抗CD95單克隆抗體誘導的活化T細胞凋亡時轉錄因子nur77的表達

1、    抗CD95單克隆抗體誘導的活化T細胞凋亡時轉錄因子nur77的表達        摘 要 以抗CD95的特異性單克隆抗體（CH-11）誘導人T細胞Jurkat細胞系發(fā)生凋亡，Jurkat細胞在發(fā)生凋亡過程中出現(xiàn)典型的DNA梯形片段化，以熒光染料（PI）標記的流式細胞學技術對于發(fā)生凋亡的細胞進行定量測定，證實發(fā)生凋亡的細胞百分比在各個時間點上為61435之間。以電泳泳動遷移率（EMSA）對于發(fā)生凋亡的細胞核中轉錄因子nur77的表達進行了研究，發(fā)現(xiàn)以抗CD95單克隆抗體

2、誘導的活化T細胞發(fā)生凋亡時，nur77轉錄因子表達水平有顯著提高。研究結果對了解細胞凋亡時的信號轉導與分子生物學機制具有重要意義。關鍵詞 CD95 細胞凋亡 T細胞 轉錄因子 單克隆抗體中號 R335 TRANSCRIPTION FACTOR NUR77 EXPRESSION IN APOPTO-TIC T CELLS INDUCED BY ANTI-CD95 MONOCLONAL ANTIBODYCheng Jun，Si Chongweng，Wang Qinhuan，Liu Yan，Hong Weiguo，Zhong Yanwei，Yang Jizhen（Gene Therapy Resea

3、rch Center，The 302 Hospital of PLA，Beijing 100039）Abstract The apoptotic Jurkat cells induced by anti-CD95 monoclonal antibody CH-11 were confirmed by DNA fragmentation and flow cytometry assay with PI staining61 to 435 of the cells were dying via apoptosis after induction with 10gL of anti-CD95 mon

4、oclonal antibody CH-11 for 024 hoursThe transcription factor expression in apoptotic cells was studied by the electrophoretic mobility shift assay（EMSA），indicating that nur77 expression maybe involved in apoptosis regulating process of activated T cells induced by anti-CD95 antibodyKey words CD95，Ap

5、optosis，T cells，Transcription factor，Monoclonal antibodyCD95，又稱為FasAPO-1，是許多正常和腫瘤細胞膜上表達的一種約45KDa的跨膜糖蛋白，可以介導Fas配體（FasL）或抗CD95抗體所誘發(fā)的細胞凋亡信號向胞漿和胞核中進行轉導1。由CD95跨膜信號經過在胞漿中的轉導，最終到達胞核中，對特異性轉錄因子的活性與表達進行調節(jié)，以啟動與細胞凋亡相關基因的轉錄。這是所有信號轉導通路的最終公共途徑，也是細胞凋亡作為一種細胞主動性死亡最為顯著的特征及調節(jié)機制2。本文以抗CD95的抗體誘導T細胞系的細胞凋亡，研究了此種凋亡過程中轉錄因子nur

6、77的表達。1 材料與方法1.1 細胞系與抗體 Jurkat細胞系購自美國標準培養(yǎng)物中心（ATCC），以含有10的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)?？笴D95單克隆抗體CH-11購自美國Calibiochem公司。1.2 細胞凋亡的誘導與測定 細胞培養(yǎng)的密度為1×108L，以臺盼藍排除法證實死亡細胞所占的比例小于2。以10gL的抗CD95的抗體進行誘導，在不同的時間點上誘導的細胞分為3份，一份用于DNA片段化的測定3；一份以熒光染料（PI，propi-dium iodide）染色，進行流式細胞學分析4，對發(fā)生細胞凋亡的細胞進行定量測定；第3份細胞作為提取細胞核蛋白的材料。1.3

7、 電泳泳動遷移率（EMSA）檢測轉錄因子nur77的表達 以常規(guī)方法5從誘導凋亡的Jurkat細胞中提取核蛋白，以T4多核苷酸激酶催化法對于轉錄因子nur77結合的特異性核苷酸片段進行（r-32P-dATP）末端標記，所使用的核苷酸片段的基因序列為5?-TCGAGTTTTAAAGGTCATGCTCAATTTG-3?。核蛋白與標記的核苷酸片段在冰浴條件下結合60min，以100gL的聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）進行分離，并進行放射自顯影分析。由于有nur77轉錄因子蛋白與標記探針結合，以形成較大分子量的復合物，便于與未結合核蛋白的自由核苷酸片段的區(qū)別。為證實轉錄因子nur77與上述核苷酸片段之

8、間結合的特異性，還以10、50和100倍濃度的未經標記的核苷酸片段進行競爭性結合抑制實驗。2 結果2.1 細胞凋亡及其DNA的片段化的檢測 以抗CD95分子的特異性抗體對于活化的Jurkat細胞進行誘導0、1、3、6、9、12和24h，以流式細胞技術檢測，凋亡的細胞分別為4.3、3.7、6.1、8.7、15.3、16.6和43.5，并可見到典型的DNA梯形片段化。如1所示。1抗CD95抗體（10gL）誘導Jurkat細胞不同時間點上DNA梯形片段化的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig 1DNA ladder of Jurkat cells induced by 10gL anti-CD95 antibo

9、dy with agarose gel electrophoresisLane 1 is a 100 bp DNA marker，and lanes 2，3，4，5，6，7，8 are the results after induction for 0，1，3，6，9，12 and 24 hours，respectively2.2 轉錄因子nur77在T細胞凋亡中的表達 以電泳泳動遷移率法（EMSA）對于活化T細胞受到抗CD95抗體誘導發(fā)生細胞凋亡時細胞核中轉錄因子nur77的轉錄表達進行研究。發(fā)現(xiàn)以抗CD95抗體誘導0h，即出現(xiàn)nur77轉錄因子進行特異性結合的核苷酸電泳遲滯放射自顯影條帶，

10、這是由于在加入抗CD95抗體以后，細胞的收集過程需要離心大約5min，可見以抗CD95抗體誘導Jurkat細胞以后5min之內便有nur77轉錄因子蛋白的表達。在以抗CD95抗體誘導6和9h，以及24h也有一定的nur77轉錄因子蛋白的表達，如2所示。2Jurkat 細胞凋亡時細胞核轉錄因子nur77的表達Fig 2Transcription factor nur77 expression in the apoptotic Jurkat cells induced by anti-CD95 antibodyLane 1 is untreated Jurkat cells，and lane 2，

11、3，4，5，6，7，8 are the cells induced for 0，1，3，6，9，12 and 24hours，respectively為了證實2中所檢測到的放射自顯影條帶為nur77轉錄因子核苷酸片段結合特異性的蛋白條帶，又進行了競爭性結合抑制實驗。以10，50和100倍濃度的未標記的相同核苷酸序列的探針，與同位素標記的探針進行競爭性結合抑制，這種條帶即消失。證實2所見的放射性自顯影條帶，為轉錄因子nur77與特異性核苷酸序列之間進行特異性結合的結果。競爭性結合抑制實驗的結果如3所示。3轉錄因子nur77特異性未標記探針競爭性結合抑制Fig 3Competitive inhib

12、ition with nur77-specific，unlabeled probe1：induced with CH-11 for 5 min；2：Non-induced；3：Labeled，but non-specific probe competition；4：Unlabled，non-specific probe competition；5：Unlabledlabeled101，specific probe；6：Unlabledlabeled501，specific probe；7：Unlabledlabeled1001，specific probe3 討論激活的T淋巴細胞的凋亡可以有很

13、多的信號轉導通路，至少包括CD95與其配體（FasL）6，T細胞受體（TCR）與CD3分子結合形成的復合體7，糖皮質激素及其受體8，腫瘤壞死因子與其受體（TNFR）9，鈣離子通道劑10以及放射線誘導11等。關于CD95信號轉導通路的研究，發(fā)現(xiàn)白細胞介素-1轉換酶（ICE）12，酸性鞘髓磷酯酶的激活與?；拾贝?3、顆粒酶14等的激活之間有著十分密切的關系。T細胞的凋亡，作為1種類型的主動性死亡，其特點是涉及到新基因的激活與表達。即胞外的刺激信號通過跨膜受體蛋白，再通過細胞漿，最終到達細胞核，通過轉錄因子蛋白的表達，啟動新基因的轉錄。這種新基因的轉錄產物到達胞漿以后，翻譯成具有生物學活性的蛋白質

14、，對于其凋亡過程產生影響1。因此，細胞在受到胞外信號的刺激以后，對于胞核中的轉錄因子表達的調節(jié)，是了解細胞凋亡分子生物學機制與信號轉導的1個關鍵環(huán)節(jié)。Nur77是細胞核內1種孤生類固醇受體（orphan steroid receptor）15。T細胞通過TCR通路誘導細胞凋亡過程中，可以快速誘導nur77的表達，以抗CD3抗體誘導的胸腺細胞發(fā)生凋亡時也可見到nur77的表達2。不僅如此，在小鼠成纖維細胞系NIH3T3受到有絲分裂原的刺激，神經元細胞系PC12受到有絲分裂原或分化信號的誘導以后，也能見到這種屬于類固醇受體超家族，配體依賴性的轉錄因子nur77的表達16，17。因此，nur77的表

15、達對于細胞凋亡的多種信號轉導通路，對于不同來源的細胞，都具有普遍的意義。從本文以抗CD95抗體對于活化的T細胞的細胞凋亡的研究結果來看，由CD95分子跨膜信號轉導通路，也與這種核轉錄因子的表達密切相關。與TCRCD3信號，有絲分裂原以及分化信號所誘導的nur77表達過程類似；nur77的表達在T細胞受到抗CD95抗體誘導后的5min之內即出現(xiàn)明顯的表達活性升高。這種誘導應答的速度非?？?。結合對T細胞凋亡過程中DNA片段化及流式細胞學研究結果來看，只有在抗CD95抗體誘導3h之后，才會出現(xiàn)DNA的片段化以及凋亡細胞的出現(xiàn)。由此可推斷CD95分子所介導的信號轉導，至少是部分通過對nur77轉錄因子

16、的表達來調節(jié)新基因的轉錄與細胞凋亡的過程。有關nur77的受體及其下游基因啟動子序列的結合類型，目前不很清楚，但可以肯定，關于nur77轉錄因子的研究將有助于CD95分子介導的細胞凋亡信號轉導通路的研究和了解。第一作者：男，36歲，博士，副主任醫(yī)師 作者單位：成 軍 劉 妍 洪衛(wèi)國 鐘彥偉 楊繼珍  解放軍302醫(yī)院傳染病研究所基因治療研究中心 北京 100039斯崇文王勤環(huán)  北京醫(yī)科大學第一醫(yī)院傳染病教研室 北京 100034參考文獻1  成 軍.程序性細胞死亡與疾病.北京：北京醫(yī)科大學，協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社，19972  Liu ZG，Smith

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