改性納米羥基磷灰石_PLGA復合材料的制備及生物活性

1、Vol.302009年7月高等學?；瘜W學報CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIESNo.714391444改性納米羥基磷灰石/PLGA復合材料的制備及生物活性于婷1,2,劉婭,王宇,景遐斌,章培標,陳學思2.吉林大學公共衛(wèi)生學院,長春130021)21111(1.中國科學院長春應用化學研究所,高分子物理與化學國家重點實驗室,長春130022;摘要以低聚乳酸接枝改性的羥基磷灰石納米粒子(op2HA)和聚丙交酯2乙交酯(PLGA)制備的生物可降解納米復合材料(op2HA/PLGA)為研究對象,采用FTIR,TGA,ESEM和EDX分析其接枝反應、接枝率、表面形貌和鈣

2、磷沉積情況,通過在材料膜表面接種兔成骨細胞進行體外培養(yǎng),采用熒光染色、NIHImageJ圖像分析和Real2timePCR綜合評價細胞在材料表面的形態(tài)、黏附面積比,以此評價新型骨修復納米復合材料op2HA/PLGA.813%,摻入至PLGA、,型膠原蛋白(Collagen2)、骨形態(tài)蛋白22(,提高材料的鈣磷沉積能力.op2HA/P關鍵詞(;2乙交酯(PLGA);表面改性;納米復合材料;成骨活性中圖分類號文獻標識碼A文章編號025120790(2009)0721439206生物活性材料是指能夠增進細胞活性或新組織再生的材料1.具有生物活性的硬組織修復材料必須能夠增強成骨細胞的活性,有利于成骨細

3、胞的黏附與增殖.羥基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)是人體骨組織的主要無機成分,占人體骨組織的70%以上.人工合成的HA生物陶瓷由于其結構和性能與天然HA的相似,并具有良好的生物相容性和成骨活性,因此被廣泛應用于骨損傷的修復2,3.但HA生物陶瓷在組織工程應用中存在脆性大、易碎、不易加工成型和體內降解性差等缺陷.聚丙交酯2乙交酯Poly(lactide2co2glycolide),PLGA為丙交酯(LA)和乙交酯(GA)的共聚物,是應用于臨床的生物可降解材料.PLGA的可降解性伴隨著酯鍵的水解而發(fā)生,其最終降解產物為二氧化碳和水,可通過機體新陳代謝完全排出體外,因此不必通過外科手術

4、去除移植物以及顱面外科等的治療高的機械性而備受關注44.由于LA與GA的降解速度不同,因此可以通過控制LA和GA的比例調節(jié)PLGA的降解速率.目前,PLGA已經用于骨軟骨炎和一些小的骨折.但PLGA等聚酯材料缺乏生物活性,其機械性能仍未能達到承重骨的固定.由于親水的HA與疏水的PLGA共混,界面相容性差,且HA納米粒子表面和修復需要.近年來,納米HA/生物可降解聚合物的復合材料以其良好的骨傳導性、生物降解性和較5能大,易發(fā)生團聚現(xiàn)象,很難均勻分散到疏水的聚合物中,導致材料的穩(wěn)定性差,植入體內后力學強度衰減快,限制了其臨床應用.因此,人們嘗試采用硅烷偶聯(lián)劑修飾及原位聚合等方法對其進行表面6改性.

5、在無催化劑情況下,將低聚乳酸(LAcoligomer)與納米HA表面的鈣原子通過化學鍵連接,制成表面接枝低聚乳酸的改性HA納米粒子(op2HA),改善了納米粒子與基體材料之間的界面相容性,提高了界面結合力,從而增強了復合材料的熱穩(wěn)定性和機械性能6,7.本文制備了改性的op2HA納米粒子和op2HA/PLGA復合材料,研究材料的表面性質及生物活性,探索其對成骨細胞黏附、增殖和分化影響的相關機制,為該新型骨修復納米復合材料在骨組織工程和骨修復中的應用提供理論依據.收稿日期:2008212204.基金項目:國家自然科學基金(批準號:50673090)和國家“八六三”計劃(批準號:2007AA03Z3

6、20)資助.聯(lián)系人簡介:章培標,男,博士,副研究員,主要從事生物醫(yī)用高分子和組織工程研究.E2mail:zhangpb劉婭,女,教授,博士生導師,主要從事生物安全性評價研究.E2mail:liuya© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 1440高等學校化學學報Vol.301實驗部分1.1試劑與儀器丙交酯(L2LA,99%,Purac公司);辛酸亞錫(99%,Sigma公司);DMEM(DulbeccosModifiedEa2gleMedium干粉,Gib

7、co公司);F12(F12NutrientMixture干粉,Gibco公司);標準胎牛血清(FBS,tbd公司);胰蛋白酶(Gibco公司);MTT(噻唑蘭,Solarbio公司);羥乙基呱嗪乙硫磺酸(HEPES,Sigma公司);異硫氰酸熒光素(FITC,Sigma公司);RNA提取試劑盒(Promega公司);逆轉錄試劑(Promega公司);Real2timePCR試劑(Stratagene公司);磷酸、氫氧化鈣和乙酸乙酯等為國產分析純試劑.傅里葉變換紅外光譜儀(IFS66V/S真空型,Bruker);熱重分析儀(TGA,Q2500,TA);場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡(ESEM,XL30

8、ESEM2FEG,FELCOMPANY);能量色散譜儀(EDX,Genesis2000);實時定量PCR儀(Real2timePCR,Stratagene);熒光倒置顯微鏡(NikonEclipsTE20002U);數(shù)碼攝像系統(tǒng)(NikonDXM1200F);CO2培養(yǎng)箱(Sanyo);全自動酶標儀(MultiskanMK3).實驗用乳兔為出生24h內新西蘭大白兔,由吉林大學基礎動物實驗中心提供.1.2改性納米羥基磷灰石(op2HA)/PLGA復合物的制備按文獻6方法,以磷酸和氫氧化鈣為原料在502030nm,長度為100200nmn.6H3POH)21022On2HAL2乳酸與300mL甲苯

9、混合,將混合物緩慢加熱到72,所得反應物用氯仿溶解,在冷乙醇中沉降出來,60真空干燥24h得到端羧基低聚乳酸,整個反應過程不添加任何催化劑.將30g端羧基低聚乳酸溶解在200mL甲苯中,將30gn2HA納米粒子分散在溶液中,將懸浮液加熱到150恒溫反應10h,反應生成的水通過甲苯共沸除去.將產物離心分離,用氯仿超聲洗滌5次后于60真空干燥24h,得到表面接枝低聚乳酸的HA納米粒子(op2HA).其化學反應式如下:以丙交酯(LA)和乙交酯(GA)為單體,辛酸亞錫為催化劑,采用開環(huán)聚合法合成PLGAm(LA)m(GA)=82,其黏均分子量為85000.采用溶液法先將PLGA用氯仿溶解,再加入op2

10、HA(op2HA與PLGA質量比為19),超聲分散后在乙醇中沉降,真空干燥,制成op2HA/PLGA納米復合材料.將op2HA/PLGA納米復合材料和PLGA分別溶于氯仿,制成1%氯仿溶液,在已硅化的方形蓋玻片(214cm×214cm)上鋪膜,真空干燥48h后備用,并以未硅化的蓋玻片(Glass)為空白對照.1.3表征-1用傅里葉紅外光譜儀記錄FTIR光譜,KBr壓片,測定范圍4000400cm.用熱失重分析確定op2HA的有機分子接枝量,在空氣氣氛中分別將10mgHA和op2HA從50開始以10/min的速度升溫到800.將PLGA和op2HA/PLGA噴金處理后用ESEM觀察材料

11、的表面形貌和粒子的分散性.1.4生物相容性實驗1.4.1細胞培養(yǎng)將乳兔處死后消毒,在無菌條件下,取出顱骨,剪成2mm×2mm的骨塊,以間距約為5mm放在培養(yǎng)皿中,待骨塊與培養(yǎng)皿貼附后,輕輕地加入少量DMEM/F12培養(yǎng)液(含20%胎牛血清,10mmol/LHEPES,60mg/L青霉素和100mg/L鏈霉素,DMEM和F12體積比為11),放入37,CO2(體積分數(shù)5%)培養(yǎng)箱中培養(yǎng).第3天換培養(yǎng)液,去除多余的圓形血細胞,以后每3天更換1次培養(yǎng)液.原代培養(yǎng)至細胞長滿骨塊間隙后,吸出連同骨塊的培養(yǎng)液,用PBS液洗滌3次,加入0125%的胰蛋白酶消化并進行傳代.所用細胞為第三代兔成骨細胞

12、.1.4.2細胞黏附和擴展實驗將Glass,PLGA和op2HA/PLGA3種玻片放入6孔培養(yǎng)板中,UV照射4滅菌40min,在培養(yǎng)板中接種兔成骨細胞,密度為每孔5×10個,于37,5%CO2培養(yǎng)7d.隔日換© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. No.7于婷等:改性納米羥基磷灰石/PLGA復合材料的制備及生物活性1441液,用熒光倒置顯微鏡定期觀察細胞狀態(tài).在1,3和7d三個時間點用FITC進行熒光染色,數(shù)碼攝像系統(tǒng)拍攝細胞熒光照片,并用NIH

13、ImageJ軟件進行數(shù)據分析.1.4.3實時定量PCR檢測成骨活性基因的表達取培養(yǎng)7d的成骨細胞,用總RNA提取試劑盒提取RNA,再進行反轉錄得到cDNA.按照引物設計原則設計4種基因的引物.內參(GAPDH)上游引物:52GATGGTGAAGGTCGGAGTG23,下游引物:52TGTAGTGGAGGTCAATGAATGG23;型膠原蛋白(Collagen2)上游引物:52CTCGCTCACCACCTTCTC23,下游引物:52TAACCACTGCTCCACTCTG23;骨形態(tài)蛋白22(BMP22)上游引物:52GAAGCAAGGTGTCTCCAAG23,下游引物:52TCCGCTGTTTG

14、T2GTTTCG23;骨連接蛋白(Osteonectin)上游引物:52ACCGAAGAGGAAGTAGTGG23,下游引物:52AA2GAAGTGGCAGGAGGAG23.每個樣品取3個平行樣,用實時PCR進行擴增反應.反應條件為預變性溫度95,2min;解鏈溫度95,10s;退火溫度54,20s;延伸溫度72,10s.數(shù)據用MxPro軟件進行分析,以樣品的目的基因濃度除以內參基因的濃度,即為此樣品基因的相對含量.1.5材料的生物礦化分析及統(tǒng)計學分析取一組細胞培養(yǎng)7d后的PLGA和op2HA/PLGA玻片,用蒸餾水洗滌后真空干燥,采用ESEM和EDX分析材料表面的礦物質沉積情況和鈣磷元素含量

15、.采用SPSS12.0軟件,用方差分析進行處理,SD.2結果與討論2.1HA,、聚乙二醇和異氰酸酯等對HA粒子表面進行改性.由于HA,一般改性方法接枝到HA表面的有機物數(shù)量很少,且用作改性HA的有機分子往往有毒性,會引起生物體的不良反應.本文采用的op2HA是在甲苯共沸脫水條件下,將一定分子量的低聚乳酸與HA表面的鈣原子反應,得到了表面負載低聚乳酸的改性HA納米粒子(op2HA).HA表面的接枝反應和接枝率可通過紅外和熱失重(TGA)進行表征(圖1和圖2).Fig.1FTIRspectraofop2HA(a)andHA(b)Fig.2TGAcurvesofop2HA(a)andHA(b)-1圖

16、1為op2HA與HA的傅里葉紅外圖譜.從圖1可見,表面接枝低聚乳酸的op2HA在1760cm附近出現(xiàn)的吸收峰歸屬于接枝到HA表面上的低聚乳酸分子中的羰基的吸收峰.由此可以證實接枝反應產物op2HA的表面確實存在低聚乳酸分子.圖2為TGA熱失重曲線.從圖2可見,改性前的HA納米顆粒升溫后存在0182%左右的熱失重,可能是納米羥基磷灰石表面物理吸附的水;接枝改性后,出現(xiàn)了9112%的失重.通過氯仿反復洗滌可以除去未接枝的低聚乳酸,因此op2HA的熱失重主要是由于表面接枝的低聚乳酸熱裂解造成的.op2HA的接枝率=9112%-0182%=813%.2.2op2HA/PLGA的表面形貌及其細胞黏附、擴

17、展和增殖由圖3可見,與單純PLGA膜比較,op2HA/PLGA復合材料由于摻雜了改性后的HA納米粒子,使HA粒子較均勻地分布于材料表面,形成一定的粗糙度.有研究表明,一定粗糙度的表面可促進蛋白質8的吸附,從而提高材料對細胞的親和性.對材料的浸提液進行了系統(tǒng)的生物安全性評價,研究結果表明,op2HA/PLGA是一種無毒性的、7具有良好生物相容性的生物醫(yī)用材料.但該方法只能間接反映材料內的可溶性物質(溶劑、單體、催化劑、有毒重金屬等)或降解產物對細胞的毒性作用,無法體現(xiàn)材料真正的生物學性能.理想的支架材© 1994-2010 China Academic Journal Electron

18、ic Publishing House. All rights reserved. 1442高等學校化學學報Vol.30Fig.3ESEMimagesofthesurfacetopographyofPLGA(A)andop2HA/PLGA(B)料不僅要求對機體無毒性,而且要求細胞可在材料表面黏附、生長和增殖,即具有生物活性.因此,通過在材料表面接種細胞,評價細胞在材料表面的黏附和生長情況,可以反映細胞與材料界面直接接觸后的相互作用關系,可更真實地體現(xiàn)材料的生物學性能.圖4為成骨細胞的FITC熒光染色圖片.結果顯示,接種1d時,各組均有大量細胞貼壁,細胞略小呈圓形或梭形,而op2HA/PLGA組

19、的細胞數(shù)明顯多于PLGA組;3d時各組的貼壁細胞數(shù)量均明顯增Fig.4Micrographsofosteoblastsgrewonthesurfaceofglass(A)(C),PLGA(D)(F)andop2HAP/PLGA(G)(I)for1d,3d,7d,respectivelyFluorescentstainingwithFITC.多,胞體充分展開,轉變?yōu)槎嘟切?7d后可見細胞增殖顯著,細胞呈集落性生長;37d時,op2HA/PLGA和Glass組的細胞數(shù)量和細胞狀態(tài)均明顯優(yōu)于PLGA組.為確認不同材料界面的細胞黏附生長的差異,用NIHImageJ圖像分析軟件對上述圖像進行計算機細胞形

20、態(tài)定量分析,獲得細胞面積比(即細胞著色面積占圖片面積的百分數(shù)).細胞面積比是反映細胞在材料表面黏附和擴展的綜合評價指標.由圖Fig.5Areafractionofosteoblastsgrewonthesur25可見,隨著培養(yǎng)時間的延長,各組的細胞面積比faceofglass,PLGAandop2HA/PLGA© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. No.7于婷等:改性納米羥基磷灰石/PLGA復合材料的制備及生物活性1443均明顯增高;在培養(yǎng)的3個時間點,

21、op2HA/PLGA的細胞面積比均高于PLGA,而與Glass相近;培養(yǎng)7d時,op2HA/PLGA的細胞面積比明顯高于PLGA的,有顯著性差異(P<0105).這表明,op2HA/PLGA復合材料比PLGA更有利于成骨細胞的黏附、擴展和生長.其可能的機制是,op2HA/PLGA由于添加了改性后納米HA而增加了有利于成骨細胞生存的條件,如豐富的鈣磷元素和表面的粗糙性等.2.3材料對細胞的基因表達影響和生物礦化能力分析骨修復材料的生物活性還體現(xiàn)在材料對成骨細胞的骨基質合成、分泌和基質礦化的影響.成骨細胞在骨形成過程中主要經歷成骨細胞增殖、細胞外基質成熟、細胞外基質礦化和成骨細胞凋亡四個階段

22、,并與BMP22,Collagen2和Osteonectin等相關基因的表達和調控密切相關.BMP22的主要生物學作用是通過調節(jié)胰島素樣生長因子2(IGF2)和胰島素樣生長因子2(IGF2)而誘導成骨細胞形9成,促進成骨細胞的增殖.Osteonectin可促進細胞外基質的合成,增加骨基質沉積率.Collagen2是骨基質中的主要膠原類型,從增殖期開始表達,基質合成期達到高峰,是鈣鹽沉著和細胞附著的支架.因此,通過實時定量PCR分析成骨細胞在材料表面生長分化過程中的基因表達水平,有利于進一步探索材料的理化性質對成骨細胞影響的分子機制.由圖6可見,d后,op2HA/PLGFig.6Geneexpr

23、esssionofosteoblastsincubatedonctinCollagen2和thesurfaceofGlass,PLGAandop2HA/Osteonectin(P<0105).結果表明,PLGAat7dop2HA/PLGA復合材料由于摻入了具有生物活性的羥基磷灰石,在一定時期內提高了成骨細胞的相關基因表達水平.據此,我們推測該類材料的成骨活性主要通過影響和調控成骨基因的表達,從而促進成骨細胞的生長、分化和骨基質形成.圖7的掃描電鏡照片顯示,成骨細胞培養(yǎng)7d后的PLGA表面只有少量的沉積物,而op2HA/PLGA10Fig.7ESEMimagesofbiomineralde

24、positiononPLGA(A)andop2HA/PLGA(B)incubatedfor7d表面則出現(xiàn)大量的微米級聚集體,這些聚集體均由大量的短棒狀納米粒子構成.通過表面能譜分析結果表明,PLGA表面僅有少量鈣、磷元素,而op2HA/PLGA表面的鈣、磷含量明顯高于PLGA;同時,聚集體表面含有更加豐富的鈣、磷元素,表明為類磷灰石物質(見圖8).由此可以證明,PLGA摻雜了op2HA粒子后,可有效地促進材料對培養(yǎng)液中鈣、磷的沉積能力,誘導類磷灰石的形成,是一種良好的生物礦化材料.這種富含鈣磷的材料表面Fig.8EDXanalysisofPLGA(a),op2HA/PLGA(b)界面和類磷灰石

25、的形成,可進一步促進成骨細胞的andtheaggregatesonop2HA/PLGA(c)分化和骨基質形成,提高了材料的生物活性及其骨incubatedinvitrofor7d© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 1444高等學校化學學報Vol.30誘導能力.綜上所述,與已經應用于臨床的PLGA生物降解聚酯材料相比,通過摻入低聚乳酸接枝改性HA納米粒子所制備的op2HA/PLGA復合材料,其HA納米粒子可均勻地分散于PLGA中,形成富含鈣磷的粗糙表面,

26、有利于鈣磷沉積和成骨細胞的黏附、擴展和增殖,促進成骨細胞的BMP22,Collagen2和Osteonectin等基因的表達,很大程度上提高了材料的骨誘導活性和成骨能力,是一種較理想的骨修復納米復合生物活性材料.參考文獻1QUYang(屈陽),LIZhen2Sheng(李振聲),YANGBang2Cheng(楊邦成),etal.Chem.J.ChineseUniversities(高等學校化學學報)J,2007,28(7):128812912PistnerH.,BendixD.R.,MuhlingJ.,etal.BiomaterialsJ,1993,14:2912983LeGerosR.Z.C

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29、n,ZHANGPei2Biao1113,CHENXue2Si1(1.StateKeyLaboratoryofPolymerPhysicsandChemistry,ChangchunInstituteofAppliedChemistry,ChineseAcademyofSciences,Changchun130022,China;2.SchoolofPublicHealth,JilinUniversity,Changchun130021,China)AbstractThehydroxyapatite(HA)nanocrystalsof100200nminlengthand2030nminwidt

30、hwerehy2drothermallysynthesizedbythereactionofphosphoricacidandcalciumhydroxide.Lacticacidoligomersur2facegraftedHA(op2HA)nanoparticleswereobtainedbyoligomericlacticacidwithacertainmolecularweightgraftingontotheHAsurfacetoformaCacarboxylatebondintheabsenceofanycatalyst.Theop2HAwasfur2therblendedwithpoly(lactide2co2glycolide)(PLGA)topreparethenanocompositeofop2HA/PLGA.FTIR,TGA,ESEMandEDXwereusedtoanalyzegraftingr