissociated enhance l

10、anthane timeresolved fluoroimmunoassay,DELFIA)試劑，無國(guó)產(chǎn)PAPPA時(shí)間分辨熒光試劑。我們使用PVA(聚乙烯胺)作為載體結(jié)合BCPDA鑭系螯合物合成一種高靈敏的固相時(shí)間分辨熒光免疫探析(direct solid phase lanthane time resolved fluoroimmunoassay,DSLFIA)試劑。為提高檢測(cè)靈敏度和克服BCPDA標(biāo)記抗體使抗體失活的問題，我們引入了生物素親和素(biotinstreptavidin system)系統(tǒng)。1材料和方法1.1材料1.2方法2結(jié)果2.1用HPLC純化(Bio)xPVA(BCPDA

11、)y復(fù)合物在10 min16 min 出現(xiàn)(Bio)xPVA(BCPDA)y的吸收峰，沒有結(jié)合BCPDA的吸收峰在17 min24 min出現(xiàn),見圖1。 圖1凈化（Bio）x聚乙烯醇（BCPDA）y在高性能液化色譜（TSK250過濾柱）上的變化圖。（略）流速控制在0.8 ml/min，吸光率325 nm2.2用滴定法確定親和素和(Bio)xPVA(BCPDA)y最佳配比SA量恒定0.01 mg/ml，生物素標(biāo)記的抗體包被分別濃度為0 ng/孔、0.5 ng/孔、5 ng/孔、50 ng/孔，緩沖液為pH 7.8 TrisHcl 0.1M，Eu3+ 10-5 M，(Bio)xPVA(B

12、CPDA)y用量從40 l55 l選擇最佳值，50 l復(fù)合物熒光強(qiáng)度值(cpm)最佳，如圖2。圖2滴定鏈球菌，（Bio) x聚乙烯醇（BCPDA）y在10-3 M Eu3+,0.1 M Tris-Hcl buffer(pH 7.8)緩沖液中的變化，0.01 mg/ml 鏈球菌，容積變動(dòng)范圍40 l55 l，觀察到最佳容積為50 l（略）2.3驗(yàn)證活性用生物素化的各種濃度(0 ng/50l，0.5 ng/50l，5 ng/50l，50 ng/50l，100 ng/50l)鼠IgG包被96孔微板驗(yàn)證(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物的反應(yīng)活性，在測(cè)定范圍內(nèi)成線性分布，見圖3

13、。 圖3IgG維生素定量法標(biāo)定曲線（略）2.4PAPPA定標(biāo)曲線及靈敏度在0 mIU/L10 000 mIU/L范圍內(nèi)定標(biāo)曲線為線性分布，見圖4。S0標(biāo)準(zhǔn)重復(fù)20次檢測(cè)均值加2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出檢測(cè)限為0.7 mIU/L(數(shù)據(jù)沒顯示)。 圖4PAPP-A標(biāo)定曲線（略）2.5批內(nèi)、批間精密度對(duì)質(zhì)控血清批內(nèi)進(jìn)行20次探析，批間進(jìn)行12次探析，得到批內(nèi)變異系數(shù)3.89%4.96%,批間變異系數(shù)在7.35%9.27%之間,見表1。表1批內(nèi)、批間變異系數(shù)比較（略）2.6回收實(shí)驗(yàn)對(duì)收集樣本(P1 、P2 、P3 )依據(jù)定標(biāo)探析過程進(jìn)行測(cè)量，然后將Control1、Control2、C

14、ontrol3分別等體積加入P1 、P2、P3中進(jìn)行多次測(cè)量，分別計(jì)算回收率95.8%104.2%,見表2。表2回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（略）3討論臨床化學(xué)家最關(guān)心的問題是探析技術(shù)靈敏度，這也是臨床診斷試劑的核心。近來，在臨床化學(xué)檢測(cè)物質(zhì)的濃度的范圍10-3 mol/L10-16 mol/L。PCR以及其他的體外擴(kuò)增技術(shù)使DNA、RNA檢測(cè)方便、高效、特異。不幸的是蛋白不能復(fù)制，最敏感的定量方法是依靠蛋白之間的特異性結(jié)合如抗原抗體反應(yīng)。一個(gè)提高蛋白檢測(cè)靈敏度的方法就是信號(hào)放大，即在蛋白上標(biāo)記可以檢測(cè)的標(biāo)記物，通過標(biāo)記物的信號(hào)放大而達(dá)到更容易檢測(cè)的目的。時(shí)間分辨免疫學(xué)技術(shù)是80年代迅速發(fā)展起來的的一種公

15、認(rèn)的最有發(fā)展前途的非放射免疫標(biāo)記技術(shù)，其中熒光鑭系螯合物具有較大的Stokes 位移(275 nm)，較窄的發(fā)射光譜(10 nm)，較長(zhǎng)的熒光壽命(10 us1 000 us)，而被廣泛構(gòu)建時(shí)間分辨熒光免疫試劑。臨床運(yùn)用最廣泛的是PE公司生產(chǎn)的解離增強(qiáng)鑭系時(shí)間分辨熒光免疫探析(dissociationenhanced lanthanide fluoroimmunoassay，DELFIA)試劑 ，它必須使Eu3+與螯合物分離，由于其信號(hào)較弱，必須加入增強(qiáng)液來發(fā)大信號(hào)，操作煩瑣且在加樣的過程中可能引起外源性的污染，這些弊端影響了它的應(yīng)用。在1987年，Evangelista和Diamandis合

16、成一種新的螯合物BCPDA，開創(chuàng)了固相時(shí)間分辨免疫熒光技術(shù)，解決了DELFIA上述問題8，9，但是BCPDA的較大分子量、表面特性和直接標(biāo)記蛋白容易引起蛋白的失活對(duì)它應(yīng)用帶來一些問題，解決的辦法就是連接一個(gè)載體。我們實(shí)驗(yàn)中引入了PVA作為載體，連接BCPDA和生物素親和素。PVA直接連接蛋白技術(shù)難度較大，而生物素標(biāo)記蛋白技術(shù)比較成熟，同時(shí)親和素有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，可以起到信號(hào)放大作用，而提高檢測(cè)靈敏度。我們實(shí)驗(yàn)中成功的合成了(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物，用它去識(shí)別生物素標(biāo)記的抗體(見圖3)，結(jié)果顯示親和力非常高。實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵問題是選擇SA和(Bio)xPVA(BCP

17、DA)yEu3+復(fù)合物最佳比，我們實(shí)驗(yàn)中做了7個(gè)濃度梯度，選取結(jié)合后熒光強(qiáng)度最大的(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物濃度。使用HPLC層析純后的(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物回收率是68%。通過實(shí)驗(yàn)選擇最佳檢測(cè)抗體濃度、生物素化抗體濃度和標(biāo)本用量。Jackson13探析了提高靈敏度的因素即兩個(gè)關(guān)鍵的因素與最終的結(jié)合探析靈敏度相關(guān)：我們監(jiān)測(cè)標(biāo)記分子(放射性同位素、化學(xué)發(fā)光劑、熒光團(tuán))的能力；結(jié)合試劑的質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)條件，在臨床化學(xué)存在一種誤導(dǎo)是特別敏感的監(jiān)測(cè)方法(化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨熒光)能獲得好的結(jié)果。其實(shí)這是錯(cuò)誤的，如果實(shí)驗(yàn)試劑和條件(抗體的親和性和特異性，固相結(jié)合

18、物的自然特性以及清洗效率)不被選擇，很難達(dá)到理想的檢測(cè)效果。為達(dá)到較高的靈敏度，需要選擇高靈敏度的標(biāo)記技術(shù)、高親和力的試劑和最好的探析條件(可將試劑的非特異性結(jié)合降到最小)。使用鑭系螯合物的時(shí)間分辨熒光免疫探析是一種高靈敏的標(biāo)記技術(shù)，關(guān)鍵是實(shí)驗(yàn)條件的選擇，我們驗(yàn)證不同孵育時(shí)間下，(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物產(chǎn)出率，以及和生物素化抗體的結(jié)合能力(數(shù)據(jù)不能顯示)。經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)選擇了Eu3+的濃度，使其能和BCPDA形成最佳比例(數(shù)據(jù)不能顯示)。反應(yīng)條件的建立中，我們篩選實(shí)驗(yàn)反應(yīng)溫度(18 56 ，每5 選擇一次)和反應(yīng)時(shí)間(10 min24 h)，考慮到臨床結(jié)果的報(bào)

19、告時(shí)間，選擇了20 min(數(shù)據(jù)不能顯示)。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)條件選擇，形成了PAPPA的定標(biāo)曲線，通過定標(biāo)曲線確定最低檢測(cè)限(見圖 3)。我們構(gòu)建的(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物可以用于多種像PAPPA這樣使用雙抗體夾心法檢測(cè)的試劑，如AFP等。我們選擇構(gòu)建PAPPA主要考慮到本國(guó)產(chǎn)前篩查項(xiàng)目的自產(chǎn)試劑較少，而且DS篩查尤為重要，由于科研經(jīng)費(fèi)的問題，沒有進(jìn)行最佳單抗配對(duì)實(shí)驗(yàn)，只是參考了國(guó)外的相關(guān)文獻(xiàn)。不過我們實(shí)驗(yàn)的核心是構(gòu)建(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物，為以后構(gòu)建其他試劑做一定的前期工作。我們構(gòu)建的PAPPA試劑,回收實(shí)驗(yàn)和精密度試驗(yàn)顯示，完全

20、滿足試劑盒要求。在今后的工作中，我們主要驗(yàn)證(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物和成品試劑盒的穩(wěn)定性，以及進(jìn)一步和PE公司的PAPPA的DELFIA試劑做大量的臨床對(duì)比實(shí)驗(yàn)?？傊?，我們成功構(gòu)建了(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+復(fù)合物和PAPPA的成品試劑，它有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，又克服了DELFIA試劑的缺點(diǎn)。參考文獻(xiàn):1lLn TM,Galbert SP,Kiefer D,et al.Characterization of four human pregnancyassociateid plasma proteinsJ.Am J Obste

21、t Gynecol ,1974,118:22336.2Oxcig C,Sand O,Kristensen T,et al.Circulating human pregnancyassociated plasma proteinA is disulfidebridged to the proform of eosinophil majoe basic proteinJ.J Biol Chem,1993,268:122436.3Kristensen T,Oxvig C,Sand O,et al.Aminoacide sequence of human pregnancyassociated pla

22、sma proteinA derived from cloned cDNAJ.Biochemistry,1994,33:15921598. 4Hwa V,Oh Y,Rosenfeld RG.The insulinlike growth factor binding protein(IGFBP) superfamilyJ.Endocr Rev,1999,20:761787.5Qin QP , Christransen M , Pettersson K. Point of care time resolved immunofluorometric assay for human pregnancy

23、 associated plasma protein A : use in first trimester screening for Down syndrome. Clin Chem ,2002 ,48 (3) :473 836Wald NJ,Densem JM,Smith D,et al.Fourmarker serum screening for Down's syndromeJ.Prenat Diagn,1994,14:707716.7QiuPing Qin,Saara Kokkala,Juha Lund,et al.Moecular distinction of circul

24、ating pregnancyassociated plasma protein A in Myocardial Infarction and pregnancyJ.Clinical Chemistey,2005,51(1):7583.8Evanglista RA,Pollak A,Allore B,et al.A new europium chelate for protein labeling and timeresolved fluorometric applicationsJ.Clin Biochem1988,21:173178.9Diamandis EP, Morton RC. Timeresolved fluorescence using a europium chelate of 4,7bis(chlorosulfophenyl)1,10phenant