抗CD95單克隆抗體誘導(dǎo)的活化T細(xì)胞凋亡時(shí)轉(zhuǎn)錄因子nur77的表達(dá)

1、    抗CD95單克隆抗體誘導(dǎo)的活化T細(xì)胞凋亡時(shí)轉(zhuǎn)錄因子nur77的表達(dá)        摘 要 以抗CD95的特異性單克隆抗體（CH-11）誘導(dǎo)人T細(xì)胞Jurkat細(xì)胞系發(fā)生凋亡，Jurkat細(xì)胞在發(fā)生凋亡過(guò)程中出現(xiàn)典型的DNA梯形片段化，以熒光染料（PI）標(biāo)記的流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)對(duì)于發(fā)生凋亡的細(xì)胞進(jìn)行定量測(cè)定，證實(shí)發(fā)生凋亡的細(xì)胞百分比在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上為61435之間。以電泳泳動(dòng)遷移率（EMSA）對(duì)于發(fā)生凋亡的細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄因子nur77的表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)以抗CD95單克隆抗體

2、誘導(dǎo)的活化T細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，nur77轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平有顯著提高。研究結(jié)果對(duì)了解細(xì)胞凋亡時(shí)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與分子生物學(xué)機(jī)制具有重要意義。關(guān)鍵詞 CD95 細(xì)胞凋亡 T細(xì)胞 轉(zhuǎn)錄因子 單克隆抗體中號(hào) R335 TRANSCRIPTION FACTOR NUR77 EXPRESSION IN APOPTO-TIC T CELLS INDUCED BY ANTI-CD95 MONOCLONAL ANTIBODYCheng Jun，Si Chongweng，Wang Qinhuan，Liu Yan，Hong Weiguo，Zhong Yanwei，Yang Jizhen（Gene Therapy Resea

3、rch Center，The 302 Hospital of PLA，Beijing 100039）Abstract The apoptotic Jurkat cells induced by anti-CD95 monoclonal antibody CH-11 were confirmed by DNA fragmentation and flow cytometry assay with PI staining61 to 435 of the cells were dying via apoptosis after induction with 10gL of anti-CD95 mon

4、oclonal antibody CH-11 for 024 hoursThe transcription factor expression in apoptotic cells was studied by the electrophoretic mobility shift assay（EMSA），indicating that nur77 expression maybe involved in apoptosis regulating process of activated T cells induced by anti-CD95 antibodyKey words CD95，Ap

5、optosis，T cells，Transcription factor，Monoclonal antibodyCD95，又稱(chēng)為FasAPO-1，是許多正常和腫瘤細(xì)胞膜上表達(dá)的一種約45KDa的跨膜糖蛋白，可以介導(dǎo)Fas配體（FasL）或抗CD95抗體所誘發(fā)的細(xì)胞凋亡信號(hào)向胞漿和胞核中進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)1。由CD95跨膜信號(hào)經(jīng)過(guò)在胞漿中的轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終到達(dá)胞核中，對(duì)特異性轉(zhuǎn)錄因子的活性與表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，以啟動(dòng)與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。這是所有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的最終公共途徑，也是細(xì)胞凋亡作為一種細(xì)胞主動(dòng)性死亡最為顯著的特征及調(diào)節(jié)機(jī)制2。本文以抗CD95的抗體誘導(dǎo)T細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡，研究了此種凋亡過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因子nur

6、77的表達(dá)。1 材料與方法1.1 細(xì)胞系與抗體 Jurkat細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物中心（ATCC），以含有10的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)?？笴D95單克隆抗體CH-11購(gòu)自美國(guó)Calibiochem公司。1.2 細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)與測(cè)定 細(xì)胞培養(yǎng)的密度為1×108L，以臺(tái)盼藍(lán)排除法證實(shí)死亡細(xì)胞所占的比例小于2。以10gL的抗CD95的抗體進(jìn)行誘導(dǎo)，在不同的時(shí)間點(diǎn)上誘導(dǎo)的細(xì)胞分為3份，一份用于DNA片段化的測(cè)定3；一份以熒光染料（PI，propi-dium iodide）染色，進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)分析4，對(duì)發(fā)生細(xì)胞凋亡的細(xì)胞進(jìn)行定量測(cè)定；第3份細(xì)胞作為提取細(xì)胞核蛋白的材料。1.3

7、 電泳泳動(dòng)遷移率（EMSA）檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子nur77的表達(dá) 以常規(guī)方法5從誘導(dǎo)凋亡的Jurkat細(xì)胞中提取核蛋白，以T4多核苷酸激酶催化法對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子nur77結(jié)合的特異性核苷酸片段進(jìn)行（r-32P-dATP）末端標(biāo)記，所使用的核苷酸片段的基因序列為5?-TCGAGTTTTAAAGGTCATGCTCAATTTG-3?。核蛋白與標(biāo)記的核苷酸片段在冰浴條件下結(jié)合60min，以100gL的聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）進(jìn)行分離，并進(jìn)行放射自顯影分析。由于有nur77轉(zhuǎn)錄因子蛋白與標(biāo)記探針結(jié)合，以形成較大分子量的復(fù)合物，便于與未結(jié)合核蛋白的自由核苷酸片段的區(qū)別。為證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子nur77與上述核苷酸片段之

8、間結(jié)合的特異性，還以10、50和100倍濃度的未經(jīng)標(biāo)記的核苷酸片段進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)。2 結(jié)果2.1 細(xì)胞凋亡及其DNA的片段化的檢測(cè) 以抗CD95分子的特異性抗體對(duì)于活化的Jurkat細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)0、1、3、6、9、12和24h，以流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)，凋亡的細(xì)胞分別為4.3、3.7、6.1、8.7、15.3、16.6和43.5，并可見(jiàn)到典型的DNA梯形片段化。如1所示。1抗CD95抗體（10gL）誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)上DNA梯形片段化的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig 1DNA ladder of Jurkat cells induced by 10gL anti-CD95 antibo

9、dy with agarose gel electrophoresisLane 1 is a 100 bp DNA marker，and lanes 2，3，4，5，6，7，8 are the results after induction for 0，1，3，6，9，12 and 24 hours，respectively2.2 轉(zhuǎn)錄因子nur77在T細(xì)胞凋亡中的表達(dá) 以電泳泳動(dòng)遷移率法（EMSA）對(duì)于活化T細(xì)胞受到抗CD95抗體誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄因子nur77的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)以抗CD95抗體誘導(dǎo)0h，即出現(xiàn)nur77轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行特異性結(jié)合的核苷酸電泳遲滯放射自顯影條帶，

10、這是由于在加入抗CD95抗體以后，細(xì)胞的收集過(guò)程需要離心大約5min，可見(jiàn)以抗CD95抗體誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞以后5min之內(nèi)便有nur77轉(zhuǎn)錄因子蛋白的表達(dá)。在以抗CD95抗體誘導(dǎo)6和9h，以及24h也有一定的nur77轉(zhuǎn)錄因子蛋白的表達(dá)，如2所示。2Jurkat 細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子nur77的表達(dá)Fig 2Transcription factor nur77 expression in the apoptotic Jurkat cells induced by anti-CD95 antibodyLane 1 is untreated Jurkat cells，and lane 2，

11、3，4，5，6，7，8 are the cells induced for 0，1，3，6，9，12 and 24hours，respectively為了證實(shí)2中所檢測(cè)到的放射自顯影條帶為nur77轉(zhuǎn)錄因子核苷酸片段結(jié)合特異性的蛋白條帶，又進(jìn)行了競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)。以10，50和100倍濃度的未標(biāo)記的相同核苷酸序列的探針，與同位素標(biāo)記的探針進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制，這種條帶即消失。證實(shí)2所見(jiàn)的放射性自顯影條帶，為轉(zhuǎn)錄因子nur77與特異性核苷酸序列之間進(jìn)行特異性結(jié)合的結(jié)果。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如3所示。3轉(zhuǎn)錄因子nur77特異性未標(biāo)記探針競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制Fig 3Competitive inhib

12、ition with nur77-specific，unlabeled probe1：induced with CH-11 for 5 min；2：Non-induced；3：Labeled，but non-specific probe competition；4：Unlabled，non-specific probe competition；5：Unlabledlabeled101，specific probe；6：Unlabledlabeled501，specific probe；7：Unlabledlabeled1001，specific probe3 討論激活的T淋巴細(xì)胞的凋亡可以有很

13、多的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，至少包括CD95與其配體（FasL）6，T細(xì)胞受體（TCR）與CD3分子結(jié)合形成的復(fù)合體7，糖皮質(zhì)激素及其受體8，腫瘤壞死因子與其受體（TNFR）9，鈣離子通道劑10以及放射線誘導(dǎo)11等。關(guān)于CD95信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究，發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素-1轉(zhuǎn)換酶（ICE）12，酸性鞘髓磷酯酶的激活與?；拾贝?3、顆粒酶14等的激活之間有著十分密切的關(guān)系。T細(xì)胞的凋亡，作為1種類(lèi)型的主動(dòng)性死亡，其特點(diǎn)是涉及到新基因的激活與表達(dá)。即胞外的刺激信號(hào)通過(guò)跨膜受體蛋白，再通過(guò)細(xì)胞漿，最終到達(dá)細(xì)胞核，通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子蛋白的表達(dá)，啟動(dòng)新基因的轉(zhuǎn)錄。這種新基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物到達(dá)胞漿以后，翻譯成具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)

14、，對(duì)于其凋亡過(guò)程產(chǎn)生影響1。因此，細(xì)胞在受到胞外信號(hào)的刺激以后，對(duì)于胞核中的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的調(diào)節(jié)，是了解細(xì)胞凋亡分子生物學(xué)機(jī)制與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的1個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Nur77是細(xì)胞核內(nèi)1種孤生類(lèi)固醇受體（orphan steroid receptor）15。T細(xì)胞通過(guò)TCR通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中，可以快速誘導(dǎo)nur77的表達(dá)，以抗CD3抗體誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)也可見(jiàn)到nur77的表達(dá)2。不僅如此，在小鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3受到有絲分裂原的刺激，神經(jīng)元細(xì)胞系PC12受到有絲分裂原或分化信號(hào)的誘導(dǎo)以后，也能見(jiàn)到這種屬于類(lèi)固醇受體超家族，配體依賴(lài)性的轉(zhuǎn)錄因子nur77的表達(dá)16，17。因此，nur77的表

15、達(dá)對(duì)于細(xì)胞凋亡的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對(duì)于不同來(lái)源的細(xì)胞，都具有普遍的意義。從本文以抗CD95抗體對(duì)于活化的T細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果來(lái)看，由CD95分子跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，也與這種核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)密切相關(guān)。與TCRCD3信號(hào)，有絲分裂原以及分化信號(hào)所誘導(dǎo)的nur77表達(dá)過(guò)程類(lèi)似；nur77的表達(dá)在T細(xì)胞受到抗CD95抗體誘導(dǎo)后的5min之內(nèi)即出現(xiàn)明顯的表達(dá)活性升高。這種誘導(dǎo)應(yīng)答的速度非?？?。結(jié)合對(duì)T細(xì)胞凋亡過(guò)程中DNA片段化及流式細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果來(lái)看，只有在抗CD95抗體誘導(dǎo)3h之后，才會(huì)出現(xiàn)DNA的片段化以及凋亡細(xì)胞的出現(xiàn)。由此可推斷CD95分子所介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，至少是部分通過(guò)對(duì)nur77轉(zhuǎn)錄因子

16、的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)新基因的轉(zhuǎn)錄與細(xì)胞凋亡的過(guò)程。有關(guān)nur77的受體及其下游基因啟動(dòng)子序列的結(jié)合類(lèi)型，目前不很清楚，但可以肯定，關(guān)于nur77轉(zhuǎn)錄因子的研究將有助于CD95分子介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究和了解。第一作者：男，36歲，博士，副主任醫(yī)師 作者單位：成 軍 劉 妍 洪衛(wèi)國(guó) 鐘彥偉 楊繼珍  解放軍302醫(yī)院傳染病研究所基因治療研究中心 北京 100039斯崇文王勤環(huán)  北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院傳染病教研室 北京 100034參考文獻(xiàn)1  成 軍.程序性細(xì)胞死亡與疾病.北京：北京醫(yī)科大學(xué)，協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，19972  Liu ZG，Smith

17、 SW，McLaughin KA，et alApoptotic si-gnals delivered through the T cell receptor of a T cell hybrid require the immediate-early gene nur77Nature，1994，367：2813  Galle PR，Horman WJ，Walczak H，et alInvolvement of the CD95（APO-1Fas-receptor）and ligand in liver da-mageJ Exp Med，1995，182：12234  Tep

18、per CG，Jayadev S，Liu B，et alRole for ceramide as an endogenous mediator of Fas-induced cytotoxicityProc Natl Acad Sci USA，1995，92：84435  Okabe T，Watanabe T，Kudo AA pre-B-and B cell-specific DNA-binding protein，EBB-1，which binds to the promoter of the VpreB1 geneEur J Immunol，1992，22：376  B

19、ellgrau D，Gold D，Selawry D，et alA role for CD95 li-gand in preventing graft rejectionNature，1995，377：6307  Smith CA，Williams GT，Kinggston R，et alAntibodies to CD3T cell receptor complex induce death by apoptosis in immature T cells in thymic culturesNature，1989，337：1818  Wyllie AHGlucocort

20、icoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activationNature，1980，284：5559  Wong GHW，Goeddel DVFas antigen and p55 TNF receptor signal apoptosis through distinct pathwayJ Immunol，1994，152：175110  Rouvier E，Lucianni MF，Golstein PFas involvement in Ca2-indepe

21、ndent T cell-mediated cytotoxicityJ Exp Med，1993，177：19511  Lowe SW，Schnitt EM，Smith SW，et alP55 is regula-ted for radiationinduced apoptosis in mouse thymocytesNature，1993，362：84712  Los M，Van de Craen M，Penning LC，et alRequirement of an ICECED3 protease for FasAPO-1-media-ted apoptosisNature，1995，375：8113  Cifone MG，Maria RD，Roncaioli P，et alApoptotic si-gn