惡性瘧原蟲裂殖子表面蛋白1的17區(qū)片段基因復(fù)合核酸疫苗誘導(dǎo)小鼠抗體免疫性的研究

1、    惡性瘧原蟲裂殖子表面蛋白1的17區(qū)片段基因 復(fù)合核酸疫苗誘導(dǎo)小鼠抗體免疫性的研究        摘要：目的檢測以惡性瘧原蟲裂殖子表面蛋白1的17區(qū)片段基因?yàn)榛A(chǔ)的復(fù)合核酸疫苗(分泌性的VR1012/TPA/HG-MSP1-17和非分泌性的VR1012/HG-MSP1-17)誘導(dǎo)小鼠的體液免疫反應(yīng)和免疫血清對(duì)瘧原蟲生長的抑制能力。 方法以200g/100l或100g/100l每次每只VR1012/HG-MSP1-17或VR1012/TPA/HG-MSP1-17

2、肌注免疫BALB/c或C57BL/6小鼠。用ELISA間接法測定小鼠血清的特異性抗體，用體外抑制試驗(yàn)檢測免疫血清抑制瘧原蟲生長效果。 結(jié)果經(jīng)3次100g/100l每次每只VR1012/HG-MSP1-17免疫后，BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠均產(chǎn)生了明顯的HG和YMSP119抗體。但總體抗體水平不高。BALB/c小鼠經(jīng)3次200g/100l每次每只的VR1012/HG-MSP1-17免疫后，產(chǎn)生了較高的HG抗體，但MSP1-17的抗體無明顯變化，經(jīng)3次200g/100l每次每只VR1012/TPA/HG-MSP1-17免疫后，僅產(chǎn)生較低的HG抗體，無MSP1-17抗體的產(chǎn)生。用200g/

3、100l VR1012/HG-MSP1-17免疫的BALB/c小鼠血清做體外抑制試驗(yàn)，結(jié)果抑制效果明顯。 結(jié)論VR1012/HG-MSP1-17比VR1012/TPA/HG-MSP-17具有更強(qiáng)的免疫原性，其免疫鼠血清能明顯地抑制瘧原蟲生長。關(guān)鍵詞：惡性瘧原蟲； 核酸疫苗； 裂殖子表面蛋白1； T細(xì)胞表位Humoral immune response to Plasmodium falciparum merozoite surface protein 1 C-terminal region based hybrid nucleic acid vaccines in miceMIAO JunLI

4、 XunXUE Caifang, et al（Department of Parasitology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, P.R.China）Abstract：ObjectiveTo analyze humoral immune response to nucleic acid vaccines (VR1012/TPA/HG-MSP1-17 for intracellular expression or VR1012/HG-MSP1-17 for secretion) which contain Plasm

5、odium falciparum Merozoite surface protein 1(MSP1) 17 block gene and gene fragment of several T cell epitopes from MSA1, MSA2, RESA, IL-1 and TT and to monitor the effect of DNA-immune sera on parasite inhibition. MethodsBALB/c or C57BL/6 mice received three intramuscular immunizations with 200g/100

6、l or 100g/100l of VR1012/HG-MSP1-17 or VR1012/TPA/HG-MSP1-17 per mouse each time. HG or MSP1-17 antibodies were monitored by indirect ELISA. The effect of immune sera on parasite inhibition was monitored by in vitro inhibition assays. ResultsBALB/c and C57BL/6 mice immunized with 100g/100l of VR1012

7、/HG-MSP1-17 per mouse gave significantly HG and MSP1-17 antibodies, but the levels of antibodies were not high. BALB/c mice immunized with 200g/100l of VR1012/HG-MSP1-17 per mouse gave higher HG antibodies but no change in MSP1-17 antibodies. BALB/c immunized with 200g/100l of VR1012/TPA/HG-MSP1-17

8、per mouse gave low level of HG antibodies and no MSP1-17 antibodies. Sera from the mice immunized with 200g/100l VR1012/HG-MSP1-17 could significantly inhibit Plasmodium falciparum growth. ConclusionVR1012/HG-MSP1-17 is more immunogenic than VR1012/TPA/HG-MSP1-17. The sera of VR1012/HG-MSP1-17 immun

9、ized mice could inhibit parasite growth prominently.Key words：Plasmodium falciparum; Nucleic acid vaccine; Merozoite surface protein 1; T cell epitope瘧疾控制正處在瘧原蟲抗藥性和蚊媒藥性的不斷擴(kuò)展的困境下，使得研制有效的抗瘧疫苗成為當(dāng)前的迫切需要。而近幾年發(fā)展的核酸疫苗開辟了一個(gè)研制疫苗的新途徑，核酸疫苗具有明顯的優(yōu)勢，其能引起明顯的細(xì)胞免疫反應(yīng)；體內(nèi)為真核天然表達(dá)，不需體外表達(dá)、純化等繁瑣工作；以及制備、攜帶方便、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)。其在多種病毒和細(xì)菌

10、等感染性疾病的研究中取得可喜結(jié)果1。Hoffman等2構(gòu)建了包含瘧原蟲子孢子蛋白基因片段的核酸疫苗，經(jīng)免疫小鼠后產(chǎn)生了明顯的保護(hù)性免疫。WHO/TDR資助我室進(jìn)行紅內(nèi)期核酸疫苗的研究。本文報(bào)道在成功構(gòu)建了編碼惡性瘧原蟲紅內(nèi)期重要的疫苗候選抗原MSP1的羧基端片段（即17區(qū)）和若干個(gè)T細(xì)胞刺激表位的復(fù)合核酸疫苗的基礎(chǔ)上3，研究該核酸疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)，并觀察免疫血清在體外抑制瘧原蟲生長的能力。材料和方法質(zhì)粒、菌株及瘧原蟲株：VR1012/HG-MSP1-17、VR1012/TPA/HG-MSP1-17、VR1012和VR1012/TPA。VR1012由美國Hoffman SL博士惠

11、贈(zèng)，為含巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子和多聚A尾的非分泌型真核表達(dá)載體，將信號(hào)肽基因TPA插入VR1012的多克隆位點(diǎn)前使其改建為分泌型真核表達(dá)載體VR1012/TPA。HG基因?yàn)榫幋aMSA1、MSA2、RESA內(nèi)的T細(xì)胞位點(diǎn)和外源IL-1、TT的廣譜T細(xì)胞刺激位點(diǎn)的雜合基因片段，MSP1-17為編碼MSP1羧基端17區(qū)片段基因。VR1012/HG-MSP1-17、VR1012/TPA/HG-MSP1-17的構(gòu)建見文獻(xiàn)3。菌株為JM109菌。培養(yǎng)的瘧原蟲為惡性瘧原蟲FCC1/HN株。動(dòng)物：由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供。46周齡雌性BALB/c和C57BL/6小鼠分為VR1012/HG-MSP1-17免疫組

12、或VR1012/TPA/HG-MSP1-17免疫組，VR1012或VR1012/TPA對(duì)照組，每組5只。其它：LB培養(yǎng)基為Sigma公司產(chǎn)品，BL20A全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)(湘西儀器儀表總廠)，質(zhì)粒純化試劑盒QIAGEN tip-500純化柱為德國QIAGEN公司產(chǎn)品。質(zhì)粒純化：將VR1012/HG-MSP1-17、VR1012/TPA/HG-MSP1-17、VR1012和VR1012/TPA分別轉(zhuǎn)化新鮮制備的感受態(tài)JM109菌，大量搖菌，按QIAGEN tip-500純化柱操作指南大量純化上述質(zhì)粒，純化質(zhì)粒的純度達(dá)A260A280>1.80。免疫方法： 將純化質(zhì)粒用75%酒精洗泡消毒后

13、，溶于0.01mol/L pH7.4的PBS中，配成終濃度200g/100l和100g/100l。小鼠在每次免疫前用1%戊巴比妥納按75mg/kg體重腹腔注射麻醉，待小鼠肌肉松弛后，將質(zhì)粒注射入小鼠的兩側(cè)脛前肌和兩側(cè)股四頭肌內(nèi)，每點(diǎn)25l，每只小鼠每次免疫共注射100l。小鼠分別在0、3、6周進(jìn)行3次免疫?？贵w檢測：小鼠分別于免疫前1周和第3次免疫后2周以玻璃毛細(xì)管在尾靜脈取血，分離出血清。用間接ELISA法測定抗MSP1-17的抗體，具體參照Chang SP4的方法。用BBS（167mmol/L硼酸，134mmol/L NaCl, pH8.0）將真菌表達(dá)MSP1-17區(qū)蛋白（編碼相對(duì)分子質(zhì)量

14、為19×103蛋白，簡稱YMSP1195，由美國Kaslow DC博士惠贈(zèng)）稀釋成0.2g/ml，HG蛋白（為純化的HG基因原核表達(dá)產(chǎn)物6）稀釋成1g/ml，每孔50l包被ELISA板，室溫2h后，用BBS洗板3次，每次1min，再用含1% BSA的BBS封閉1h，用含0.5mol/L NaCl的BBS（HSBBS）洗板3次，加入50l用1% BSA/BBS 150稀釋的小鼠血清，室溫1h后，用HSBBS洗板7次，加入50l 110000稀釋度的辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG，室溫1h后，用HSBBS洗板7次后BBS洗板1次，加入100l TMB底物溶液，用DG3022酶聯(lián)儀讀取波

15、長為450nm的吸光度(A)值。瘧原蟲體外抑制試驗(yàn)：于200g/100l VR1012/HG-MSP1-17第3次免疫BALB/c小鼠后2周，摘除眼球取血，分離血清用于瘧原蟲體外抑制試驗(yàn)。海南株(FCC1/HN)惡性瘧原蟲用人“O”型RBC和在含10%AB型血清的RPMI 1640中，37，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用5%山梨醇溶液進(jìn)行兩次同步化處理（間隔40h），第2次同步化后30h將瘧原蟲稀釋成0.5%感染率。加入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔200l，再加入20l（原液和110稀釋）被試血清，于加入血清后24h和48h分別半量換液1次，在24h和72h，分別涂片，吉氏染色，鏡下計(jì)數(shù)5000個(gè)RBC

16、，計(jì)算感染率，每個(gè)被試血清設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)VR1012免疫血清對(duì)照，按下式計(jì)算原蟲生長的抑制率：統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用t檢驗(yàn)比較兩均數(shù)間差異。結(jié)果BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠分別經(jīng)100g/100l的VR1012/HG-MSP1-17三次免疫后，均產(chǎn)生了明顯的抗HG和抗MSP1-17的抗體（表1和表2）。但抗體水平均較低。為提高體液免疫反應(yīng)，BALB/c小鼠經(jīng)200g/100l的VR1012/HG-MSP1-17三次免疫后產(chǎn)生了較100g/100l略高的HG抗體(P<0.05)，其抗體水平最高達(dá)A值1.00，最低達(dá)0.130（故其標(biāo)準(zhǔn)差較大，與免疫前相比P值只能達(dá)到<0.05），

17、但抗MSP1-17的抗體無明顯提高。為比較分泌性與非分泌性核酸疫苗誘導(dǎo)的小鼠體液免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱，另一組BALB/c小鼠用同樣劑量即200g/100l的VR1012/TPA/HG-MSP1-17進(jìn)行免疫，3次免疫后小鼠產(chǎn)生了較弱的抗HG抗體(P<0.05)，沒有產(chǎn)生抗MSP1-17的抗體（表3）。用200g/100l VR1012/HG-MSP1-17免疫的BALB/c小鼠血清進(jìn)行瘧原蟲體外抑制試驗(yàn)。結(jié)果，血清明顯抑制瘧原蟲的生長（表4）。涂片觀察有大量的異常原蟲，表現(xiàn)為：胞漿著色淺淡，胞核凝聚、分散，蟲體皺縮等。VR1012免疫對(duì)照組血清無異常原蟲發(fā)現(xiàn)。表1經(jīng)100g/100l的VR10

18、12/HG-MSP1-17三次免疫的BALB/c小鼠的HG和YMSP119抗體水平Table 1. HG and MSP1-17 antibodies in the sera of BALB/c mice after immunigation for 3 times with 100g/100l of VR1012/HG-MSP1-1 per mouse each timeAntibodyGroupBefore immunizationAfter immunizationPAnti-HGVR1012/HG-MSP1-170.062±0.0230.203±0.046<0

19、.01VR10120.056±0.0320.074±0.021>0.05Anti-MSP1-17VR1012/HG-MSP1-170.060±0.0200.175±0.097<0.05VR10120.071±0.0330.058±0.027>0.05表2經(jīng)100g/100l的VR1012/HG-MSP1-17三次免疫的C57BL/6小鼠的HG和YMSP119抗體水平Table 2. HG and MSP1-17 antibodies in the sera of C57BL/6 mice after immuniza

20、tion for 3 times with 100g/100l of VR1012/HG-MSP1-17 per mouse each timeAntibodyGroupBefore immunizationAfter immunizationPAnti-HGVR1012/HG-MSP1-170.072±0.0220.228±0.055<0.01VR10120.064±0.0230.067±0.033>0.05Anti-MSP1-17VR1012/HG-MSP1-170.063±0.0180.154±0.054<0.

21、01VR10120.051±0.0340.065±0.023>0.05表3經(jīng)200g/100l的VR1012/HG-MSP1-17或VR1012/TPA/HG-MSP1-17三次免疫的BALB/c小鼠的HG和YMSP119抗體水平Table 3. HG and MSP1-17 antibodies in the sera of BALB/c mice after immunization for 3 times with 200g/100l of VR1012/HG-MSP1-1 or VR1012/TPA/HG-MSP1-17 per mouse each time

22、AntibodyGroupBefore immunizationAfter immunizationPAnti-HGVR1012/HG-MSP1-170.063±0.0230.564±0.346<0.05VR10120.074±0.0350.066±0.043>0.05VR1012/TPA/HG-MSP1-170.047±0.0210.125±0.049<0.05VR1012/TPA0.031±0.0410.043±0.028>0.05Anti-MSP1-17VR1012/HG-MSP1-1

23、70.058±0.0170.156±0.061<0.01VR10120.053±0.0280.065±0.027>0.05VR1012/TPA/HG-MSP1-170.027±0.0210.045±0.031>0.05VR1012/TPA0.044±0.0370.054±0.027>0.05討論以上結(jié)果表明，VR1012/HG-MSP1-17經(jīng)肌注免疫后可以誘導(dǎo)BALB/c小鼠的HG和MSP1-17抗體的產(chǎn)生。BALB/c小鼠經(jīng)200g/100l的VR1012/HG-MSP1-17三次免疫與

24、100g/100l三次免疫產(chǎn)生的HG抗體比較，有明顯升高，表明該抗體反應(yīng)有劑量依賴性；但抗MSP1-17的抗體無明顯變化，其原因不明。從總體來看，HG抗體較MSP1-17抗體高。有2只小鼠HG抗體表達(dá)A值為1.00，這可能是由于HG主要含有幾個(gè)T細(xì)胞表位，特別是含有來自IL-1和TT的廣譜T細(xì)胞刺激表位，有利于刺激TH細(xì)胞活化，進(jìn)而促進(jìn)抗體的產(chǎn)生。而對(duì)于HG的T細(xì)胞表位是否可以促進(jìn)MSP1-17抗體的產(chǎn)生，還有待于進(jìn)一步的研究。從免疫結(jié)果看，在同一組小鼠中有的抗體較高（0.50或0.10），有的小鼠抗體卻不高（0.130），這可能是由于肌注免疫小鼠的操作不易，致使肌注不確切的結(jié)果7。表4經(jīng)20

25、0g/100l的VR1012/HG-MSP1-17三次免疫的BALB/c小鼠的血清對(duì)惡性瘧原蟲FCC1/HN株體外生長抑制結(jié)果Table 4. Inhibition of P.f(FCC1/HN) growth by the sera of BALB/c mice after immunization for 3 times with 200g/100l VR1012/HG-MSP1-17DilutionInhibition rate (%)24h72h1137.6±8.455.41±0.511023.4±5.535.7±7.8VR1012/TPA/HG

26、-MSP1-17僅在200g/100l免疫條件下產(chǎn)生較低的HG抗體，沒有誘導(dǎo)出MSP1-17的抗體，表明非分泌性的VR1012/HG-MSP1-17較分泌性的VR1012/TPA/HG-MSP1-17具有較強(qiáng)的免疫原性。據(jù)報(bào)道，有的分泌性核酸疫苗和非分泌性核酸疫苗能誘導(dǎo)出相似的免疫反應(yīng)8；而有的分泌性核酸疫苗則比非分泌性核酸疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)強(qiáng)9，可見不同的抗原在核酸疫苗條件下表現(xiàn)不一，其中的原因還不甚明了。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，針對(duì)MSP1 17區(qū)蛋白的數(shù)個(gè)單克隆抗體可明顯的抑制裂殖子入侵紅細(xì)胞10；原核表達(dá)的約氏瘧原蟲MSP1 C端17區(qū)片段蛋白可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生完全抵抗鼠瘧攻擊的保護(hù)性免疫11，可見該

27、區(qū)表達(dá)蛋白是重要的疫苗候選抗原。原核表達(dá)的HG蛋白具有明顯的免疫原性和明顯的體外抑制瘧原蟲生長的能力6。本研究的VR1012/HG-MSP1-17誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了較強(qiáng)的抗HG和抗MSP1-17的抗體，其能明顯地抑制瘧原蟲生長，表明該構(gòu)型的DNA免疫在保護(hù)性方面有一定效果。當(dāng)然，其是否具有保護(hù)性尚需猴體試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)，仍需通過共免疫細(xì)胞因子基因或改變HG輔助MSP1-17基因的方式，進(jìn)一步增強(qiáng)HG和MSP1-17的免疫原性，從而獲得更有效的DNA疫苗。核酸疫苗的真核表達(dá)特點(diǎn)保證了MSP1 17區(qū)內(nèi)的雙硫鍵的形成，而雙硫鍵的形成是確保兩個(gè)生長因子樣結(jié)構(gòu)形成的關(guān)鍵12。故核酸疫苗對(duì)于發(fā)揮MSP1

28、 17區(qū)的作用是十分有利的。核酸疫苗具有不需象其它基因工程疫苗那樣的體外表達(dá)、純化等繁瑣工作的優(yōu)勢，又具有可誘導(dǎo)瘧疾紅內(nèi)期免疫十分重要的細(xì)胞免疫的優(yōu)點(diǎn)，故核酸疫苗用于瘧疾具有很大的潛力。該研究對(duì)于研制有效的惡性瘧原蟲紅內(nèi)期核酸疫苗是一個(gè)有益的嘗試。 基金項(xiàng)目：聯(lián)合國開發(fā)計(jì)劃署/世界銀行/世界衛(wèi)生組織熱帶病研究和培訓(xùn)特別規(guī)劃署（TDR）資助項(xiàng)目(ID No.950385)作者單位：繆軍（第四軍醫(yī)大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室）李（第四軍醫(yī)大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室）薛采芳（第四軍醫(yī)大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室）劉忠湘（第四軍醫(yī)大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室）甄榮芬（第四軍醫(yī)大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室）秦恩強(qiáng)（第四軍醫(yī)大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室）參考文獻(xiàn)

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30、瘧原蟲裂殖子表面蛋白1的17區(qū)片段基因?yàn)榛A(chǔ)構(gòu)建的復(fù)合核酸疫苗候選質(zhì)粒. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 1997, 15(6):321-325.4Chang SP, George SNH, Kato A, et al. Generalized immunological recognition of the major merozoite surface antigen (gp195) of Plasmodium falciparum.Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86:6343-6350.5Kaslow DC, Hui GSH, Kumer S. Express

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