TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒內(nèi)容及操作步驟(精)

1、TUNEL 細(xì)胞凋亡試劑盒內(nèi)容及操作步驟凋亡細(xì)胞的原位末斷轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法（TUNEL 法細(xì)胞凋亡的多步驟機(jī)制作用的最終環(huán)節(jié)是；細(xì)胞內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活而導(dǎo) 致核染色質(zhì) DNA 雙鏈的斷裂。大量 DNA 片段暴露出的 3 羥基在末斷轉(zhuǎn)移酶 （terminaldeoxynucleotidyl transferase, TdT 或 DNA 多聚酶的作用下，與生物素或地 高辛標(biāo)記的核苷酸結(jié)合，最終借助與卵白素或抗地高辛抗體結(jié)合的熒光素或HRP，使凋亡細(xì)胞被特異性地標(biāo)記和顯示出來。TUNEL 細(xì)胞凋亡試劑盒由美國羅氏公司提供試劑 1:酶濃縮溶液（Enzyme Solution試劑 2:標(biāo)記溶液（Labl

2、e Solution試劑 3:轉(zhuǎn)化劑-POD （Co nverter-POD酶標(biāo)記抗熒光素抗體（即用型試驗(yàn)所需其它試劑：非石蠟切片：沖洗緩沖液：磷酸鹽緩沖液（PBS阻斷溶液:0.3%H2O2 甲醇溶液固定溶液:4%多聚甲醛（溶劑 pH7.4 新鮮配制的 PBS 溶液滲透液:0.1%Triton 甔-100（溶于新鮮配制的 0.1%枸櫞酸鈉溶液Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚 名:曲拉通 X-100,乳化劑 OP分子式:C34H62O11石蠟切片：二甲苯和乙醇（100%、95%、90%、80%、70%用蒸餾水稀釋沖洗緩沖液：磷酸鹽緩沖液（PBS蛋白酶 K 工作液 1020mg/ml

3、溶于 10mM Tris/HCI（pH7.47.8根據(jù)需要選擇：滲透液：0.1%TritonX-100（溶于新鮮配制的 0.1%枸櫞酸鈉溶液胃酶溶液（0.25%-0.5%溶于 HCI , pH2 或胰酶0.1M 枸櫞酸緩沖液，pH6，微波修復(fù)材料:微波爐，微波輸出功率 850W-2000W2 .選用中性甲醇固定的活檢及實(shí)驗(yàn)動 物標(biāo)本，常規(guī)脫水,二甲苯透明，石蠟包埋。操作步驟抗原微波修復(fù)（供參考1. 組織經(jīng)福爾馬林固定后會產(chǎn)生廣泛的蛋白質(zhì)交連，因此石蠟組織進(jìn)行凋亡檢 測時(shí)要進(jìn)行預(yù)處理。經(jīng)我公司科研人員的長期研究認(rèn)為：TUNEL 染色時(shí)蛋白酶 K 的作用有可能引起 內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的釋放，造成假陽

4、性反應(yīng)，同時(shí)過量的蛋白酶 K 處理可破壞組織的 結(jié)構(gòu),用微波技術(shù)替代上述處理可避免上述弊端的出現(xiàn)。2.微波已被愈來愈多地作為免疫組織化學(xué)和原位雜交的預(yù)處理過程，經(jīng)一定溫度的微波處理可修復(fù)因 固定和包埋造成的抗原破壞，打斷氨基酸的肽鍵結(jié)合，促進(jìn)抗原決定簇的暴露，恢復(fù)細(xì)胞膜的空間結(jié)構(gòu)，增加穿透效應(yīng)，加速組織處理及染色過 程。我們在作 TUNEL 染色前進(jìn)行微波修復(fù)，可以達(dá)到蛋白酶 K 的功效，取得較為理 想的效果，背景染色很淺，凋亡細(xì)胞陽性顆粒與背景染色對比非常鮮明。3.蛋白酶 K 作用的條件嚴(yán)格，消化度常因組織的不同而在操作中不便掌握。同時(shí)蛋白酶 K 的價(jià)格昂貴，而微波已作為一種常用儀器用于免疫

5、組織化學(xué)染色中。(1 切片常規(guī)脫蠟入水(2將一燒杯盛 200ml 的 0.01 M、 pH6.0 的檸檬酸緩沖液，加熱至 90 95C,迅速 放入切片，使用 680W(80%功率、微波照射 1min ,加入雙蒸水(2025C80ml 作迅速 冷卻，將玻片移至 PBS(2025C。(3PBS 洗 5min 3次。(4 加 20%正常牛血清室溫 30 min。(5 將 TUNEL 反應(yīng)混合液加在切片上,37C溫育 90min(陰性對照片、TUNEL 混合液中不加 TDT。(6PBS 洗 5min 3次。(73%H2O2 甲醇液室溫阻斷 10min。(837C溫育 90min。(9 加 POD 轉(zhuǎn)化

6、劑,37C溫育 30min。(10PBS 洗 5min 3次。(11DAB/H2O2 顯色。(12 蘇木素淡染，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封固。結(jié)果:細(xì)胞核呈棕色顆粒者為陽性細(xì)胞，結(jié)合形態(tài)特征,可確立凋亡細(xì)胞。陰性對 照片無棕色顆粒細(xì)胞凋亡的檢測技術(shù)簡介（供參考一. 凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變細(xì)胞表面：偽足，微絨毛等消失細(xì)胞體形態(tài)：細(xì)胞皺縮，變形，體積變小細(xì)胞核:染色質(zhì)濃縮，早期染色質(zhì)聚集于核膜邊呈新月形或環(huán)形，晚期碎裂細(xì)胞器:密集但形態(tài)及結(jié)構(gòu)完整，早期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)短暫擴(kuò)張細(xì)胞膜：完好，晚期包裹細(xì) 胞器或核碎片，形成凋亡小體在組織中表現(xiàn)：常常以單個(gè)細(xì)胞散在發(fā)生周圍組織反應(yīng)：凋亡細(xì)胞或小體被鄰近巨噬細(xì)胞，上皮

7、細(xì)胞吞噬，降解，不發(fā)生炎癥反應(yīng)發(fā)生條件：屬于基因控制的程序性細(xì)胞死亡，多發(fā)生于器官萎縮，細(xì)胞介導(dǎo)的免 疫殺傷機(jī)制，小劑量毒素作用以及多種病理生理狀態(tài)二. 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測方法（一凋亡細(xì)胞的光鏡和熒光顯微鏡檢測1.制片（1 常規(guī)組織學(xué)切片，進(jìn)行脫蠟和水化。（2培養(yǎng)細(xì)胞可用細(xì)胞離心儀制片。由于凋亡細(xì)胞在制片中容易破碎，所以應(yīng)采用低速離心制片（250g,離心 5min ,并事先將載玻片用 1%BSA 處理,使細(xì)胞易于貼 附.離心后涂片,稍經(jīng)空氣中干燥后 迅速用 1%多聚甲醛 4C下固定 15-30min 然后 轉(zhuǎn)入 80%乙醇后固定 1-2h 保存于-20E待用.2.染色方法可用多種方法進(jìn)行染色

8、。(1 可采用常規(guī)的組織學(xué)染色方法,如 Giemsa 染色，HE 染色或 Mayer 蘇木素染 色.(2 采用熒光染料染色,如 DAPI(4 , 6diamidi no-2-phenylindole,PI(propidium iodide 和 7-AAD(7-aminoacetinomycin D.其染色濃度為:DAPI 1-2 卩 g/ml;PI 510 卩 g/ml;7AAD 10-20 卩 g/ml 由于 PI 染料同時(shí)也與 RNA 結(jié)合,所以應(yīng)將細(xì)胞先用RNA酶消化(50Kunitz單位的RNA酶，37C下作用15min 或室溫 下30min 后，再進(jìn)行 PI 染色。3.結(jié)果觀察典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：細(xì)胞體積縮小及變形；核濃染及喪失亞形態(tài)結(jié)構(gòu)，可見核染色質(zhì)呈新月形，或核碎裂成大小不等的核碎片；在組織切片上可見巨噬細(xì)胞或 鄰近的上皮細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞或凋亡小體。(二凋亡細(xì)胞的電鏡觀察采用電鏡