雷公藤內(nèi)酯醇對類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞IL18及其受體表達的

1、雷公藤內(nèi)酯醇對類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞IL18及其受體表達的                             作者：毛曉丹, 孫賽君, 裴紫燕, 張立煌【摘要】  目的: 研究雷公藤內(nèi)酯醇(TP)對佛波酯(PMA)刺激的關節(jié)滑膜成纖維細胞(RASF) 白細胞介素18(IL18)及其受體（IL18R）

2、表達的影響, 并對其機制進行探討。方法: RASF先用TP(0100 g/L) 預處理2 h, 再用PMA (50 g/L)刺激。收集上清用 ELISA 法檢測上清IL18水平。利用人IL18能特異誘導人髓系單核細胞KG1產(chǎn)生IFN的特性檢測上清中IL18生物學活性。收集處理的RASF, 用Western blot 和熒光定量RTPCR檢測IL18和IL18R的蛋白和mRNA表達。NFB的活性用類ELISA法檢測。 結(jié)果: TP能有效抑制PMA刺激的RASF的IL18生物學活性。TP能夠抑制PMA刺激的RASF的IL18和IL18R的蛋白和mRNA表達。TP還抑制PMA刺激的RASF 的NFB

3、 活性。TP對PMA刺激的RASF 的抑制效應呈劑量相關性。結(jié)論: TP能有效抑制PMA刺激的RASF 的IL18和IL18R的表達。這些結(jié)果說明了TP對RA作用的機制。 【關鍵詞】  雷公藤內(nèi)酯醇; 類風濕關節(jié)炎; IL18; IL18R    Abstract  AIM:  To determine the effects of triptolide (TP) on the expression of interleukin18 (IL18) and its receptor in phorbol 12myristate 13ac

4、etate (PMA)stimulated rheumatoid arthritis synovial fibroblasts (RASF). METHODS:   RASF were pretreated with TP (0-100 g/L) for 2 h before stimulation with PMA (50 g/L). The bioactivity of IL18 in the supernatant was detected based on IFN secretion from IL18responding human myelomonocytic

5、KG1 cells. IL18 level was analyzed by ELISA. To estimate the protein and mRNA expression of IL18 and IL18R in RASF,  Western blot and quantitative RTPCR were performed. Nuclear factorB (NFB) activity in the wholecell extract of treated RASF was also measured using an ELISAbased method. RESULTS:

6、   TP effectively inhibited the bioactivity of IL18 in PMAstimulated RASF. The expression of IL18 and IL18R at protein and gene levels was reduced by TP. NFB activity in PMAstimulated RASF was profoundly suppressed by TP. These effects showed a high correlation with TP concentration (0-100

7、 g/L). CONCLUSION:  TP effectively inhibited the expression of IL18 and its receptor in PMAstimulated RASF. These results suggest a mechanism of TP in RA therapy.    Keywordstriptolide;  rheumatoid arthritis;  interleukin18;  interleukin18 receptor類風濕關節(jié)炎(rheumatoid

8、 arthritis, RA)是一個自身免疫性疾病, 主要表現(xiàn)為滑膜成纖維細胞的大量增生和炎性細胞浸潤的多關節(jié)滑膜組織的慢性炎癥。RA患者關節(jié)滑膜組織過度表達IL18、 TNF、 IL1等炎癥細胞因子1, 進而激活關節(jié)滑膜成纖維細胞NFkB的活性, 促進COX2、 iNOS的大量表達, 迅速大量合成PGE2、 NO, 導致關節(jié)滑膜炎癥、 腫脹、 增生、 滑膜血管翳大量生成, 最終導致關節(jié)退變, 此為RA重要的發(fā)病機制之一2。IL18在RA發(fā)生中起到重要作用3, 下調(diào)IL18的活性是治療RA的一個潛在策略。    雷公藤為傳統(tǒng)中藥, 具有明顯的抗炎、 抗風濕及免疫抑

9、制作用4。雷公藤內(nèi)酯醇（Triptolide, TP）是中藥雷公藤的有效單體成分5, 其抗RA機制主要為抑制機體的免疫反應, 下調(diào)Th1類細胞及細胞因子的活性, 進而抑制炎癥因子及炎癥介質(zhì)的表達。隨著細胞及分子生物學研究的深入, TP抗炎及抗RA的分子機制也得到進一步的認識。我們研究TP對PMA刺激的RASF IL18及其受體（IL18R）表達的影響, 并對其機制進行探討, 為TP抗RA治療提供新的理論和實驗依據(jù)。    1  材料和方法    1.1  類風濕關節(jié)滑膜成纖維細胞（RASF）的分離和培養(yǎng) 

10、 關節(jié)滑膜組織取材于浙江大學醫(yī)學院附屬骨科, 行膝關節(jié)置換或滑膜切除術的5例類風濕性關節(jié)炎患者, 均符合1987年美國風濕病協(xié)會修訂的類風濕關節(jié)炎診斷標準。無菌條件下剪碎滑膜組織, 用含4.0 g/L膠原酶（Sigma）的RPMI1640培養(yǎng)液（Gibco）, 于37、  50 mL/L CO2培養(yǎng)箱孵育消化4 h, 離心收集細胞, 加含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液, 于37、 50 mL/L CO2孵育箱中培養(yǎng), 使細胞貼壁。棄除未貼壁的細胞, 繼續(xù)培養(yǎng)18 h, 貼壁細胞用DHanks徹底沖洗后, 用含2.5 g/L胰酶的消化液（Gibco）消化收集貼壁的滑膜

11、成纖維細胞傳代培養(yǎng)。經(jīng)34次傳代后, 用流式細胞術鑒定細胞純度達98%以上CD3、 CD20、 CD68、 Von Willibrand factor (第8因子相關抗原)陽性細胞1%。    1.2  實驗分組及滑膜成纖維細胞的處理  將滑膜成纖維細胞1×106/孔接種于6孔板（Falcon）中, 待細胞完全貼壁后棄上清, 用含不同濃度雷公藤內(nèi)酯醇（TP, 0100 g/L）的培養(yǎng)液預處理2 h, 然后加佛波酯（PMA, 50 g/L, Sigma）刺激, 繼續(xù)培養(yǎng)18 h。收集各組細胞培養(yǎng)上清液及細胞, 備檢。 

12、0;  1.3  IL18的生物活性檢測  利用人IL18能特異誘導人髓系單核細胞KG1（引自美國ATCC, CCL246, 由本所常規(guī)傳代保存）產(chǎn)生IFN的特性, 通過ELISA法檢測培養(yǎng)上清液IFN的水平（hIFN ELISA Kit, 美國R&D Systems）, 結(jié)果以IFN濃度反映被測樣品中IL18的生物活性。按Yamamura等6方法操作。所有檢測樣品均用鼠抗人IL18單克隆抗體（D0443, 美國R&D Systems）中和后作對照（抗體終濃度2 mg/L, 37作用1 h）, 以示其特異性。    1

13、.4  雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測  采用ELISA法, 檢測培養(yǎng)上清液IL18（hIL18 ELISA Kit,  MBL Japan）的水平。操作嚴格按說明進行。最后于全自動酶標儀（BioTek Elx800, 美國）讀取A450值, 根據(jù)標準反應曲線求得樣品IL18的水平。    1.5  細胞蛋白提取及Western blot檢測  收集細胞, 加細胞裂解液Lysis Buffer,  20 mmol/L TrisHCl (pH7.5),  150 mmol/L NaC

14、l,  1 mmol/L Na2EDTA,  1 mmol/L EGTA,  10 mL/L Triton,  10 mL/L NP40,  2.5 mmol/L Sodium pyrophosphate,  1 mmol/L glycerophosphate,  1 mmol/L  Leupeptin,  1 mmol/L PMSF, 冰浴30 min后于10 000 r/min離心3 min, 收集離心上清液, 于蛋白分析儀（Beckman DU640）上測定各樣品蛋白含量（Bradford比色法,

15、美國Pierce公司）。取40  g蛋白樣品加上樣緩沖液煮沸變性后, 進行100 g/L SDSPAGE, 并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（0.45 m, ImmobilonP, Millipore）, 于封閉液（含50 g/L脫脂奶粉, 20 g/L BSA, 0.5 mL/L Tween20的PBS）室溫封閉2 h, 分別加入抗人IL18、 抗人IL18R（1500,  R&D System）或抗人Actin抗體（12 000,  Santa Cruz）, 于雜交爐（Hybaid）中室溫滾動反應2 h; 洗膜5 min×3次, 加相應的辣根過氧化物酶（

16、HRP）標記的二抗(15 000,  Santa Cruz), 室溫反應2 h; 充分洗膜后作ECL化學發(fā)光（SuperSignal West Dura Kit,  Pierce）, X片（Kodak）曝光顯影。    1.6  熒光定量RTPCR檢測  收集各組滑膜細胞, 用TRIzol（美國Gibco公司）常規(guī)提取總RNA, 溶于50 L DEPC處理水, 經(jīng)核酸蛋白紫外分析儀（Beckman DU640）檢測, 260/280比值為1.751.80。取1 g總RNA于42逆轉(zhuǎn)錄（SuperScript II Rever

17、se Transcriptase, Invitrogen）50 min后, 以肌動蛋白（actin）作為內(nèi)對照, 進行熒光定量PCR（LightCycler FastStart SYBR Green I Master, Roche）檢測IL18及IL18R mRNA表達水平。IL18引物（擴增產(chǎn)物480 bp）上游: 5TTC GGG AAG AGG AAA GGA AC3, 下游: 5AAG GAT ACA AAA AGT GAC AT3; IL18R引物（擴增產(chǎn)物419 bp）上游: 5CCC AAC GAT AAA GAA GAA CGC C3, 下游: 5TGT CTG TGC CTC

18、 CCG TGC TGG C3; actin引物（擴增產(chǎn)物619 bp）上游: 5CGC TGC GCT GGT CGT CGA CA3, 下游: 5GTC ACG CAC GAT TTC CCG CT3。每個LightCycler PCR（15 L）反應體系為: 1.5 L LightCycler FastStart DNA Master Mix, 1.8 L MgCl2（25 mmol/L）, 0.4 L of each primer（10 mol/L）, 2 L經(jīng)10倍稀釋的cDNA, 9.3 L H2O。PCR程序為95預變性10 min; 94變性10 s, 65復性15 s, 72

19、延伸15 s, 擴增50個循環(huán); PCR產(chǎn)物95變性1 min后迅速降溫至55維持30 s, 緩慢升溫（0.1  steps）至95, 收集熒光信號, 熔解曲線分析。結(jié)果以目的基因與相應的actin比值表示。反應結(jié)束后, 取5 L PCR產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠（15 g/L）電泳檢測。    1.7  NFB p65活性檢測  用NFB p65轉(zhuǎn)錄因子試劑盒(Active Motif,  CA,  USA)檢測NFB活性,  細胞蛋白抽提液 (5 g/孔) 加入包被有NFB 特異性寡核苷酸探針的96孔板中, 再

20、依次加入能特異性結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的一抗和相應的辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗進行孵育, 每步均洗板3次, 最后加入TMB底物液顯色, 顯色終止后于全自動酶標儀(Biotek ELX800)讀取A450值。以 A450值表示NFB活性。    1.8  統(tǒng)計學分析  結(jié)果以x±s表示, 各組間比較采用非配對資料的t檢驗, P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。1             2  結(jié)果  

21、;  2.1  培養(yǎng)上清液IL18的水平及生物活性  PMA能明顯誘導RASF IL18的表達, 而TP（50 g/L）能顯著抑制PMA刺激的RASF IL18的表達及其生物活性（表1）。表1  培養(yǎng)上清液IL18的水平及生物活性    2.2  TP抑制RASF IL18及IL18R的表達  Western blot結(jié)果（圖1）顯示, TP能不同程度地抑制PMA刺激的RASF IL18及其受體的蛋白表達, 抑制作用與TP濃度呈劑量相關。結(jié)果也顯示, TP對IL18（50 g/L）的抑制作用明顯高于對IL

22、18R（100 g/L）的抑制作用。    2.3  TP抑制RASF IL18及IL18R的基因表達  用LightCycler 熒光定量PCR檢測, 50 g/L的TP即能明顯抑制PMA誘導的RASF  IL18 mRNA的表達, 而對IL18R基因表達的抑制作用則為100 g/L（圖2）。    2.4  TP 抑制RASF NFB活性  NFB 活性檢測結(jié)果(圖3)顯示, TP 能有效抑制PMA刺激的 RASF NFB活性, 其抑制效應和TP濃度正相關。3  討論&#

23、160;   IL18在RA的發(fā)生和進展中起到關鍵的作用。IL18R表達在Th1細胞表面。IL18在Th1型免疫反應中誘導巨噬細胞分泌單核因子。 活化的巨噬細胞誘導局部的炎癥反應, 產(chǎn)生 IL1、  TNF和 MMPs。此外, 在RA患者IL18促使NO生成, 介導IFN的分泌, 還能促使血管增生6。成熟的IL18的活性和IL1密切相關。 IL18誘導 Th1型 淋巴細胞分泌 IFN和表達Fas/FasL, 促使 T 細胞 和NK細胞增殖。 IL18的生物學活性評價可通過檢測 IFN 分泌。 研究發(fā)現(xiàn) TP 有效抑制 IL18 和 IFN表達。在炎癥反應和自身免疫

24、性疾病中IFN 是一個主要的促炎因子。 IFN 通過誘導最初的 iNOS 和 之后NO產(chǎn)生而發(fā)揮作用。 TP減少了IL18的表達, 從而間接減少 IFN分泌 和 NO生成。    過度表達的IL18 誘導 Th1分泌大量IFN 和促使 Th1的分化, 打破了 Th1/Th2的平衡, 使RA惡性進展。 研究表明TP能抑制 IL18 表達, 維持Th1/Th2的平衡從而減輕RA的炎癥狀態(tài)。    研究顯示TP對IL18和IL18R的抑制程度可能有所不同。Western blot和熒光定量 RTPCR 顯示TP在蛋白水平和基因水平都能抑制I

25、L18和IL18R的表達, 而TP對IL18的抑制效應更為明顯。這些結(jié)果提示IL18可能是TP主要靶點。當IL18表達受到抑制的時候, IL18R反饋性的減少。    NFB 是一個調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)表達的重要的轉(zhuǎn)錄因子。Han等7報道在RA患者 NFB的表達增加, 活性增強。活化的 NFB使許多基因轉(zhuǎn)錄增強, 包括IL1、 TNF、 IL6、 IL8、  GMCSF和COX2。而且, 過度表達的炎性因子如TNF和 IL1又誘導NFB 的活化。這就形成了一個正反饋系統(tǒng), 促進RA病情進展8。研究結(jié)果顯示TP能顯著抑制NFB的活性, 并且呈劑量相關性。 所以NF

26、B 通路可以作為RA的又一個靶點。IL18的信號轉(zhuǎn)導主要通過NFB信號通路。 IL18通過依靠JNK、 p38 MAPK、  PI3K和NFB促進了關節(jié)滑膜成纖維細胞產(chǎn)生血管生成因子。IL18主要通過IL18R復合物起作用。 IL18R復合物由一條結(jié)合鏈IL18R和一條信號鏈組成。 IL18R是IL1受體家族成員, 是IL1受體相關蛋白(IL1Rrp)。 IL18R復合物招募IL1R激活激酶(IRAK)和TNF 受體相關因子6 (TRAF6), 使 NFB誘導激酶磷酸化, 最后導致NFB的活化。Sylvester等9報道TP通過抑制NFB的活性抑制關節(jié)軟骨細胞MMP基因的表達。TP能

27、夠有效的抑制PMA 作用的RASF表達IL18、 IL18R和 NFB, 所以推測 TP 對 IL18和IL18R的抑制效應同NFB活性相關。    總之, TP在蛋白和基因兩個水平抑制IL18和IL18R的表達, 從而抑制 NFB 的活性, 使IFN、 NO和血管生成減少。TP也能維持RA患者Th1/Th2的平衡。已經(jīng)有報道IL18單克隆抗體、  可溶性IL18受體(IL18R)和IL18結(jié)合蛋白 (IL18BP)用于RA的治療。因此, TP 和這些IL18抑制分子共同作用抑制IL18和IL18R將有望應用于臨床RA的治療。【】  1 Siv

28、alingam SP, Thumboo J, Vasoo S, et al. In vivo proand antiinflammatory cytokines in normal and patients with rheumatoid arthritisJ. Ann Acad Med Singapore, 2007, 36(2): 96-99.2 Koch AE. Angiogenesis as a target in rheumatoid arthritisJ. Ann Rheum Dis, 2003, 62(Suppl 2): 60-67.3 Dai SM, Nishioka K, Yudoh K. Interleu