連接蛋白43磷酸化狀態(tài)與縫隙連接通道功能的關(guān)系

1、連接蛋白43磷酸化狀態(tài)與縫隙連接通道功能的關(guān)系    【摘要】  縫隙連接(GJ是介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間直接通訊的特殊膜結(jié)構(gòu)。連接蛋白43(Cx43的磷酸化與去磷酸化對GJ通道的功能有非常重要的影響。激活不同的蛋白激酶可引起Cx43的羧基端21個絲氨酸中的12個殘基、6個酪氨基的2個殘基(247、265磷酸化；通過點突變方法研究發(fā)現(xiàn),這些特殊部位的磷酸化導(dǎo)致GJ通道功能改變。現(xiàn)就Cx43磷酸化狀態(tài)與GJ通道功能的關(guān)系作一綜述。 【關(guān)鍵詞】  縫隙連接；連接蛋白43；磷酸化；去磷酸化研究表明，連接蛋白43(Cx43

2、和細(xì)胞間隙連接通訊(GJIC在多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展起重要作用。高血糖可以促進(jìn)Cx43磷酸化，引起縫隙連接(GJ功能的改變。因此，研究Cx43的磷酸化狀態(tài)改變與心臟GJ功能的關(guān)系，對闡明磷酸化對GJ的作用機(jī)制，闡明DM患者心律失常的發(fā)生機(jī)制有重要意義。    1  GJ的結(jié)構(gòu)    GJ又稱間隙連接、通訊連接,是由連接相鄰2個細(xì)胞之間的連接通道排列而成的一種特殊膜結(jié)構(gòu)。每個GJ通道由相鄰2個細(xì)胞各提供1個相同或不同的連接子(亦稱為半通道以非共價鍵對接而成的親水通道，直徑約1.5nm,允許分子

3、質(zhì)量低于1ku的離子或小分子物質(zhì)通過,這是GJ執(zhí)行各種生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。連接子是由6個相同或不同的亞單位即Cx環(huán)繞排列成的中空小管,其外形如棒狀,直徑67nm。    2  GJ的功能    相鄰細(xì)胞間通過GJ所介導(dǎo)的GJIC進(jìn)行著信息、能量和物質(zhì)的交換,參與細(xì)胞間物質(zhì)交換的代謝偶聯(lián)和電信號傳遞的電偶聯(lián),對細(xì)胞的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、增殖和分化等生理過程起著重要的調(diào)控作用。其生理功能主要有心臟和神經(jīng)元組織中動作電位的快速傳導(dǎo)，其中Cx43單通道電導(dǎo)為60100ps1;細(xì)胞間代謝產(chǎn)物或營養(yǎng)物質(zhì)和

4、水分子的被動擴(kuò)散，如核苷酸、ATP、葡萄糖等2；細(xì)胞間各種離子或第二信使如Ca2+、三磷酸肌醇及環(huán)化核苷酸的交流3。    3  GJ功能的調(diào)節(jié)    GJ通道的功能包括介導(dǎo)細(xì)胞間電耦聯(lián)和化學(xué)耦聯(lián)。評價GJ功能的方法主要有膜片鉗技術(shù)和低分子染料通透試驗。Cx43形成的GJ通道允許分子質(zhì)量小于1000u和/或直徑小于1.5nm的離子或小分子通過。由于GJ通道具有口徑大、低選擇性、開放穩(wěn)定性及協(xié)作的雙細(xì)胞結(jié)構(gòu)等特點，因此GJ通道一般不被認(rèn)為是通常意義上的離子通道，而被認(rèn)為是具有自己獨特結(jié)構(gòu)、功能和特

5、性的一種特殊通道。GJ通道的功能受多種因素的影響，這些因素主要有胞內(nèi)pH值、Ca2+濃度、Cx的磷酸化狀態(tài)、跨通道電壓以及一些神經(jīng)體液因子。胞內(nèi)pH值降低可致GJ通道功能減弱甚至關(guān)閉，細(xì)胞間失去耦聯(lián)。胞內(nèi)Ca2+濃度下降時，GJ通道的電導(dǎo)呈劑量依賴性下降，而當(dāng)胞內(nèi)Ca2+濃度與pH值同時下降時，則電導(dǎo)下降更為明顯46。    4  Cx43    4.1  Cx43的結(jié)構(gòu)    編碼人類Cx43的基因位于6q22.3，全長約3.0kb。

6、Cx基因家族是保守的，不同的Cx具有共同的結(jié)構(gòu)特征。Cx43屬于Cx亞組，分子質(zhì)量43ku，其蛋白質(zhì)肽鏈由382個氨基酸構(gòu)成，其中氨基酸1242構(gòu)成管道部分，243382為細(xì)胞質(zhì)尾部7。從氨基末端(N端至羧基末端(C端共出入細(xì)胞膜4次，形成2個胞外環(huán)和1個胞內(nèi)環(huán)，4個螺旋結(jié)構(gòu)的跨膜片段，從N端至C端分別是M1M4，N端和C端均位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。Cx最為保守的區(qū)域是2個胞外環(huán)，其次是4個跨膜片段，N端保守性次于跨膜片段，亦為保守區(qū)域。胞內(nèi)膨大的C端氨基酸數(shù)目和序列區(qū)別較大，是不同Cx的主要區(qū)別。Cx43的細(xì)胞質(zhì)尾部在不同種屬和不同組織間長度稍有變化8。另外，Cx的大多數(shù)功能調(diào)節(jié)位點也在C端9。

7、60;   4.2  Cx43的生命周期    Cx43在SDS_PAGE上至少表現(xiàn)為P02等3條分子質(zhì)量從4046ku的區(qū)帶。有時在P0和P1_Cx之間有1個次要的磷酸化條帶P；在有絲分裂細(xì)胞等還可以見到超磷酸化的Cx43條帶P3。P0代表剛合成非磷酸化的Cx43，分子質(zhì)量約4042ku；P1代表部分磷酸化的Cx43，分子質(zhì)量約4344ku；P2代表高度磷酸化的Cx43，分子質(zhì)量約46ku10_11。利用Cx43在電泳凝膠上移動性的改變，是判斷其磷酸化較為簡單和常用的方法。  

8、60; 通常情況下，Cx43首先在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，然后轉(zhuǎn)運至高爾基復(fù)合體，最后在細(xì)胞膜上聚集形成GJ12，但在轉(zhuǎn)運至細(xì)胞膜之前，是否有先形成寡聚體則仍不清楚。在應(yīng)激條件下，GJ單位通過胞吞，被從斑塊的中央加速移除，形成環(huán)狀GJ，與胞吞小體結(jié)合，進(jìn)而被溶酶體降解。Cx處于動態(tài)變化過程，Cx43的半衰期約13h13。較短的半衰期對快速調(diào)節(jié)通道數(shù)量具有重要意義。    5  GJ通道功能調(diào)節(jié)與CX43磷酸化狀態(tài)的關(guān)系蛋白質(zhì)磷酸化作用是真核細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的核心,通常磷酸化作為一個分子開關(guān)在不同通路如代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞分裂等控制著蛋白質(zhì)

9、的活性,蛋白質(zhì)的磷酸化參與酶的作用機(jī)制,以及介導(dǎo)蛋白質(zhì)的活性。    CX43的磷酸化與去磷酸化對GJ通道的功能有非常重要的影響14,CX43的C端241382為主要磷酸化區(qū),也是多種激素的識別位點,絲氨酸、蘇氨酸及酪氨酸殘基的磷酸化程度決定著GJ通道的通透性及功能,在心肌細(xì)胞,CX43的磷酸化使GJ通道開放,去磷酸化使該通道關(guān)閉,而且是該通道解聚的關(guān)鍵點,CX43一旦去磷酸化,該通道即開始解聚為Cx亞單位,而Cx亞單位可以進(jìn)一步解聚或轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)儲存，對大多數(shù)細(xì)胞如平滑肌細(xì)胞、肝上皮細(xì)胞Cx磷酸化則導(dǎo)致GJIC的中斷Cx翻譯后經(jīng)磷酸化而發(fā)生結(jié)構(gòu)及功能的改

10、變,磷酸化在Cx的生命周期(如運輸、合成、分解、降解以及GJ通道的門控方面起著重要的調(diào)控作用。    5.1  蛋白酪氨酸激酶(PTK    5.1.1  非受體PTK  c_Src蛋白激酶是正常細(xì)胞的酪氨酸特異性蛋白激酶，而其基因輕微改變后表達(dá)的v_Src蛋白激酶則是一種致瘤性蛋白激酶。Src通過多種機(jī)制影響Cx43通道功能：作用于蛋白激酶C(PKC、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK等絲氨酸激酶，進(jìn)而磷酸化Cx43，抑制通道功能；影響能作用于通道功能的蛋白質(zhì)

11、的表達(dá)；直接磷酸化Cx4315。v_Src直接磷酸化Cx43的Tyr247和Tyr265位點，引起通道關(guān)閉，可能與降低通道開放概率有關(guān)，而非通過降低單通道傳導(dǎo)性16。Tyr265位點突變，v_Src則無法磷酸化Cx43，但單純的Tyr265位點磷酸化并不足以使通道關(guān)閉，只有進(jìn)一步磷酸化Tyr247才使得通道關(guān)閉，可能的作用方式：v_Src通過SH3結(jié)構(gòu)域與Cx43富含脯氨酸的274283區(qū)域結(jié)合；接著磷酸化Cx43，主要在Tyr265；v_Src的SH2與Cx43 Tyr265對接，增加親和力并使Src磷酸化Tyr247導(dǎo)致通道關(guān)閉17。    

12、;5.1.2  受體PTK  表皮生長因子(EGF可引起Cx43的磷酸化，主要作用在Ser殘基。EGF激活相應(yīng)受體的酪氨酸蛋白激酶活性，通過MAPKs引起Cx43S255、S279、S282磷酸化，降低通道開放概率，使通道關(guān)閉18。血小板衍化生長因子引起的Cx43通道功能中斷則不只與Cx43的磷酸化或MAPKs的活化有關(guān)，還可能需要另外的信號途徑，但具體磷酸化Ser的哪個位點仍不清楚。    5.2  絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶    5.2.1 &

13、#160;MAPKs  包括ERK1/2、BMK_1(ERK5、p38、JNK等。MAPK可磷酸化Cx43的Ser279和Ser282等位點，引起的GJIC快速短暫性降低19_20。    5.2.2  PKC  在體外，PKC可磷酸化Cx43的Ser372和Ser368位點。PKC的激動劑，如12_O_十四烷酰佛波醋酸酯_13、佛波醇乙酯可增強(qiáng)S262和S368的磷酸化程度，前者的磷酸化使得細(xì)胞增生增強(qiáng)，但具體機(jī)制未明，后者通過降低單一通道傳導(dǎo)性來降低GJ功能21,10。高糖可以通過PKC高磷

14、酸化Cx43的Ser368位點從而抑制平滑肌細(xì)胞的GJIC22。另有報道，高糖通過PKC高磷酸化Cx43，刺激Cx43的降解，從而抑制腎小管內(nèi)皮細(xì)胞的GJIC23。EK_VITORIN等24研究發(fā)現(xiàn)，PKC高磷酸化Cx43的Ser368位點，降低通道的選擇通透性，降低GJ功能。    5.2.3  蛋白激酶A(PKA  Ser364位點的磷酸化對cAMP上調(diào)Cx43的組裝很關(guān)鍵，該過程由PKA介導(dǎo)，但PKA是否直接磷酸化Cx43的這個位點，還是通過活化其它酶再引起該位點的磷酸化仍不十分清楚25。磷酸化的Ser364

15、可能對cAMP引起的GJ裝配增加起關(guān)鍵作用，而對基礎(chǔ)狀態(tài)下的GJ裝配的作用較為次要26。YOGO等27發(fā)現(xiàn)卵泡刺激素可引起大鼠顆粒細(xì)胞Cx43的Ser365、Ser368、Ser369、Ser373等位點的超磷酸化，并證明這些位點的磷酸化由PKA介導(dǎo)，這4個位點的超磷酸化增強(qiáng)了通道的形成及功能。    5.2.4  蛋白激酶G(PKG  在大鼠心肌細(xì)胞中，環(huán)磷酸鳥苷可激活PKG，能通過磷酸化Cx43的Ser257，降低單通道傳導(dǎo)性,使細(xì)胞間傳導(dǎo)性和對染料的通透性降低28。   

16、0;5.2.5  酪蛋白激酶1(CK1  體外CK1，特別是其delta亞型，可直接磷酸化Cx43的Ser325、Ser328或Ser330等位點，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上的Cx43裝配形成GJ通道，抑制CK1減少Cx43的磷酸化，伴隨Cx43朝向細(xì)胞膜的減少29。LAMPE等30研究提示，Ser325/328/330的磷酸化可影響通道的選擇通透性及裝配，將Ser325/328/330位點突變?yōu)楸彼岷螅ǖ拦δ苊黠@下降，表現(xiàn)為染料羅氏黃轉(zhuǎn)移能力降低，該過程由CK1介導(dǎo)，心肌缺血通過降低Cx43的磷酸化程度，降低通道功能。   

17、0;5.2.6  細(xì)胞分裂周期蛋白激酶2  是一種蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶,對有絲分裂的正確起始有重要作用。其在Cx43的作用靶點可能是Ser255，可磷酸化Cx43的Ser255，或通過激活其他激酶使Cx43磷酸化，使GJ通道轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，引起GJIC短暫的降低31。【參考文獻(xiàn)】  1FISHMAN G I, MORENO A P, SPRAY D C, et al. Functional analysis

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