秦嶺地區(qū)子囊菌酵母物種多樣性研究_cropped

1、菌 物 學 報 23（2）：183187, 2004Mycosystema秦嶺地區(qū)子囊菌酵母物種多樣性研究白逢彥*陸惠中王啟明賈建華(中國科學院微生物研究所真菌地衣系統(tǒng)學重點實驗室 北京 100080)摘 要：從陜西秦嶺地區(qū)的果實和葉等不同基物上分離得到子囊菌酵母 262 株，利用 26S rDNA 的 D1/D2 區(qū)域序列分析并結合形態(tài)學特征對這些菌株進行了分類學研究，探討了該地區(qū)子囊 菌酵母的物種多樣性及其分布。共鑒定出 10 屬 31 種，其中優(yōu)勢屬為假絲酵母屬 Candida, 12 種，(其中新種 2 個，另文發(fā)表)、釀酒酵母屬 Saccharomyces, 5 種、畢赤酵母屬 Pi

2、chia, 5 種和 有孢漢遜酵母屬 Hanseniaspora, 3 種。對分離自陜西秦嶺不同地區(qū)與海拔的同一個種的不同菌 株進行了 D1/D2 序列分析比較，以探討子囊菌酵母種內序列穩(wěn)定性和變異幅度。 關鍵詞：陜西，優(yōu)勢酵母屬種，地理分布，26S rDNA D1/D2 區(qū)，序列分析中圖分類號：Q939.96文獻標識碼：A文章編號：1672-6472（2004）02-0183-0187秦嶺被視為中國亞熱帶和暖溫帶的分界山脈，山谷縱橫，高溫多變，氣候溫和濕潤，生物資源豐富，有著從熱帶闊葉林向暖溫帶夏綠闊葉林過渡的植被景觀。19911997 年間中科 院微生物所對秦嶺地區(qū)的真菌進行了系統(tǒng)的考察研

3、究，發(fā)現(xiàn)了該地區(qū)具有豐富的真菌資源（卯 曉嵐和莊劍云主編，1997）。然而，對該地區(qū)子囊菌酵母的系統(tǒng)研究還是空白?；诖耍覀儗ξ挥陉兾鹘鐑鹊那貛X部分區(qū)域，包括秦嶺主峰太白山（3767 米）的子囊菌酵母進行了考察。酵母菌的常規(guī)鑒定主要依賴于形態(tài)和生理特征，然而，這些特征均是表型性狀，且會隨著環(huán)境的變化有所改變，造成菌株鑒定的不可靠性（白逢彥，2002）。隨著 DNA 序列分析技 術的日趨成熟和簡易化，rRNA 基因（rDNA）及其轉錄間區(qū)（ITS）的序列分析已經(jīng)被廣泛 應用于酵母菌的鑒定。Kurtzman 和 Robnett（1997，1998）和 Fell 等（2000）的研究表明 大亞基

4、rRNA 基因（26S rDNA）中的 D1/D2 區(qū)域能將絕大部分子囊菌酵母和擔子菌酵母的種 區(qū)分開來，而種內不同菌株間 D1/D2 區(qū)域序列差異一般在 1%以內，堿基差異在 1%以上則可能代表不同的種。由于這些序列均已經(jīng)公布于 GenBank/EMBL/DDBJ 等國際核酸序列數(shù)據(jù)庫，為酵母菌的鑒定帶來極大的便利。本研究利用 D1/D2 序列分析，并結合表型性狀，探討了中國陜西秦嶺地區(qū)子囊菌酵母的物種多樣性和分布。1 材料與方法1.1 樣品采集和酵母菌分離于 2002 年 10 月上旬，赴陜西秦嶺地區(qū)采集主要以果實和樹葉為主的基物。取適量基物放于富集培養(yǎng)基（用濃 HCl 調至 pH 3.5

5、-4.0 的麥芽汁液體培養(yǎng)基）中 25 °C 下進行富集培養(yǎng)，23 天后過濾涂布麥芽汁瓊脂平板，25 °C 下培養(yǎng) 23 天后挑取單菌落。純化后用標準方法國家 863 項目(2001AA227131)和中科院知識創(chuàng)新工程重要方向項目(KSCX2 -SW -101C)資助* 通訊作者, e-mail: baify收原稿日期：2003 -11 -27 ，收修改稿日期：2004 -01 -17 （Yarrow, 1998）進行尿素酶測試，陰性反應者為子囊菌酵母。分離出的酵母菌放在-80 °C 超低溫冰箱中保藏備用，已鑒定菌株交中科院微生物研究所中國普通微生物菌種保藏中心

6、（CGMCC）保藏。1.2 形態(tài)學觀察根據(jù)酵母菌分類學研究標準方法（Yarrow, 1998）對供試菌株進行形態(tài)學觀察。1.3 DNA 提取、PCR 擴增和測序DNA 提取按照 Makimura 等（1994）的方法進行，詳細步驟見白逢彥等（2002）。26S rDNAD1/D2 區(qū)域序列的 PCR 擴增根據(jù) Kurtzman & Robnett （1997）的方法，用引物 NL1 （5'-GCA TAT CAA TAA GCA GAG GAA AAG-3'）和 NL4 （5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3'） 擴增所測菌株的

7、D1/D2 區(qū)域，按下述反應條件進行 36 個循環(huán)：94 °C, 1 min; 55 °C, 1 min; 72°C, 2 min。所得 PCR 產(chǎn)物純化后用引物 NL1 和 NL4 在 ABI 377 型 DNA 自動測序儀上直接測序。1.4 序列分析用校正后的所測菌株的 D1/D2 序列，在 GenBank/EMBL/DDBJ 等國際核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索（BLAST search），以比較測試菌株與已知酵母菌種相應序列的相似程度，并結合形態(tài)學等表型分析，對其做出鑒定。菌株間的序列比較用 Clustal X 軟件（Thompson etal., 19

8、97）進行。2 結果與討論2.1 子囊菌酵母類群在位于陜西界內的秦嶺多個地區(qū)采集得到不同基物樣品 71 份，共分離得到子囊菌酵母262 株（表 1）。26S rDNA D1/D2 區(qū)域序列分析和形態(tài)學觀察結果表明，這些子囊菌酵母屬 于下列 10 個不同的屬：假絲酵母屬 Candida Berkhout, 畢赤酵母屬 Pichia E.C. Hansen emend.Kurtzman, 釀酒酵母屬 Saccharomyces Yeyen ex Reess, 德巴利酵母屬 Debaryomyces Lodder &Kreger-van Rij, 棒孢酵母屬 Clavispora Rodri

9、gues de Miranda, 有孢漢遜酵母屬 HanseniasporaZikes, 克魯維酵母屬 Kluyveromyces van der Walt, Williopsis Zender, 有孢酵母屬 TorulasporaLindner 和裂殖酵母屬 Schizosaccharomyces Lindner，共 31 種和變種（表 2），其中包括屬于 假絲酵母屬的 2 個新種（另文發(fā)表）。這一結果顯示，該地區(qū)具有豐富的子囊菌酵母資源。表 1 陜西境內秦嶺地區(qū)采集地點及采集樣品、分離菌株、屬和種數(shù)量Table 1 Sampling locations in Shanxi and numb

10、ers of samples collected, yeast strains isolated, genera and species identified.數(shù) 量 Number of采集地點 Location樣品分離菌株屬種 samples collected strains isolated Genera Species 太白 Taibai湯峪 Tangyu 佛平 Foping 周至 Zhouzhi 洋縣 Yangxian 槐牙 Huaiya太白山 Mt. Taibai總計 Total88104333571453948138910026277733491016141855622312 期

11、陸惠中等：秦嶺地區(qū)子囊菌酵母物種多樣性研究185表 2 陜西秦嶺地區(qū)子囊菌酵母種類及其地理分布* Table 2 Distribution of ascomycetous yeast species in Qinling, Shanxi 種名 Species太白Taibai湯峪Tang- yu太白山Mt. Taibai佛平Fo- ping槐牙Huai- ya周至Zhou- zhi洋縣Yang- xianCandida austromarina （Fell & I.L. Hunter）S.A. Meyer & Yarrow Candida fragi M. Suzuki Cand

12、ida fukuyamaensis NakaseCandida kruisii （Kocková -Kratochvílová &Ondruová ） S.A. Meyer & Yarrow Candida melibiosica H.R. Buckley & van UdenCandida membranifaciens （Lodder &Kreger-van Rij） Wickerham & K.A. BurtonCandida oleophila MontrocherCandida quercitrusa S

13、.A. Meyer & Phaff Candida railenensis C. Ramírez & A. GonzálezCandida tropicalis （Castellani） BerkhoutClavispora lusitaniae Rodrigues de Miranda Debaryomyces hansenii var. fabryi （Ota） Nakase & M. SuzukiHanseniaspora guilliermondii PijperHanseniaspora opuntiae N. CadezHansenias

14、pora uvarum （Niehaus） El- TabeyShehata et al.Kluyveromyces marxianus （E.C. Hansen）Van der WaltPichia anomala （E.C. Hansen） KurtzmanPichia fermentans LodderPichia guilliermondii WickerhamPichia kluyveri var. kluyveri BedfordPichia membranifaciens （E.C. Hansen）E.C. HansenSacchromyces bayanus Saccardo

15、Sacchromyces cerevisiae Meyen ex E.C. HansenSacchromyces exiguous Reess ex E.C. Hansen Sacchromyces kluyveri Phaff et al. Sacchromyces paradoxus Bachinskaya Schizosaccharomyces pombe LindnerTorulaspora delbrueckii （Lindner） LindnerWilliopsis californica （Lodder） von Arx* 未包括 2 個 Candida 屬新種，“”表示該地區(qū)有

16、分布。2.2 優(yōu)勢屬種在鑒定出的 10 個屬中，Candida, Saccharomyces, Pichia 和 Hanseniaspora 這四個屬為該地區(qū)的優(yōu)勢屬，有著廣泛的分布，各屬種的數(shù)目分別占總種數(shù)的 38.7%、16.1%、16.1%和 9.7%，四大屬總計占 80.7% 。Candida 種的數(shù)量最多，共有 12 個種，最為常見種的是 C. fragi,C. melibiosica 和 C. oleophila，它們在大部分地區(qū)均有分布；有 5 個種屬于 Saccharomyces, 其 中 S. cerevisiae 和 S. exiguous 為分布較廣；屬于 Pichia

17、的種也有 5 個，其中 P. fermentans 最 常見；Hanseniaspora 屬 3 個種，分布最廣泛的是 H. uvarum。除了這四大常見屬之外，另外6 個屬各分離到一個種，其中 Williopsis californica 和 Clavispora lusitaniae 是本地區(qū)常見的兩 個種 （表 2）。2.3 地理分布本研究重點考察了太白縣、湯峪、太白山、佛平四個地區(qū)的子囊菌酵母資源，同時在槐牙、周至、洋縣三個地區(qū)進行小量分離鑒定。各個地方分離到的屬、種數(shù)見表 1。研究結果 表明，在上述各個地區(qū)基本上具有相似的子囊菌酵母多樣性分布，大部分的屬在不同地區(qū)都 有廣泛分布。如表

18、 2 所示：四個優(yōu)勢屬（Candida, Saccharomyces, Pichia 和 Hanseniaspora） 在 7 個采集點都有分布，在四個主要地區(qū)都有分布的屬有包括四個優(yōu)勢屬在內的 6 個屬，另外兩個屬為 Williopsis 和 Clavispora。只有 Kluyveromyces 一個屬僅在太白山一個地區(qū)鑒定到。各采集地區(qū)種的多樣性分布情況也具有一定的相似性，表 2 顯示，在五個以上地區(qū)均可鑒定到的種有 4 個：Candida melibiosica, Hanseniaspora uvarum, Pichia fermentans 和 Clavispora lusitani

19、ae；在四個采集點均可鑒定到的種有 4 個：Candida fragi, Hanseniaspora opuntiae,Williopsis californica 及 Candida oleophila。除此之外，有 7 種在 3 個不同的地區(qū)有分布。兩個假絲酵母新種分別分離自湯峪和佛平（另文發(fā)表）。秦嶺主峰太白山海拔 3767 米，由于高差大，氣候、土壤、植被等均表現(xiàn)出明顯的垂直 分布規(guī)律，自下而上有暖溫帶、寒溫帶、寒帶氣候特點，本研究在代表不同氣候帶的海拔高 度采樣分離菌株，并對其種類進行了比較研究。在太白山總共鑒定得到子囊菌酵母 9 屬 22 種，除 Candida austromar

20、ina 和 Kluyveromyces marxianus 外，其它 20 個種在陜西秦嶺的其它 地區(qū)均分離到。本研究特意對高山草旬帶進行采集分離，發(fā)現(xiàn)在這個高度依然有著豐富的酵 母菌資源，許多在陜西秦嶺其他地區(qū)常見的種，如 Candida melibiosica, Hanseniaspora uvarum 和 Clavispora lusitaniae 在這里也都有分布。從低海拔到 3000 米左右范圍內，不同海拔高度 的酵母菌分布情況大體相似，但隨著海拔的增高酵母菌種群有逐漸減少的趨勢，這跟植被的 分布有很大關系。本研究并未發(fā)現(xiàn)具有海拔特異性的種。本研究對屬于同一個種分離自不同地方或海拔高

21、度的菌株進行了 D1/D2 序列比較分析。 選了 3 個廣布種包括 Candida melibiosica, Hanseniaspora uvarum 和 Clavispora lusitaniae 作為 研究對象，結果顯示不同地區(qū)的菌株之間具有相同的序列。同樣，采自不同海拔高度同一種 的菌株之間也顯示了序列的同一性。ITS 等其他區(qū)域的序列是否相同有待于進一步的研究。 在形態(tài)上也進行了比較，發(fā)現(xiàn)在細胞形狀、大小、生長方式、菌落形態(tài)、繁殖方式和菌絲形 成方面都沒有差異。REFERENCESBai FY, Liang HY, Jia JH, 2002. Molecular taxonomic s

22、tudy on the problematic Candida strains based on 26S rDNA D1/D2 domain sequence comparison. Mycosystema, 21 : 2732 （in Chinese）Fell JW, Boekhout T, Fonseca A, Scorzetti G, Statzell -Tallman A, 2000 . Biodiversity and systematics of basidiomycetous yeasts as2 期陸惠中等：秦嶺地區(qū)子囊菌酵母物種多樣性研究187determined by la

23、rge -subunit rDNA D1/D2 domain sequence analysis. Int J Syst Evol Microbiol, 50 : 13511371 Kurtzman CP, Robnett, CJ, 1997. Identification of clinically important as comycetous yeasts based on nucleotide divergence in the5' end of the large -subunit （26S） ribosomal DNA gene . J Clin Microbiol, 35

24、 : 12161223 Kurtzman CP, Robnett CJ, 1998. Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit（26S） ribosomal DNA partial sequences. Antonie van Leeuwenhoek , 73 : 331371 Makimura K, Murayama YS, Yamaguchi H, 1994. Detection of a wide range of medically importa

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26、erface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res, 25 : 487648 82 Yarrow D, 1998. Methods for the isolation, maintenance and identification of yeasts. In: Kurtzman C P, & Fell J W （eds.） TheYeasts, a Taxonomic Study. 4th edn. Amsterdam

27、: Elsevier.77100. 附中文參考文獻白逢彥，梁慧燕，賈建華，2002. 假絲酵母屬疑難菌株大亞基 rDNA D1/D2 區(qū)域序列分析及其分類學意義. 菌物系統(tǒng),21 : 2732卯曉嵐，莊劍云主編, 1997. 秦嶺真菌. 北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社. 1181SPECIES DIVERSITY OF ASCOMYCETOUS YEASTS IN QINLINGAREA OF SHANXI PROVINCELU Hui-ZhongJIA Jian-HuaWANG Qi-MingBAI Feng-Yan（Systematic Mycology and Lichenology Laboratory, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080）ABSTACT: 262 ascomycet