復方丹參在JEG-3滋養(yǎng)細胞系氧化應激中的保護作用

1、復方丹參在JEG-3滋養(yǎng)細胞系氧化應激中的保護作用                             作者：侯延慶 ，王自能，王冬菊【摘要】  目的探討復方丹參在滋養(yǎng)細胞氧化應激中的保護作用。方法用不同濃度(0，1.25，2.50，12.50 mg/ml)的復方丹參對滋養(yǎng)細胞JEG-3進行預處理后，用5

2、 mmol/L的過氧化氫(H2O2)誘導建立氧化應激模型。細胞的存活率、細胞內氧化應激水平、細胞裂解液中丙二醛(MDA)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)的活性和mRNA表達分別用噻唑鹽(MTT)法、活性氧(ROS)探針(DCFH-DA)法、化學比色和熒光定量RT-PCR檢測。結果與未加丹參組(0mg/ml)比較，經復方丹參(1.25，2.50 mg/ml)預處理的滋養(yǎng)細胞，H2O2氧化損傷后,細胞的存活數明顯升高，ROS產生及MDA含量明顯減少，SOD活性及SOD-mRNA含量升高(P<0.01)。而高濃度組(12.50 mg/ml)細胞存活數下降，ROS、MDA、SOD及mRNA值均較

3、低濃度組減少(P<0.01)。結論低濃度的復方丹參注射液對滋養(yǎng)細胞的氧化損傷有保護作用，可能通過上調SOD mRNA的轉錄及增強SOD酶活性起抗氧化作用。 【關鍵詞】  復方丹參; 氧化應激; 滋養(yǎng)細胞子癇前期(Preeclampsia,PE)嚴重威脅孕產婦和圍生兒的健康和生命,其發(fā)病機制尚不清楚。目前觀點認為PE是兩階段疾病，第1階段胎盤淺植入-胎盤灌注減少,胎盤缺血、缺氧，局部出現氧化應激。胎盤局部的氧化應激通過多種機制引發(fā)母體血管內皮的損傷和炎癥反應，導致第2階段母體胎兒綜合癥的出現13。因此胎盤滋養(yǎng)細胞的氧化應激可能是PE發(fā)病機制中兩階段聯(lián)系的首要因素4。從理論上來說，

4、應用抗氧化劑對于該病的預防和應有較好的效果。中藥復方丹參注射液是丹參、降香兩味中藥經提取精制而成，其有效成分是丹參酮,它可擴張冠狀動脈，抑制血小板聚集及直接清除氧自由基并能改善微循環(huán)而增加組織供血供氧，降香能行氣祛瘀，被廣泛應用于冠心病、心絞痛、心肌炎、肺心病、糖尿病等5，6的活血化瘀治療。由于PE屬“血瘀”的范疇,中醫(yī)臨床上?？刹捎没钛龅闹兴帉ζ溥M行治療。采用中藥丹參治療時通過改善母體內NO 、PGI2 、ET和TXA2 的病理狀況,起到一定的血管舒張作用,用藥后可使血壓明顯下降、癥狀明顯減輕7。本實驗采用滋養(yǎng)細胞來源的JEG-3 細胞在細胞水平上進行復方丹參抗氧化作用的基礎研究，為臨床

5、治療提供理論依據。1 材料與方法1.1 細胞和試劑來源JEG-3細胞株購自北京協(xié)和細胞資源中心。復方丹參注射液由正大青春寶藥業(yè)有限公司生產，批號為Z33020177,每支10 ml，每毫升含丹參和降香各1 g。RP1640培養(yǎng)基為Gibco公司產品，Trizol購自Invitrogen 公司。胎牛血清為天津TBD生產。MTT購自Sigma公司，蛋白裂解液、活性氧(ROS)、丙二醛(MAD)及超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒均購自碧云天生物技術研究所。定量PCR用酶SYBR Green PCR Master Mix 購自TOYOBO 公司，定量PCR 儀：ABI PRISM 7300 Se

6、quence Detection System，定量PCR 反應體系為ABI公司產品，紫外/可見分光光度計LAMBDA 45為PerkinElmer 公司產品，全自動(熒光)酶標儀為TZCAN-SAFIRQ-2 奧地利TZCAN公司產品。1.2 方法1.2.1 細胞培養(yǎng)JEG-3 細胞在含10 %胎牛血清的RP1640培養(yǎng)液37、5 % CO2條件下培養(yǎng)傳代,初始接種密度為5×104 /cm2，待細胞融合時,將JEG-3細胞根據所加丹參終濃度分4組(以下復方丹參簡稱DS)：對照組、DS1、DS2、DS3，DS終濃度(參照8，9)分別為0，1.25，2.50 mg/ml和12.50 m

7、g/ml。將各組JEG-3細胞用含0.1%的牛血清白蛋白的RP1640培養(yǎng)基(不含血清)培養(yǎng)24 h，次日，加入5 mmol/L H2O2共孵育3h以誘導氧化應激10。然后以PBS洗3次以備后續(xù)分析。1.2.2 MTT法檢測細胞存活率將JEG-3細胞置96孔板經復方丹參和H2O2預處理后，向各組每孔內加入5 mg/ml的 MTT 20l，置于37條件下孵育4 h，吸棄上清液，加入100l二甲基亞砜，振蕩數分鐘，用全自動酶標儀(波長為490 nm)測定每孔OD值。1.2.3 DCFH-DA法測細胞內ROS水平ROS檢測試劑盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是

8、一種利用熒光探針DCFH-DA進行活性氧檢測的試劑盒。DCFH-DA 本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內后，可以被細胞內的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內。細胞內的ROS可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光就可以知道細胞內ROS的水平。本實驗將JEG-3細胞置48孔培養(yǎng)板經DS和H2O2預處理后，實驗當天，吸除培養(yǎng)液，PBS洗滌細胞后，無血清培養(yǎng)基稀釋的終濃度為10mol/L的DCFH-DA 在37 、5 %CO2 條件下培養(yǎng)20 min，按ROS檢測試劑盒說明用熒光酶標儀測熒光密度(FI)值。1.2.4 MDA及

9、SOD活性的檢測將JEG-3細胞置25 cm2培養(yǎng)瓶經DS和H2O2預處理后，吸棄培養(yǎng)液，用碧云天生產的蛋白裂解液裂解細胞，收集裂解液，-70凍存待測。按試劑盒說明書操作，分光光度計及酶標儀檢測。1.2.5 SOD-mRNA (熒光定量RT-PCR)分析將JEG-3細胞置6孔板經DS及H2O2預處理后，吸棄培養(yǎng)液，收集細胞，加入1ml Trizol溶液，吹打混勻，使細胞充分裂解，收集裂解液，采用Trizol 一步法抽提組織總RNA。取1l RNA樣品50倍稀釋，在Beckman Coulter DU 520UV/Vis Spectrophotometer 上測定OD 值，OD260/OD280

10、的比值大于1.8，說明制備的RNA 較純,無蛋白質污染。取RNA樣品1l，1%瓊脂糖凝膠電泳80V×20min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察總RNA的5srRNA,18srRNA和28srRNA 條帶，3條條帶完整，即可證明總RNA抽提比較完整。取總RNA 1g,根據試劑盒(Promega產品)提供方法以隨機引物逆轉錄合成模板cDNA。定量PCR采用50l ABI 體系,共進行40個循環(huán),每個樣重復3次。內參片段：18SrRNA-112bp，目的片段SOD: 201bp，設計的引物：qh-SOD-F2：5'CTCAGGAGACCATTGCAT，qh-SOD-R2：5' CAGC

11、TAGCAGGATAACAGAT ,機軟件分析各反應的熒光強度,參照標準曲線得出SOD-mRNA的相對值。1.3 統(tǒng)計學處理用SPSS11統(tǒng)計軟件進行分析，所有數據以±s表示，進行方差分析。1         2 結果2.1 MTT法檢測細胞的存活數如表1所示，復方丹參注射液(1.25，2.50 mg/ml)預處理的滋養(yǎng)細胞，H2O2氧化損傷后,與對照組 (0 mg/ml)比較，隨丹參濃度增加，OD值呈上升，即細胞存活數增加。而高濃度丹參(12.50mg/ml)組與低濃度組比較，OD值下降低，各濃度組間差

12、異有顯著性(P<0.01)。2.2 細胞內ROS水平的檢測復方丹參注射液(1.25，2.50，12.5 mg/ml)預處理的滋養(yǎng)細胞，H2O2氧化損傷后，與對照組 (0 mg/ml)比較，隨丹參濃度增加，FI值呈下降趨勢，各濃度組間差異有顯著性(P<0.01)。2.3 MDA的檢測如表1所示復方丹參注射液(1.25，2.50，12.50 mg/ml)預處理的滋養(yǎng)細胞，H2O2氧化損傷后,與對照組 (0mg/ml)比較，隨丹參濃度增加，MDA值呈下降趨勢，各濃度組間差異有顯著性(P<0.01)。2.4 SOD 活性及mRNA的水平如表1所示復方丹參注射液(1.25，2.50 m

13、g/ml)預處理的滋養(yǎng)細胞，H2O2氧化損傷后,與對照組 (0 mg/ml)比較，隨丹參濃度增加，SOD活性及mRNA值呈上升趨勢，而高濃度(12.50 mg/ml)組SOD活性及mRNA值明顯下降，各濃度組間差異有顯著性(P<0.01)。SOD-RNA抽提電泳圖及擴增曲線見圖13。表1 各組細胞 ROS-FI、MTT-OD值及MDA含量及SOD活性及mRNA比較3 討論研究滋養(yǎng)細胞功能的實驗中，由于獲得和培養(yǎng)胎盤原代滋養(yǎng)細胞比較困難，并且在分離和短期應用，細胞功能可發(fā)生一些潛在的變化，因此原代滋養(yǎng)細胞在實驗中的應用受到了限制。人類滋養(yǎng)細胞來源的細胞系常用來研究滋養(yǎng)細胞的功能，現在常用于

14、滋養(yǎng)細胞功能模型的細胞來源于惡性葡萄胎葡或絨癌的細胞，如JAR，JEG-3，BeWo。這些轉化的細胞來源于滋養(yǎng)細胞，在細胞功能方面可提供許多有用的信息。本實驗應用來源于人絨癌的滋養(yǎng)細胞系JEG-3，用H2O2建立氧化應激模型，探討復方丹參的抗氧化作用。氧化應激是指體內的氧化與抗氧化失衡，并傾向于氧化。當活性氧(ROS)的產生超過了抗氧化劑的防御能力，而導致細胞的損傷。本實驗通過MTT法觀察了不同藥物濃度的復方丹參注射液對氧化損傷JEG-3細胞的保護作用。結果表明，低濃度丹參(1.25mg/ml和2.50mg/ml)在H2O2的損傷后，與不加丹參組比較，細胞存活數增加，具有保護作用，并呈現一定的

15、濃度依賴性。但濃度過高(12.50 mg/ml)，細胞存活數減少，與任香善等8，9報道的高濃度丹參(12.50 mg/ml)對血管內皮細胞仍具有保護作用結果不一致，其原因尚待研究。ROS包括H2O2、單線態(tài)氧(' O2)、超氧陰離子自由基(O2-·)及羥自由基(OH),其產生情況可反應細胞的氧化應激水平10。MDA含量可反映機體內脂質過氧化的程度，可作為估計細胞損傷程度的指標8。本實驗結果表明，預先加入低濃度(1.25mg/ml和2.50mg/ml)的丹參可降低JEG-3的氧化應激水平，減輕氧化損傷。SOD 是體內主要的自由基清除酶, 能清除超氧陰離子自由基, 保護細胞免受損

16、傷,對機體的氧化與抗氧化平衡起重要作用11。本實驗結果表明，預先加入適當濃度的丹參可以提高SOD的活性，上調SOD-mRNA的表達，增強了JEG-3細胞的抗氧化能力。但高濃度丹參組(12.50 mg/ml)SOD的活性及 SOD-mRNA的表達卻下降，可能與存活的細胞數明顯減少有關。綜上所述，適當濃度的復方丹參注射液對JEG-3細胞的氧化損傷具有保護作用，其抗氧化作用可能與SOD的活性及SOD-mRNA的表達增加有關。因此復方丹參在臨床PE中有一定的價值?！尽?#160; 1 Merviel P， Carbillon L ， Challier J C， et al. Pathophysiolo

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