項(xiàng)目實(shí)訓(xùn)手冊(cè)-項(xiàng)目7-三文魚中副溶血性弧菌檢驗(yàn)

1、農(nóng)產(chǎn)品微生物檢驗(yàn)技術(shù)課程實(shí)訓(xùn)指導(dǎo)手冊(cè)項(xiàng)目七 三文魚中副溶血性弧菌檢驗(yàn)（依據(jù)GB 4789.72013副溶血性弧菌檢驗(yàn)）一、實(shí)訓(xùn)目的掌握副溶血性弧菌的特征與生物學(xué)特性，副溶血性弧菌國(guó)標(biāo)檢驗(yàn)方法及檢驗(yàn)操作程序，明確副溶血性弧菌檢驗(yàn)操作要點(diǎn)，熟練使用干制生化鑒定試劑盒和API 20E試紙條進(jìn)行生化鑒定。二、實(shí)訓(xùn)原理采用選擇性培養(yǎng)基對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行增菌培養(yǎng)，然后生化鑒定進(jìn)行定性或定量檢驗(yàn)。對(duì)于農(nóng)產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢測(cè)主要是將培養(yǎng)分離后的菌落通過(guò)菌落形態(tài)觀察、菌體形態(tài)觀察、初步生化鑒定及確定生化鑒定實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒別和判定。三、實(shí)訓(xùn)要求本項(xiàng)目樣品中副溶血性弧菌檢驗(yàn)依據(jù)GB 4789.7-2013食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

2、 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)操作以及按照GB 29921-2013食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中致病菌限量進(jìn)行評(píng)價(jià)。本項(xiàng)目全面考察學(xué)生依據(jù)國(guó)標(biāo)對(duì)樣品中副溶血性弧菌進(jìn)行定性或定量檢驗(yàn)的能力，實(shí)施過(guò)程均可分成檢驗(yàn)準(zhǔn)備、檢驗(yàn)操作、結(jié)果與報(bào)告四個(gè)部分。定性與定量檢驗(yàn)的操作鑒定操作部分相同，均包括增菌、分離、純培養(yǎng)、初步鑒定、確定鑒定5個(gè)步驟。本項(xiàng)目按4人/組為單位進(jìn)行操作，要求在實(shí)驗(yàn)室完整進(jìn)行樣品中副溶血性弧菌的檢驗(yàn)。四、實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備 1 試劑和溶液2.1選擇性增菌試劑3氯化鈉堿性蛋白胨水；2.2分離平板硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂平板、弧菌顯色培養(yǎng)基；注意：這兩種選擇

3、性培養(yǎng)基均不可過(guò)度加熱；使用前一天配制，且在48h內(nèi)使用；傾注平板前需搖勻；不能反復(fù)溶解，平板需避光保存于室溫環(huán)境；2.3純化平板3氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂；2.4初步鑒定生化試劑氧化酶試劑、革蘭氏染色液、3氯化鈉三糖鐵（TSI）瓊脂斜面、3%氯化鈉半固體培養(yǎng)基、嗜鹽性試驗(yàn)培養(yǎng)基；2.5確定鑒定生化試劑3氯化鈉甘露醇試驗(yàn)培養(yǎng)基、3氯化鈉賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基、3氯化鈉MR-VP培養(yǎng)基、Voges-Proskauer（V-P）試劑、3氯化鈉溶液、ONPG試劑；2.6系統(tǒng)生化鑒定試劑副溶血性弧菌干制生化鑒定試劑盒（包括3%氯化鈉三糖鐵（TSI）、3%氯化鈉半固體、葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、無(wú)鹽胨水

4、、6%鹽胨水、8%鹽胨水、10%鹽胨水、氨基酸對(duì)照、賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸、精氨酸、V-P、ONPG及輔助試劑（無(wú)菌石蠟、V-P甲、乙液試劑、糖發(fā)酵添加劑）、API20E生化鑒定試劑條及其輔助試劑（無(wú)菌石蠟、TDA試劑、JAMES試劑、V-P甲、乙液試劑）2 儀器和設(shè)備2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)備天平、均質(zhì)器、超凈工作臺(tái)、生物安全柜、顯微鏡、恒溫恒濕培養(yǎng)箱；2.2實(shí)驗(yàn)用具無(wú)菌吸管、微量移液器及吸頭、無(wú)菌手術(shù)剪、鑷子、接種環(huán)。五、實(shí)訓(xùn)任務(wù)（包含結(jié)果計(jì)算）定性檢驗(yàn)1、樣品制備在無(wú)菌室內(nèi)，以75%酒精擦拭外包裝，尤其是包裝開(kāi)口處，用無(wú)菌剪刀在樣品封口處剪開(kāi)外包裝，換一個(gè)無(wú)菌剪刀，將三文魚樣品剪碎至無(wú)菌罐中，用無(wú)菌鑷子夾取

5、并稱取25 g樣品至盛有3%氯化鈉堿性蛋白胨水225 mL中，轉(zhuǎn)入注明樣品信息、檢測(cè)人員以及檢測(cè)日期的均質(zhì)袋中，密封，用拍擊式均質(zhì)器拍擊2 min。若樣品為液態(tài)，不需均質(zhì)，振蕩混勻即可；魚類和頭足類動(dòng)物取表面組織、腸或鰓；貝類取全部?jī)?nèi)容物，包括貝肉和體液；甲殼類取整個(gè)動(dòng)物，或者動(dòng)物的中心部分，包括腸和鰓；如為帶殼貝類或甲殼類，則應(yīng)先在自來(lái)水中洗刷外殼并甩干表面水分，然后以無(wú)菌操作打開(kāi)外殼，按上述要求取相應(yīng)部分；3%氯化鈉堿性蛋白胨水為選擇性增菌液，其高濃度鹽含量可抑制除嗜鹽微生物外的其他微生物生長(zhǎng)。均質(zhì)完畢的樣品通過(guò)傳遞窗出無(wú)菌室，清理無(wú)菌室，打開(kāi)無(wú)菌室紫外燈，輻照滅菌30 min。非冷凍樣品

6、采集后應(yīng)立即置7 10 冰箱保存，盡可能及早檢驗(yàn)；冷凍樣品應(yīng)在45 以下不超過(guò)15 min或在2 5 不超過(guò)18 h解凍。將上述均質(zhì)完成的檢測(cè)樣品置于預(yù)先設(shè)置36 的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h18 h。2、分離病原微生物分離鑒定工作應(yīng)在BSL-2實(shí)驗(yàn)室生物安全柜中進(jìn)行。用接種環(huán)在距離增菌液液面以下1 cm 內(nèi)沾取一環(huán)增菌液，分別劃線接種TCBS瓊脂平板或弧菌顯色培養(yǎng)基平板上。本片將分別演示這兩種平板的分離現(xiàn)象。接種完成后，置于36 的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18 h24 h，待觀察。副溶血型弧菌在TCBS瓊脂平板上培養(yǎng)一般不超過(guò)24 h，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，一些非目標(biāo)菌（如霍亂）代謝產(chǎn)生的酸會(huì)不斷

7、揮發(fā)，同時(shí)代謝蛋白胨產(chǎn)生一定的堿性物質(zhì)，兩者綜合導(dǎo)致菌落由黃色逐漸向藍(lán)綠色轉(zhuǎn)變，從而引起誤判現(xiàn)象。所以應(yīng)盡快（不超過(guò)1h）挑取菌落或作標(biāo)記；副溶血性弧菌在各分離平板上的菌落特征如下:TCBS瓊脂平板上呈圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落，用接種環(huán)輕觸，有類似口香糖的質(zhì)感，直徑2 mm3 mm；弧菌顯色培養(yǎng)基上的特征按照產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行判定，使用法國(guó)科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基，現(xiàn)象為紫紅色。3、純培養(yǎng)用接種環(huán)挑取TCBS瓊脂平板或弧菌顯色培養(yǎng)平板上3個(gè)或以上可疑菌落劃線接種于3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板。挑取可疑菌落時(shí)可以選擇其中一種平板上的菌落，也可以兩種都挑取。置于36 的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18

8、h24 h，待后續(xù)鑒定實(shí)驗(yàn)。4、初步鑒定副溶血性弧菌的初步鑒定包括氧化酶試驗(yàn)、革蘭氏染色試驗(yàn)、三糖鐵（TSI）試驗(yàn)、動(dòng)力試驗(yàn)以及嗜鹽性試驗(yàn)。氧化酶試驗(yàn)：用接種環(huán)（或一次性接種環(huán)）挑取純培養(yǎng)單菌落于氧化酶安瓿瓶中，在1 min內(nèi)觀察現(xiàn)象，不變色者為陰性，呈現(xiàn)紫色為陽(yáng)性。革蘭氏染色試驗(yàn)：取潔凈載玻片，于其上滴加一滴生理鹽水，用接種環(huán)將可疑菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察形態(tài)。副溶血性弧菌為革蘭氏陰性，呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態(tài)，無(wú)芽胞，有鞭毛。三糖鐵（TSI）試驗(yàn)：用接種環(huán)挑取純培養(yǎng)的單菌落，轉(zhuǎn)種3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面，先在斜面劃線，再于底層穿刺，置于36 的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀

9、察結(jié)果。本片三糖鐵（TSI）試驗(yàn)結(jié)果為：底層變黃不變黑，無(wú)氣泡，斜面顏色不變或紅色加深。三糖鐵培養(yǎng)基含有葡萄糖、蔗糖和乳糖等三種可發(fā)酵的碳源，這些碳源被菌體利用產(chǎn)酸，可使酚紅指示劑變色。某些菌能還原Na2S2O3產(chǎn)生H2S，與硫酸亞鐵銨反應(yīng)生成黑色的FeS，而使培養(yǎng)基變黑。動(dòng)力試驗(yàn)：用接種針挑取純培養(yǎng)單菌落，穿刺半固體動(dòng)力培養(yǎng)基，置于36 的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。本片動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果為：沿動(dòng)力培養(yǎng)基中穿刺線擴(kuò)散生長(zhǎng)，有動(dòng)力；嗜鹽性試驗(yàn)：用接種環(huán)挑取純培養(yǎng)的單菌落，分別接種 0%、6%、8%和10%不同氯化鈉濃度的胰胨水，置于36 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察液體混濁情況。本片嗜鹽

10、性試驗(yàn)結(jié)果為：待檢菌在無(wú)氯化鈉和10%氯化鈉的胰胨水中不生長(zhǎng)或微弱生長(zhǎng)，在6%氯化鈉和 8%氯化鈉的胰胨水中生長(zhǎng)旺盛。根據(jù)以上初步鑒定結(jié)果可初步判斷為可疑副溶血性弧菌屬，需進(jìn)一步做生化鑒定。5、確定鑒定檢測(cè)工作中，由于副溶血性弧菌與其他弧菌生化性狀相似，且易存在個(gè)別變體，可根據(jù)初步鑒定結(jié)果，從3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上挑取可疑菌落，用生理鹽水制備成濁度適當(dāng)?shù)木鷳乙?，使用生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行確定鑒定。1） 干制生化鑒定試劑盒采用某品牌干制生化鑒定試劑盒，該試劑盒包括三糖鐵、半固體、鹽胨水、葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、賴氨酸脫羧酶及其對(duì)照、鳥(niǎo)氨酸及其對(duì)照、精氨酸及其對(duì)

11、照、V-P、ONPG共12項(xiàng)生化試驗(yàn)試劑，通過(guò)接種可疑菌落懸濁液培養(yǎng)一定時(shí)間后，觀察生化現(xiàn)象，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)判定鑒定結(jié)果。另外，由于生化鑒定試劑盒不包括氧化酶試驗(yàn)，且試劑盒中的適配三糖鐵與動(dòng)力試驗(yàn)現(xiàn)象不明顯，一般將這三個(gè)試驗(yàn)單獨(dú)操作，其他生化指標(biāo)采用生化鑒定試劑盒完成。按照產(chǎn)品說(shuō)明書操作，主要操作步驟如下：a) 第一步：從鋁箔袋中取出試劑盒，打開(kāi)盒蓋；b) 第二步：用接種針從平板上挑取新鮮培養(yǎng)的適量單菌落接至適量無(wú)菌水中，與試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)比濁管進(jìn)行比對(duì)，制成0.5麥?zhǔn)暇鷳乙海⒁饩鷳乙簼舛炔灰诉^(guò)大，否則可能產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果；c) 第三步：用一次性滴管分別滴加一滴糖發(fā)酵添加劑于葡萄糖、蔗糖、乳糖三個(gè)帶有

12、“”試驗(yàn)孔中；d) 第四部：在所有的生化項(xiàng)目孔中加入0.2 mL制備的菌懸液；e) 第五步：在氨基酸對(duì)照、賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸和精氨酸中滴加2滴礦物油覆蓋培養(yǎng)基表面，蓋上盒蓋；f) 第六步：與三糖鐵、動(dòng)力生化管一同置于36 的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，其中ONPG實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)1-3h觀察結(jié)果，如為陰性繼續(xù)培養(yǎng)至24h觀察結(jié)果；g) 第七步：培養(yǎng)后，在VP試驗(yàn)孔中滴加VP甲液3滴，乙液1滴，10-30min內(nèi)觀察結(jié)果。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察如下：蔗糖藍(lán)綠色為陰性、葡萄糖黃色為陽(yáng)性、甘露醇黃色為陽(yáng)性、分解葡萄糖產(chǎn)氣陰性、乳糖藍(lán)綠色為陰性、硫化氫陰性、賴氨酸脫羧酶和鳥(niǎo)氨酸對(duì)照管黃色，試驗(yàn)管紫色為陽(yáng)性、精氨酸對(duì)照

13、管和試驗(yàn)管都黃色為陰性，V-P不變色為陰性、ONPG無(wú)色為陰性。判定：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)描述本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為典型反應(yīng)，判定為副溶血性弧菌。2） API 20E生化鑒定試劑條副溶血性弧菌與其他弧菌生化性狀相似，且易存在個(gè)別變體，實(shí)際檢測(cè)工作中常使用能夠通過(guò)查取編碼表或軟件判讀方式的法國(guó)梅里埃公司API 20E生化鑒定試劑條進(jìn)行生化鑒定，以保證副溶血性弧菌檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性。API 20E試劑條根據(jù)快速酶促反應(yīng)及代謝產(chǎn)物的檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的一種細(xì)菌編碼鑒定法，廣泛應(yīng)用于臨床、食品中革蘭氏陰性桿菌的快速鑒定。由于該試劑條判定結(jié)果時(shí)需結(jié)合氧化酶實(shí)驗(yàn)，而試劑條中無(wú)該反應(yīng)孔，故需補(bǔ)做氧化酶實(shí)驗(yàn)。按照產(chǎn)品說(shuō)明書，操作步驟如下：a)

14、 第一步：打開(kāi)梅里埃3 mL 0.85%NaCl安瓿瓶，從分離平板上挑取適量單個(gè)分純菌落至該培養(yǎng)基，仔細(xì)研勻，制成0.5麥?zhǔn)仙锞鷳乙?；b) 第二步：用吸管將菌懸液加入到試條的小管內(nèi)（為避免在小管基底部形成氣泡，將試條輕微向前傾斜，并將吸管緊靠小杯邊緣加入菌液），在CTT、VP、GEL小管（帶有“”實(shí)驗(yàn)孔中），菌液需充滿底部和杯部，其他管僅充滿管部（不是杯部）；c) 第三步：在實(shí)驗(yàn)ADH、LDC、ODC、H2S和URE小杯內(nèi)（帶有“ ”實(shí)驗(yàn)孔中）加入礦物油以形成厭氧環(huán)境；d) 第四步：蓋上培養(yǎng)盒，于36 的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24 h；e) 第五步：進(jìn)行氧化酶實(shí)驗(yàn)，用一次性接種環(huán)挑取至單

15、菌落氧化酶試劑中，在1分鐘內(nèi)菌落不變色者為陰性，呈現(xiàn)紫色為陽(yáng)性，本實(shí)驗(yàn)菌落不變色，氧化酶實(shí)驗(yàn)為陰性。進(jìn)行結(jié)果觀察與判讀：a) 在TDA反應(yīng)孔中滴加1滴TDA試劑，即刻觀察結(jié)果；b) 在IND反應(yīng)孔中滴加1滴JAMES試劑，即刻觀察結(jié)果；c) 在VP反應(yīng)孔中滴加1滴VP1和VP2試劑，等待10分鐘觀察結(jié)果；d) 觀察其他反應(yīng)孔的顏色變化，判讀結(jié)果，記錄在試劑盒提供的結(jié)果報(bào)告單上，每3個(gè)試驗(yàn)為一組，每個(gè)陽(yáng)性試驗(yàn)分別賦予數(shù)值1,2,4，在每組中陽(yáng)性反應(yīng)以相應(yīng)的數(shù)值相加。由此可得到7位數(shù)字的編碼，氧化酶反應(yīng)構(gòu)成第21個(gè)試驗(yàn)。 獲得編碼后可根據(jù)鑒定檢索手冊(cè)，從中查找數(shù)值編碼，也可根據(jù)APIweb TMM

16、或ATBTM new鑒定軟件得到鑒定結(jié)果。判定：通過(guò)ATBTM new鑒定軟件，鑒定結(jié)果。如下圖，副溶血性弧菌API 20E檢驗(yàn)為極好的鑒定，%ID99.9，T值1.0。另外，在副溶血性弧菌鑒定還可以進(jìn)行血清學(xué)分型以及檢測(cè)致病性的神奈川（kanagawa）試驗(yàn)。副溶血性弧菌有845個(gè)血清型，主要通過(guò)十三種耐熱的菌體抗原（即O抗原）鑒定，而七種不耐熱的包膜抗原（即K抗原）可以用來(lái)輔助鑒定。其致病力可用神奈川（kanagawa）試驗(yàn)來(lái)區(qū)分。副溶血性弧菌能使人或家兔的紅細(xì)胞發(fā)生溶血，在瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)溶血帶，稱為“神奈川試驗(yàn)”陽(yáng)性。6、結(jié)果與報(bào)告綜合以上初步生化與確定生化鑒定結(jié)果，報(bào)告25 g（mL

17、）樣品中檢出或未檢出副溶血性弧菌。本實(shí)驗(yàn)分離平板上菌落特征典型，生化鑒定為可疑副溶血性弧菌，報(bào)告25 g樣品檢出。填寫原始記錄單和報(bào)告。注意：檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告后，被檢樣品方能處理。檢出致病菌的樣品要經(jīng)過(guò)無(wú)害化處理。定量檢驗(yàn)副溶血性弧菌定量檢驗(yàn)與定性檢驗(yàn)相比，在進(jìn)行增菌時(shí)主要增加了一步接種至適宜3個(gè)連續(xù)稀釋度3%氯化鈉堿性蛋白胨水試管（每個(gè)稀釋度接種3管）步驟，其后的分離、純化及鑒定程序與定性檢驗(yàn)完全一致，最后根據(jù)9支稀釋試管中副溶血性弧菌陽(yáng)性管數(shù)，查最可能數(shù)（MPN）檢索表進(jìn)行樣品中副溶血性弧菌數(shù)量報(bào)告。檢驗(yàn)操作：a） 編號(hào)：用記號(hào)筆在盛有生理鹽水的樣品均質(zhì)袋中和無(wú)菌試管上作稀釋度標(biāo)記，分離純化和

18、鑒定用的平皿均需編號(hào)清晰，編號(hào)內(nèi)容包括樣品稀釋度、平板名稱、接種物名稱、實(shí)驗(yàn)時(shí)間、操作人員等；b） 稀釋：用移液器吸取1:10 樣品勻液1 mL，注入含有9 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水的試管內(nèi)，振搖試管混勻，制備1:100的樣品勻液，更換吸頭，按上述操作程序，依次制備10倍系列稀釋樣品勻液，每遞增稀釋一次，換用一支無(wú)菌吸頭；c） 選擇稀釋度：根據(jù)對(duì)檢樣污染情況的估計(jì)，選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種 3 支含有 9 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水的試管，每管接種 1 mL，本次實(shí)驗(yàn)選擇1:10、1:100、1:1000三個(gè)濃度樣品勻液；d） 增菌培養(yǎng)：將接種完成的三個(gè)濃度梯度的9支試管，置 36 培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng) 8 h18 h；e） 分離：增菌完成后，觀察9支試管，其中增菌液渾濁為疑似陽(yáng)性管，本次實(shí)驗(yàn)1:10稀釋度有3支增菌液渾濁，顯示生長(zhǎng)、1:100稀釋度有1支顯示生長(zhǎng)、1:1000無(wú)顯示生長(zhǎng)。將所有顯示生長(zhǎng)的增菌液，劃線TCBS顯色培養(yǎng)基平板，一支試管劃線一塊平板，置于36 培養(yǎng)箱培養(yǎng)1824 h。后續(xù)鑒定步驟同定性檢驗(yàn)。 f） 查表判定：根據(jù)初步鑒定與確定鑒定，確定疑似陽(yáng)性管中的陽(yáng)性管數(shù)，查最可能數(shù)（MPN）檢索表，報(bào)告每g（mL）副溶血性弧菌的MPN值。六、原始數(shù)據(jù)記錄表副溶血性弧菌檢驗(yàn)原始記錄樣品編號(hào)樣品名稱檢測(cè)地點(diǎn)302微生物室檢驗(yàn)方法 GB 4789