小膠質(zhì)細(xì)胞人補(bǔ)體攻膜復(fù)合物亞溶破模型制作及功能鑒定(1)

1、    小膠質(zhì)細(xì)胞人補(bǔ)體攻膜復(fù)合物亞溶破模型制作及功能鑒定(1)    】目的： 體外建立小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞補(bǔ)體攻膜復(fù)合物亞溶破模型，并進(jìn)行功能鑒定, 探討補(bǔ)體攻膜復(fù)合物( sublytic membrane attack complex, sMAC ) 對中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞的亞溶破刺激效應(yīng). 方法: 分離培養(yǎng)新生小鼠大腦皮層小膠質(zhì)細(xì)胞, 用酵母多糖激活急性期患者血清制備補(bǔ)體優(yōu)球蛋白 C56，以新鮮正常人血清 ( NHS ) 作為 C7C9 來源，體外組裝小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞 sMAC 亞溶破模型，CCK8 比色實驗確定

2、 sMAC 亞溶破劑量，激光共聚焦顯微鏡 ( LSCM )鑒定 sMAC 沉積.脫落細(xì)胞計數(shù)及臺盼藍(lán)拒染法分別判定細(xì)胞黏附力變化及脫落細(xì)胞活力. ELISA 法測定 sMAC 對小膠質(zhì)細(xì)胞 NO 和 TNF 分泌量的影響. 結(jié)果： 確定 C56 1480，NHS 120 為小膠質(zhì)細(xì)胞亞溶破補(bǔ)體量；LSCM顯示sMAC 沉積于小膠質(zhì)細(xì)胞表面； sMAC 刺激小膠質(zhì)細(xì)胞后與對照組相比細(xì)胞脫落增加 (P<0.05 )，而活力正常. 刺激后 12 h NO 及 TNF 分泌量比對照組顯著增加 (P< 0.05 )，不同時相觀察 sMAC 刺激后小膠質(zhì)細(xì)胞 TNF 分泌量均顯著高于失活 sM

3、AC (P<0.05). 結(jié)論：sMAC刺激小膠質(zhì)細(xì)胞后分泌 NO 及 TNF 增多，并且可降低小膠質(zhì)細(xì)胞黏附力而不影響細(xì)胞活力，推測 sMAC 對小膠質(zhì)細(xì)胞具有炎性刺激效應(yīng).【關(guān)鍵詞】 C56；補(bǔ)體攻膜復(fù)合物；小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；顯微鏡檢查，共焦；細(xì)胞活力; 一氧化氮；腫瘤壞死因子0引言補(bǔ)體系統(tǒng)是機(jī)體防御外侵的天然免疫屏障,由30余種血清蛋白組成，具有級聯(lián)酶促和自我調(diào)節(jié)反應(yīng)，可通過經(jīng)典或旁路途徑激活，形成膜攻擊復(fù)合物（membrane attack complex, MAC）產(chǎn)生殺傷效應(yīng). 對 MAC 的早期研究僅局限于對紅細(xì)胞的溶破，后期研究顯示，非致死量的 MAC（sublytic m

4、embrane attack complex, sMAC）結(jié)合到有核細(xì)胞可刺激細(xì)胞發(fā)生多種病理、生理變化，如產(chǎn)生氧自由基、細(xì)胞因子，誘導(dǎo)膜蛋白表達(dá)等，在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用，該效應(yīng)被稱為補(bǔ)體攻膜復(fù)合物的亞溶破刺激效應(yīng)（sublyltic effects）1. 迄今，sMAC 對內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、腎小球細(xì)胞等多種有核細(xì)胞的刺激效應(yīng)已有報道2，而對中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system， CNS）中小膠質(zhì)細(xì)胞的亞刺激效應(yīng)至今報道甚少. 我們以原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞為靶細(xì)胞, 提取人血清補(bǔ)體優(yōu)球蛋白,體外組裝小膠質(zhì)細(xì)胞 sMAC 亞溶破模型，并檢測其炎性反應(yīng), 初步探討

5、sMAC 對小膠質(zhì)細(xì)胞的亞刺激效應(yīng).1材料和方法1.1材料SPF級近交系 Balb/c 小鼠 ( 12 d ) 購自第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心. 激光共聚焦顯微鏡 TCS NT 購于德國Leica儀器公司. 小鼠抗人MAC新抗原單克隆抗體 AE11（DAKO丹麥），小鼠抗人 CD3 單克隆抗體UCHT1（eBioscience 美國），CCK8試劑盒 (Dojindo日本)，NO 檢測試劑盒 （Promega美國），TNF 檢測試劑盒 (BD美國 )，急性期患者血清取自西南醫(yī)院檢驗科；正常人血清取自10人以上義務(wù)獻(xiàn)血員.1.2方法1.2.1小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體外培養(yǎng)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞,免疫組化鑒定小

6、膠質(zhì)細(xì)胞純度，> 95%方滿足實驗求.1.2.2補(bǔ)體優(yōu)球蛋白C56 的提取及活性鑒定急性期患者血清與 4 g/L 酵母多糖，0.5 mmol/L Mg2 37作用1 h后離心，取血清用微量補(bǔ)體反應(yīng)性溶血法鑒定補(bǔ)體C56活性，收集活性樣品用 0.02 mol/L PB (pH 5.4) 透析，所得優(yōu)球蛋白沉淀溶于含 100 g/L甘油的0.01 mol/L PBS (pH 7.4) 中，即為功能純C56制品.1.2.3CCK8 比色實驗確定sMAC亞溶破劑量將小膠質(zhì)細(xì)胞以 2×108 /(L孔)接種于96孔培養(yǎng)板，漂洗后，每孔中加入含1 mmol/L EDTA無血清IMDM 養(yǎng)基

7、100 L,不同釋度功能純 C56 10 L，37 孵育 15 min，再加入120 NHS，37 孵育1 h組裝 sMAC. 每孔中加入10 L CCK8試劑，37 30 min，于 450 nm 波長處測定A值.1.2.4LSCM 鑒定sMAC小膠質(zhì)細(xì)胞上的沉積 將2×104 小膠質(zhì)細(xì)胞接種于自制蓋玻片小室，生長至80%融合，漂洗，加入亞溶破劑量C56， 37 15 min；再加入EDTANHS，冰上孵育60 min于細(xì)胞表面組裝sMAC. 固定并封閉，加入小鼠抗人110 sMAC單克隆抗體，同時設(shè)立小鼠抗人CD3 IgG 同型對照和不加一抗陰性對照，4 過夜；FITC 標(biāo)記的羊

8、抗小鼠二抗，4 1 h，漂洗后磷酸甘油封片，4 避光保存，48 h 內(nèi)用LSCM觀察.            作者：羅娜，白云，周靜然，宋敏，王艷艷，楊曉亞，許雪青，段文元，熊加祥'【關(guān)鍵詞】C56Preparation and functional         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考

9、學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。    1.2.5sMAC 刺激小膠質(zhì)細(xì)胞后脫落細(xì)胞計數(shù)及細(xì)胞存活率細(xì)胞分為未刺激，sMAC，同濃度C56，120 EDTANHS，失活sMAC共5組. 將C56與NHS于37提前混合孵育30 min，使sMAC失活. 各組細(xì)胞37孵育 24 h，收集溫育液，離心，加少量培養(yǎng)液重懸，以計數(shù)板計算脫落細(xì)胞數(shù)，同時以臺盼藍(lán)拒染法，計算細(xì)胞存活率.1.2.6sMAC對小膠質(zhì)細(xì)胞NO和TNF合成的影響細(xì)胞分組同前，37孵育12 h，收集上清，離心后檢測各組NO與TNF分泌量.統(tǒng)計學(xué)處理： 應(yīng)用SPSS

10、 10.0軟件處理，所有數(shù)據(jù)用x±s表示，組間采用t檢驗和方差分析，P<0.05為統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異.2結(jié)果2.1sMAC亞溶破模型的建立以人血清補(bǔ)體C56與NHS體外組裝小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞sMAC亞溶破模型. CCK8比色法檢測細(xì)胞溶破情況顯示： 當(dāng)C56稀釋度>1480時,sMAC活性升高，小膠質(zhì)細(xì)胞溶破增多；當(dāng)C56稀釋度<1480后, sMAC活性降低，小膠質(zhì)細(xì)胞溶破減少. 故確立 C56 1480，NHS 120 為小膠質(zhì)細(xì)胞亞溶破補(bǔ)體量.2.2LSCM鑒定sMAC 在小膠質(zhì)細(xì)胞表面沉積 以亞溶破劑量C56及EDTANHS體外組裝sMAC，LSCM 觀察可見細(xì)

11、胞膜表面 sMAC 沉積明顯（圖 1），同時小膠質(zhì)細(xì)胞膜完整性好，形態(tài)無明顯變化，提示所加入的sMAC是亞溶破劑量的sMAC.圖1激光共聚焦顯微鏡鑒定sMAC組裝LSCM ×200（略）2.3sMAC 刺激小膠質(zhì)細(xì)胞后脫落細(xì)胞計數(shù)及細(xì)胞存活率亞溶破劑量sMAC刺激細(xì)胞24 h后，細(xì)胞脫落增多 (P<0.05)；臺盼藍(lán)染色見sMAC刺激后脫落細(xì)胞大多數(shù)為存活細(xì)胞，其余對照組則大部分為死亡細(xì)胞（表 1）.由此推斷，sMAC可降低細(xì)胞黏附力，而不影響細(xì)胞活力.表1sMAC 刺激小膠質(zhì)細(xì)胞后脫落細(xì)胞計數(shù)及細(xì)胞存活率（略）aP<0.05 vs 未刺激組、C56單獨組、EDTANHS

12、組和失活sMAC組. 2.4亞溶破sMAC對小膠質(zhì)細(xì)胞NO和TNF合成的影響5 組小膠質(zhì)細(xì)胞37孵育12 h后ELISA檢測上清中NO與TNF分泌量. sMAC刺激后小膠質(zhì)細(xì)胞分泌NO與TNF顯著增高，同各對照組相差顯著(P<0.05，圖 2）.aP<0.05 vs未刺激組、C56單獨組、EDTANHS組和失活sMAC組. 圖2sMAC對小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎性因子NO與TNF的影響3討論MAC作為補(bǔ)體激活的終末因子，對不同細(xì)胞可產(chǎn)生不同效應(yīng)，其對細(xì)胞的殺傷功能主取決于C9 結(jié)合量，CD59分子可通過阻礙C9的聚集而調(diào)控MAC的組裝，是重的補(bǔ)體膜調(diào)節(jié)蛋白3，同時，有核細(xì)胞可通過內(nèi)吞等方式

13、將MAC清除，防止細(xì)胞溶破. 補(bǔ)體在進(jìn)化過程中存在高度保守性，同種和異種間補(bǔ)體可相互作用，產(chǎn)生不同的刺激效應(yīng). 如Adler等4以NHS和C56分子在大鼠腎小球系膜細(xì)胞上組裝sMAC, 刺激細(xì)胞活化產(chǎn)生活性氧自由基；Halperin等5證實人sMAC可促進(jìn)小鼠3T3細(xì)胞細(xì)胞有絲分裂和再生增加. 我們采用不同濃度人補(bǔ)體C56與NHS中C7C9 成分體外確定了小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞sMAC亞溶破劑量，LSCM驗證sMAC小膠質(zhì)細(xì)胞的沉積，成功建立了小膠質(zhì)細(xì)胞sMAC亞溶破模型，為后續(xù)功能實驗奠定了基礎(chǔ). sMAC可促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝增強(qiáng), 炎癥介質(zhì)和氧自由基大量釋放，早期可防御外侵、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定

14、，而后期則對機(jī)體產(chǎn)生損傷.小膠質(zhì)細(xì)胞是髓系來源的CNS單核細(xì)胞，對神經(jīng)系統(tǒng)炎癥修復(fù)及免疫調(diào)節(jié)起重作用. 我們用sMAC刺激小膠質(zhì)細(xì)胞后觀察細(xì)胞脫落和活力改變，結(jié)果示sMAC能使細(xì)胞脫落增加而活力不受影響，說明sMAC可降低小膠質(zhì)細(xì)胞的黏附功能，其機(jī)制可能為改變細(xì)胞外基質(zhì)成分，對細(xì)胞骨架重排的結(jié)果6. sMAC刺激小膠質(zhì)細(xì)胞12 h后檢測到細(xì)胞分泌炎性介質(zhì)NO和TNF增加，其余對照組中， EDTA抑制補(bǔ)體活化不產(chǎn)生MAC， C56單獨無炎性刺激效應(yīng)；37孵育下補(bǔ)體C7C9, S蛋白與C56可直接結(jié)合形成失活sMAC，不能與細(xì)胞結(jié)合，各組均無明顯刺激效應(yīng).NO和TNF是CNS炎性病變中重的致炎因子

15、，NO具有神經(jīng)毒性，可導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷和死亡，TNF能自分泌促進(jìn)白細(xì)胞浸潤，也可上調(diào)神經(jīng)元 MHC表達(dá)，更易受毒性T細(xì)胞攻擊；并且 TNF的分泌可進(jìn)一步誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞 NFB和 PKC通路活化，釋放NO,花生四烯酸等介質(zhì)促進(jìn)炎性爆發(fā)7-8. 本研究顯示sMAC在CNS炎癥的早期階段可能對小膠質(zhì)細(xì)胞有炎性刺激效應(yīng)，為今后探討補(bǔ)體在CNS炎性疾病中的發(fā)病機(jī)制提供了線索，但就其信號傳導(dǎo)途徑尚待進(jìn)一步研究.【參考文獻(xiàn)】1Cole DS, Morgan BP. Beyond lysis: How complement influences cell fateJ. Clin Sci, 2003,104 (

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17、J. J Immunol， 2005,174(9):5750-5757.4Adler KS, Baker PJ. Johnson RJ, et al. Complement membrane attack complex stimulates production of reactive oxygen metabolites by cultured rat mesangial cellsJ. J Clin Invest, 1986,77,762-767.5Halperin JA, Taratuska A, NicholsonWeller A. Terminal complement complex C5b9 stimulates mitogenesis in 3T3 cellsJ. J Clin Invest，1993,91,19