生化實(shí)驗(yàn)2電泳ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)3 3血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳（Cellulose acetate membrane Cellulose acetate membrane electrophoresis of serum proteinselectrophoresis of serum proteins） 遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室 朱朱 欣欣 婷婷實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)思路思路蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)有哪些？蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)有哪些？蛋白質(zhì)的分離方法有哪些？蛋白質(zhì)的分離方法有哪些？本次實(shí)驗(yàn)利用了哪個(gè)性質(zhì)？本次實(shí)驗(yàn)利用了哪個(gè)性質(zhì)？ 生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室 朱欣婷朱欣婷v1.掌握電泳法分

2、離蛋白質(zhì)的原理；v2.掌握醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白的原理和方法；v3.進(jìn)一步熟悉721型分光光度計(jì)的使用v 生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室 朱欣婷朱欣婷分離蛋白質(zhì)的方法分離蛋白質(zhì)的方法分離方法分離方法沉淀法沉淀法鹽析法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法層析法層析法電學(xué)法電學(xué)法電泳法電泳法等電聚焦等電聚焦超速離心法超速離心法離子交換層析離子交換層析吸附層析吸附層析凝膠過濾分子篩）凝膠過濾分子篩）親和層析親和層析 生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室 朱欣婷朱欣婷（一電（一電 泳泳 技技 術(shù)術(shù) (electrophoresis)電泳：帶電粒子在電場的作用下向著與其電性電泳：帶電粒子在電場的作用下向著與其

3、電性 相反的電極移動的現(xiàn)象。相反的電極移動的現(xiàn)象。電泳技術(shù)電泳技術(shù): :指利用電泳現(xiàn)象對混合物進(jìn)行分離分指利用電泳現(xiàn)象對混合物進(jìn)行分離分 析的技術(shù)。析的技術(shù)。 生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室 朱欣婷朱欣婷一、電泳的原理一、電泳的原理以蛋白質(zhì)為例：以蛋白質(zhì)為例：PrCOO-NH2PrCOO-NH3+PrCOOHNH3+HOHHOHpHpI pH=pI pH 纖維狀分子纖維狀分子分子大小：分子大?。?生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室 朱欣婷朱欣婷Q Q越多，越多，u u越大；越大；分子小，分子小，r r越小，越小，u u越大；越大；2.2.緩沖溶液：緩沖溶液：pHpH值：值：(pH-pI)(pH-pI)

4、越大，越大，Q Q越多，越多，u u越大越大離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度(I)(I)： I I越大，電動電勢越小，越大，電動電勢越小，u u越??；越小； I I越小，電動電勢越大，越小，電動電勢越大，u u越大，越大， 但樣品易擴(kuò)散。但樣品易擴(kuò)散。離子強(qiáng)度如果過低，緩沖液的緩沖容量小，不易維持離子強(qiáng)度如果過低，緩沖液的緩沖容量小，不易維持pHpH恒定恒定 選擇離子強(qiáng)度時(shí)要兩者兼顧，一般離子強(qiáng)度的選擇范選擇離子強(qiáng)度時(shí)要兩者兼顧，一般離子強(qiáng)度的選擇范圍在圍在0.020.020.20.2之間。之間。 生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室 朱欣婷朱欣婷電場強(qiáng)度：電泳支持物上每厘米的電位降，也稱電勢梯度。電場強(qiáng)度：電泳支持

5、物上每厘米的電位降，也稱電勢梯度。3.3.電場強(qiáng)度電場強(qiáng)度(X)(X)X X越大，越大，u u越快。越快。支持物越短，支持物越短， X X越大，越大， u u越快。越快。 電場強(qiáng)度越大或支持物越短，電流將隨之增加，產(chǎn)熱也電場強(qiáng)度越大或支持物越短，電流將隨之增加，產(chǎn)熱也增加，影響分離效果。增加，影響分離效果。 在進(jìn)行高壓電泳的時(shí)候必須用冷卻裝置，否則可引起在進(jìn)行高壓電泳的時(shí)候必須用冷卻裝置，否則可引起蛋白質(zhì)等樣品發(fā)生熱變性而無法分離。蛋白質(zhì)等樣品發(fā)生熱變性而無法分離。 生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室 朱欣婷朱欣婷4.4.支持介質(zhì)：支持介質(zhì)：目前常用的電泳支持物：目前常用的電泳支持物：纖維薄膜纖維薄

6、膜( (玻璃纖維薄膜，醋酸纖維薄膜玻璃纖維薄膜，醋酸纖維薄膜) )凝膠凝膠( (瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠) ) 生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室 朱欣婷朱欣婷負(fù)極負(fù)極正極正極 表面帶負(fù)電荷表面帶負(fù)電荷帶正電荷的水層攜帶粒子向帶正電荷的水層攜帶粒子向負(fù)極移動負(fù)極移動 如果樣品原本是移向負(fù)極的，則泳動的速度加快；如果樣品原本是移向負(fù)極的，則泳動的速度加快；如果樣品原本是移向正極的，則泳動的速度減慢。如果樣品原本是移向正極的，則泳動的速度減慢。 電滲作用：電滲作用：電滲：在電場作用下液體對固體支持物相對移動的現(xiàn)象。電滲：在電場作用下液體對固體支持物相對移動的現(xiàn)象。 生物化學(xué)教

7、研室生物化學(xué)教研室 朱欣婷朱欣婷以紙電泳為例以紙電泳為例:（一按支持物的物理性狀不同，區(qū)帶電泳可分為：1濾紙及其它纖維(如玻璃纖維、醋酸纖維、聚氯乙烯纖 維薄膜)電泳2粉末電泳：如纖維素粉、淀粉電泳；3凝膠電泳：如瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳；4絲線電泳：尼龍絲、人造絲電泳。三、區(qū)帶電泳的分類三、區(qū)帶電泳的分類 生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室 朱欣婷朱欣婷（二按支持物的裝置形式不同，區(qū)帶電泳可分為：（二按支持物的裝置形式不同，區(qū)帶電泳可分為：1 1平板式電泳：支持物水平放置；平板式電泳：支持物水平放置；2 2垂直板式電泳：聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳；垂直板式電泳：聚丙烯酰胺凝膠可做成垂

8、直板式電泳；3 3垂直柱式電泳：聚丙烯酰胺盤狀電泳垂直柱式電泳：聚丙烯酰胺盤狀電泳 生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室 朱欣婷朱欣婷( (三三) )按按pH pH 的連續(xù)性不同，區(qū)帶電泳可分為：的連續(xù)性不同，區(qū)帶電泳可分為：1 1連續(xù)連續(xù)pH pH 電泳：即整個(gè)電泳過程電泳：即整個(gè)電泳過程pH pH 保持不變，如常用保持不變，如常用的紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳等。的紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳等。2 2非連續(xù)非連續(xù)pH pH 電泳：緩沖液和電泳支持物間有不同的電泳：緩沖液和電泳支持物間有不同的pH pH 的電泳，如聚丙烯酰胺凝膠盤狀電脈，等電聚焦電泳等。的電泳，如聚丙烯酰胺凝膠盤狀電脈，等電聚焦電泳等。

9、生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室 朱欣婷朱欣婷（二血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳（二血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳 生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室 朱欣婷朱欣婷【實(shí)驗(yàn)原理】【實(shí)驗(yàn)原理】 1.1.血清中幾種主要蛋白組分血清中幾種主要蛋白組分血清蛋白質(zhì)血清蛋白質(zhì)等電點(diǎn)等電點(diǎn)分子量分子量占總蛋白的占總蛋白的清蛋白清蛋白 4.644.6469,00069,000575772 72 1 1球蛋白球蛋白 5.065.06200,000200,0002 25 52 2球蛋白球蛋白 5.065.06300,000300,0004 49 9球蛋白球蛋白 5.125.1290,00090,000150,000150,0006.56

10、.51212球蛋白球蛋白 6.856.857.3 7.3 156,000156,000950,000950,00012122020v 緩沖液pH=8.6v pIpH血清蛋白帶負(fù)電荷血清蛋白帶負(fù)電荷,在電場中向正極移動在電場中向正極移動 生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室 朱欣婷朱欣婷血清蛋白依次分為清蛋白，血清蛋白依次分為清蛋白，球蛋白的球蛋白的11、22、五個(gè)區(qū)帶五個(gè)區(qū)帶請預(yù)測血清蛋白電泳區(qū)帶圖請預(yù)測血清蛋白電泳區(qū)帶圖清蛋白清蛋白 11 22 生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室 朱欣婷朱欣婷膜條經(jīng)過氨基黑10B染色后顯出清晰色帶。2.2.定量定量 生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室 朱欣婷朱欣婷各色帶蛋白質(zhì)含

11、量與染料結(jié)合量基本成正比。各色帶蛋白質(zhì)含量與染料結(jié)合量基本成正比?？蓪⒏魃珟Ъ糸_，分別溶于堿性溶液中?？蓪⒏魃珟Ъ糸_，分別溶于堿性溶液中。用分光光度法計(jì)算各種蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。用分光光度法計(jì)算各種蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。3.3.血清蛋白電泳結(jié)果的臨床意義：血清蛋白電泳結(jié)果的臨床意義： 生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室 朱欣婷朱欣婷臨床上還可用臨床上還可用A/GA/G比來表示清球蛋白的量的關(guān)系：比來表示清球蛋白的量的關(guān)系：正常人正常人A/GA/G1.51.52.52.5可能相關(guān)疾病可能相關(guān)疾病清蛋白清蛋白1 1球蛋白球蛋白2 2球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白骨髓瘤骨髓瘤* *腎病綜合癥腎病綜合癥* *

12、*腎炎腎炎* *肝硬化肝硬化* *急性肝壞死急性肝壞死 * *傳染性肝炎傳染性肝炎* * *急性感染初期急性感染初期* * * *慢性炎癥慢性炎癥/ /感染后期感染后期* *低低 球蛋白血癥球蛋白血癥* *1 1準(zhǔn)備與點(diǎn)樣：準(zhǔn)備與點(diǎn)樣：取兩條取兩條2.52.58cm8cm的膜條的膜條充分浸透充分浸透在巴比妥在巴比妥緩沖液中緩沖液中取出膜條取出膜條濾紙吸去濾紙吸去多余的緩多余的緩沖液沖液無光面距一無光面距一端端1.5cm1.5cm處處作點(diǎn)樣線作點(diǎn)樣線點(diǎn)樣器下點(diǎn)樣器下端粘上薄端粘上薄層血清層血清垂直垂直點(diǎn)樣點(diǎn)樣 生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室 朱欣婷朱欣婷放置放置膜條膜條平衡平衡5分鐘分鐘通通電電關(guān)

13、閉關(guān)閉電源電源2 2電泳電泳點(diǎn)樣面向下點(diǎn)樣面向下點(diǎn)樣端置于陰極點(diǎn)樣端置于陰極膜條貼膜條貼緊濾紙，緊濾紙，拉直膜條拉直膜條電壓：電壓：160v時(shí)間：時(shí)間：60 min 生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室 朱欣婷朱欣婷通通 電電完完 畢畢浸于染色液浸于染色液氨基黑氨基黑10B10B中中取出取出膜條膜條浸于漂浸于漂洗液洗液3 3染色、脫色染色、脫色取出取出膜條膜條5min浸于漂浸于漂洗液洗液2min5min浸于漂浸于漂洗液洗液濾紙吸濾紙吸干薄膜干薄膜5min直至直至漂凈漂凈 生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室 朱欣婷朱欣婷取試管取試管6支支編號編號16. .定量定量( (兩人的膜條共用兩人的膜條共用) )試管編

14、號試管編號A1 12 200.4mol/LNaOH 6.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml蛋白條帶蛋白條帶 清蛋白清蛋白1 1球蛋白球蛋白2 2球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白無蛋白區(qū)無蛋白區(qū)充分振蕩充分振蕩脫凈染料脫凈染料比比 色色定定 量量 生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室 朱欣婷朱欣婷1 1計(jì)算出各部分蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。計(jì)算出各部分蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。清蛋白（清蛋白（2A / T2A / T）10010011球蛋白（球蛋白（ 1 / T1 / T）10010022球蛋白（球蛋白（ 2 / T2 / T）100100球蛋白（球蛋白（/ T/ T）1001

15、00球蛋白（球蛋白（/ T/ T）100100光密度總和光密度總和T T2A2A11222 2計(jì)算出清蛋白與球蛋白之比值計(jì)算出清蛋白與球蛋白之比值2A/G2A/G）G=1G=122 生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室 朱欣婷朱欣婷1.點(diǎn)樣面為不光滑面，勿用手觸摸感知；2.點(diǎn)樣量適中，垂直點(diǎn)樣；3.點(diǎn)樣端接電泳儀負(fù)極；4.膜條與濾紙需貼緊，拉直；5.謹(jǐn)防觸電。 生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室 朱欣婷朱欣婷v1 1在本實(shí)驗(yàn)電泳過程中，正負(fù)電極各發(fā)生什么反應(yīng)在本實(shí)驗(yàn)電泳過程中，正負(fù)電極各發(fā)生什么反應(yīng)? ?電極電極附近的緩沖液有什么變化附近的緩沖液有什么變化? ?v2.2.電泳時(shí)，點(diǎn)樣端置于電場的正極還是負(fù)極？為什么？電泳時(shí)，點(diǎn)樣端置于電場的正極還是負(fù)極？為什么？v3.3.除利用電泳法分離蛋白質(zhì)以外除利用電泳法分離蛋白質(zhì)以外, ,還有哪些分離方法還有哪些分離方法? ?v4.4.簡單繪制血清蛋白電泳后的譜圖。簡單繪制血清蛋白電泳后的譜圖。v5.5.電泳后各區(qū)帶應(yīng)明顯分開電泳后各區(qū)帶應(yīng)明顯分開, ,如