單分子知識(shí)點(diǎn)

1、光漂白(photonic bleaching)是在光照條件下使其發(fā)生化學(xué)反應(yīng)或是構(gòu)象改變,而失去發(fā)熒光的特性,就是所謂的漂白.它常用于生物體內(nèi)擴(kuò)散速率常數(shù)的測(cè)定.光漂白抗性就是抗光漂白性吧我是這么理解的。下面的是搜索的關(guān)于綠色熒光蛋白_GFP的發(fā)光特性GFP吸收的光譜,最大峰值為395nm(紫外),并有一個(gè)峰值為470nm的副峰(藍(lán)光);發(fā)射光譜最大峰值為509nm(綠光),并帶有峰值為540nm的側(cè)峰(Shouder).GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽(FITC)很相似,因此為熒光素FITC設(shè)計(jì)的熒光顯微鏡濾光片組合同樣適用于GFP觀察.盡管450490nm(藍(lán)光)是GFP的副吸收峰,但由

2、于長(zhǎng)波能量低,細(xì)胞忍受能力強(qiáng),因此更適合于活體檢測(cè).GFP的性質(zhì)GFP熒光極其穩(wěn)定,在激發(fā)光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比熒光素(fluorescein)強(qiáng),特別在450490nm藍(lán)光波長(zhǎng)下更穩(wěn)定.GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光,強(qiáng)還原劑能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问?但一旦重新暴露在空氣或氧氣中,GFP熒光便立即得到恢復(fù).而一些弱還原劑并不影響GFP熒光.中度氧化劑對(duì)GFP熒光影響也不大,如生物材料的固定,脫水劑戊二酸或甲醛等.GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高,抗光漂白能力強(qiáng),因此更適用于定量測(cè)定與分析.但因?yàn)镚FP不是酶,熒光信號(hào)沒有酶學(xué)放大效

3、果,因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報(bào)告蛋白.由于GFP熒光是生物細(xì)胞的自主功能,熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物,因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報(bào)告蛋白,其作用是任何其它酶類報(bào)告蛋白無(wú)法比擬的.常用的顯微技術(shù)共聚焦顯微鏡原理：共焦顯微鏡Confocal Laser Scanning Microscope(CLSM或LSCM)在反射光的光路上加上了一塊半反半透鏡(Beam Splitter)，將已經(jīng)通過透鏡的反射光折向其它方向，在其焦點(diǎn)上有一個(gè)帶有針孔（Pinhole）的擋板，小孔就位于焦點(diǎn)處，擋板后面是一個(gè) 光電倍增管（photomultiplier tube，PMT）。可以想像，探測(cè)光焦

4、點(diǎn)前后的反射光通過這一套共焦系統(tǒng)，必不能聚焦到小孔上，會(huì)被擋板擋住。于是光度計(jì)測(cè)量的就是焦點(diǎn)處的反射光強(qiáng)度。其意義是：通過移動(dòng)透鏡系統(tǒng)可以對(duì)一個(gè)半透明的物體進(jìn)行三維掃描。共聚焦顯微鏡能提供無(wú)比精確的三維成像，以及對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)過程的精準(zhǔn)測(cè)試。 傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡使用的是場(chǎng)光源，標(biāo)本上每一點(diǎn)的圖像都會(huì)受到鄰近點(diǎn)的衍射或散射光的干擾；激光掃描共聚焦顯微鏡利用激光束經(jīng)照明針孔形成點(diǎn)光源對(duì)標(biāo)本內(nèi)焦平面的每一點(diǎn)掃描，標(biāo)本上的被照射點(diǎn)，在探測(cè)針孔處成像，由探測(cè)針孔后的光電倍增管（PMT）或冷電耦器件（cCCD）逐點(diǎn)或逐線接收，迅速在計(jì)算機(jī)監(jiān)視器屏幕上形成熒光圖像。照明針孔與探測(cè)針孔相對(duì)于物鏡焦平面是共

5、軛的，焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明針孔和發(fā)射針孔，焦平面以外的點(diǎn)不會(huì)在探測(cè)針孔處成像，這樣得到的共聚焦圖像是標(biāo)本的光學(xué)橫斷面，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點(diǎn)。共聚焦激光掃描顯微（英文Confocal laser scanning microscopy，CLSM，LCSM）是一項(xiàng)高分辨率三維光學(xué)成像技術(shù)1。主要特點(diǎn)在于其光學(xué)分層能力，即獲得特定深度下焦點(diǎn)內(nèi)的圖像。圖像通過逐點(diǎn)采集，以及之后的計(jì)算機(jī)重構(gòu)而成。因此它可以重建拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)復(fù)雜的物體。對(duì)于不透明樣品，可以進(jìn)行表面作圖，而對(duì)于透明樣品，則可以進(jìn)行內(nèi)部結(jié)構(gòu)成像。內(nèi)部結(jié)構(gòu)成像上，圖像質(zhì)量在單臺(tái)顯微鏡中就可以得到極大的提升，因?yàn)閬?lái)自樣品不同深度的信息

6、未被重疊。傳統(tǒng)顯微鏡能“看”到所有能被光投身到地方，而對(duì)于共聚焦顯微鏡，只有焦點(diǎn)處的信息被采集。實(shí)際上共聚焦激光掃描顯微是通過對(duì)焦點(diǎn)深度的控制和高度限制來(lái)實(shí)現(xiàn)的。共聚焦的原理早在1957年就由美國(guó)科學(xué)家馬文明斯基注冊(cè)為專利2，但實(shí)際上經(jīng)過三十年的時(shí)間及相應(yīng)專用激光器的發(fā)展，直至1980年代末這項(xiàng)技術(shù)才成為標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。1978年，托馬斯和克里斯托弗克萊默設(shè)計(jì)出一套激光掃描程序3。該程序采用激光聚焦的方式逐點(diǎn)掃描物體三維表面，并通過類似于掃描電鏡的計(jì)算機(jī)化手段生成圖像。這一共聚焦激光掃描顯微設(shè)計(jì)首次結(jié)合了激光掃描方法和熒光標(biāo)記的生物樣品三維探測(cè)。接下來(lái)的數(shù)十年內(nèi)，共聚焦熒光顯微發(fā)展成一項(xiàng)成熟的技術(shù)，

7、尤其受益于阿姆斯特丹大學(xué)（University of Amsterdam），來(lái)自海德堡的歐洲分子生物實(shí)驗(yàn)室（European Molecular Biology Laboratory）及其業(yè)界伙伴的共同努力。全內(nèi)反射熒光顯微鏡（total internal reflection fluorescent microscope，TIRFM），利用光線全反射后在介質(zhì)另一面產(chǎn)生衰逝波的特性，激發(fā)熒光分子以觀察熒光標(biāo)定樣品的極薄區(qū)域，觀測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍通常在200nm以下。因?yàn)榧ぐl(fā)光呈指數(shù)衰減的特性，只有極靠近全反射面的樣本區(qū)域會(huì)產(chǎn)生熒光反射，大大降低了背景光噪聲干擾觀測(cè)標(biāo)的，故此項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞表面物

8、質(zhì)的動(dòng)態(tài)觀察。1概念全內(nèi)角反射熒光顯微鏡（total internal reflection fluorescence microscope，TIRFM），利用光線全反射后在介質(zhì)另一面產(chǎn)生衰逝波的特性，激發(fā)熒光分子以觀察熒光標(biāo)定樣品的極薄區(qū)域，觀測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍通常在200 nm以下。因?yàn)榧ぐl(fā)光呈指數(shù)衰減的特性，只有極靠近全反射面的樣本區(qū)域會(huì)產(chǎn)生熒光反射，大大降低了背景光噪聲干擾觀測(cè)標(biāo)的，能幫助研究者獲得高質(zhì)量的成像質(zhì)量和可靠的觀測(cè)數(shù)據(jù)。故此項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞表面物質(zhì)的動(dòng)態(tài)觀察。2光學(xué)原理當(dāng)一束光從光密介質(zhì)進(jìn)入光疏介質(zhì)時(shí)，根據(jù)斯涅耳定律一部分光會(huì)發(fā)生折射，而一部分光會(huì)發(fā)生反射，當(dāng)入射角度不斷增大

9、，折射角也會(huì)不斷增大，當(dāng)折射角剛好達(dá)到90度時(shí)，就發(fā)生了全反射現(xiàn)象。全反射發(fā)生后，折射光有一個(gè)臨界狀態(tài)沿著折射面?zhèn)鞑ィ@部分光我們稱之為隱失波，其能量在Z軸上呈現(xiàn)指數(shù)衰減。、3技術(shù)分類TIRFM的實(shí)現(xiàn)是通過改變激光的入射角來(lái)實(shí)現(xiàn)的，按技術(shù)TIRF顯微鏡分為兩種：棱鏡型和物鏡型。棱鏡型TIRF顯微鏡采用棱鏡產(chǎn)生衰逝波，并用物鏡收集熒光成像。物鏡型TIRF顯微鏡采用大數(shù)字孔徑物鏡產(chǎn)生衰逝波，同時(shí)采用物鏡收集熒光成像。與棱鏡型TIRF顯微鏡相比，物鏡型TIRF的應(yīng)用更為廣泛。近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡是采用亞波長(zhǎng)尺度的探針在距離樣品表面幾個(gè)納米的近場(chǎng)范圍進(jìn)行掃描成像的技術(shù)。如利用孔徑在20-90n

10、m的近場(chǎng)探針在樣品上進(jìn)行掃描而同時(shí)得到分辨率高于衍射極限的形貌像和光學(xué)像的顯微鏡。傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率受到光學(xué)衍射極限影響，分辨率不超過該波長(zhǎng)尺度范圍。與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡不同的是，近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡利用亞波長(zhǎng)尺度探針，可以得到更小分辨率。雙光子激發(fā)顯微鏡雙光子激發(fā)顯微鏡是一種熒光成像技術(shù)，對(duì)活體組織能達(dá)到很高的深度，最深可達(dá)1毫米。作為多光子熒光顯微技術(shù)的一種特殊形式，它使用能激發(fā)熒光染料的紅移激發(fā)光線。每一次激發(fā)，兩個(gè)紅外光光子都會(huì)被吸收。一方面，使用紅外激發(fā)光線能減少光線在組織內(nèi)的散射；另一方面，多光子吸收背景信號(hào)會(huì)受到強(qiáng)烈抑制，因此這種成像方法能夠達(dá)到如此的深度。但是這種方法然受到衍射的限制

11、。由于雙光子激發(fā)顯微鏡具有更好的組織穿透能力，更有效的光探測(cè)能力及更少的光毒性，在與共焦顯微鏡相比時(shí)顯然是一個(gè)更好的選擇。單光子就是通常的熒光激發(fā)方式，一個(gè)光子激發(fā)一個(gè)熒光分子發(fā)光，熒光波長(zhǎng)比激發(fā)波長(zhǎng)稍微長(zhǎng)一些；雙光子就是用兩個(gè)光子激發(fā)一個(gè)熒光分子，激發(fā)光子能量小于熒光光子能量，因此激發(fā)波長(zhǎng)長(zhǎng)于熒光波長(zhǎng)。現(xiàn)在公認(rèn)的雙光子激發(fā)的用途：1. 用于用到紅外激發(fā)，穿透深度要高于單光子激發(fā)，2. 用于需要更高的激發(fā)功率，所以有效激發(fā)體積小于單光子激發(fā)，分辨率稍高一些。主要的單分子熒光技術(shù)smFRET（單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移）當(dāng)一個(gè)熒光分子（又稱為供體分子）的熒光光譜與另一個(gè)熒光分子（又稱為受體分子） 的

12、激發(fā)光譜相重疊時(shí)， 供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光， 同時(shí)供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減。FRET 程度與供、受體分子的空間距離緊密相關(guān)， 一般為710 nm 時(shí)即可發(fā)生FRET; 隨著距離延長(zhǎng)， FRET呈顯著減弱。 供體和受體之間FRET的效率，可以由E=1/1+(R/R0)exp6反映，其中R表示供體和受體之間的距離，R0表示福氏半徑，依賴供體發(fā)射譜和受體激發(fā)譜的重疊程度，以及供體和受體能量轉(zhuǎn)移的偶極子的相對(duì)方位。1發(fā)生原理熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指在兩個(gè)不同的熒光基團(tuán)中，如果一個(gè)熒光基團(tuán)（供體 Donor）的發(fā)射光譜與另一個(gè)基團(tuán)（受體 Acceptor）的吸收光譜有一定的重疊，當(dāng)這

13、兩個(gè)熒光基團(tuán)間的距離合適時(shí)（一般小于100），就可觀察到熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，即以前一種基團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)，可觀察到后一個(gè)基團(tuán)發(fā)射的熒光。簡(jiǎn)單地說，就是在供體基團(tuán)的激發(fā)狀態(tài)下由一對(duì)偶極子介導(dǎo)的能量從供體向受體轉(zhuǎn)移的過程，此過程沒有光子的參與，所以是非輻射的，供體分子被激發(fā)后，當(dāng)受體分子與供體分子相距一定距離，且供體和受體的基態(tài)及第一電子激發(fā)態(tài)兩者的振動(dòng)能級(jí)間的能量差相互適應(yīng)時(shí)，處于激發(fā)態(tài)的供體將把一部分或全部能量轉(zhuǎn)移給受體，使受體被激發(fā)，在整個(gè)能量轉(zhuǎn)移過程中，不涉及光子的發(fā)射和重新吸收。如果受體熒光量子產(chǎn)率為零，則發(fā)生能量轉(zhuǎn)移熒光熄滅；如果受體也是一種熒光發(fā)射體，則呈現(xiàn)出受體的熒光

14、，并造成次級(jí)熒光光譜的紅移。2發(fā)生條件能量供給體接受體（DA）對(duì)之間發(fā)生有效能量轉(zhuǎn)移的條件是苛刻的，主要包括：(1)能量供體的發(fā)射光譜與能量受體的吸收光譜必須重疊；(2)能量供體與能量受體的熒光生色團(tuán)必須以適當(dāng)?shù)姆绞脚帕校?3)能量供體、能量受體之間必須足夠接近，這樣發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的幾率才會(huì)高。此外，對(duì)于合適的供體、受體分子在量子產(chǎn)率、消光系數(shù)、水溶性、抗干擾能力等方面還有眾多的要求。可見，要找到一個(gè)合適的DA對(duì)是很不容易的 。熒光共振能量轉(zhuǎn)移分子馬達(dá)分子馬達(dá)（molecular motor），是美國(guó)康奈爾大學(xué)研究人員在活細(xì)胞內(nèi)的能源機(jī)制啟發(fā)下，制造出的一種馬達(dá)。這種微型馬達(dá)以三磷酸腺苷酶為基礎(chǔ)

15、，依靠為細(xì)胞內(nèi)化學(xué)反應(yīng)提供能量的高能分子三磷酸腺苷（ATP）為能源。 肌球蛋白主要功能之一是使肌肉收縮。在非肌肉組織中維持細(xì)胞的彈性，以及參與細(xì)胞質(zhì)分裂。 驅(qū)動(dòng)蛋白以微管為軌道的動(dòng)力蛋白，運(yùn)動(dòng)的極性由三磷酸腺苷水解酶（ATP水解酶）活性域在蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)中的位置決定。 動(dòng)力蛋白一般是以超分子集成體的形式存在，往微管的負(fù)極運(yùn)動(dòng)。乳糖操縱子E.coli的乳糖操縱子是原核生物基因表達(dá)調(diào)控的典型例子. 1?乳糖操縱子的結(jié)構(gòu) 大腸桿菌的乳糖操縱子含Z、Y及A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼-半乳糖苷酶、透酶、乙?；D(zhuǎn)移酶，此外還有一個(gè)操縱序列O、一個(gè)啟動(dòng)序列P及一個(gè)調(diào)節(jié)基因?；蚓幋a一種阻遏蛋白，后者與O序列結(jié)合，

16、使操縱子受阻遏而處于轉(zhuǎn)錄失活狀態(tài)。在啟動(dòng)序列P上游還有一個(gè)分解（代謝）物基因激活蛋白CAP結(jié)合位點(diǎn)，由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點(diǎn)共同構(gòu)成LAC操縱子的調(diào)控區(qū)，三個(gè)酶的編碼基因即由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表達(dá)。 2?阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié) 在沒有乳糖存在時(shí)，乳糖操縱子處于阻遏狀態(tài)。此時(shí)，基因列在P啟動(dòng)序列操縱下表達(dá)的乳糖阻遏蛋白與O序列結(jié)合，故阻斷轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。阻遏蛋白的阻遏作用并非絕對(duì)，偶有阻遏蛋白與O序列解聚。因此，每個(gè)細(xì)胞中可能會(huì)有寥寥數(shù)分子半乳糖苷酶、透酶生成。 當(dāng)有乳糖存在時(shí)，乳糖操縱子即可被誘導(dǎo)。真正的誘導(dǎo)劑并非乳糖本身。乳糖經(jīng)透酶催化、轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，再經(jīng)原先存在于細(xì)胞中的少數(shù)

17、 -半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)閯e乳糖。后者作為一種誘導(dǎo)劑分子結(jié)合阻遏蛋白，使蛋白構(gòu)型變化，導(dǎo)致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉(zhuǎn)錄，使-半乳糖苷酶分子增加 1000倍。 3?CAP的正性調(diào)節(jié) 分解代謝物基因激活蛋白 CAP是同二聚體，在其分子內(nèi)有DNA結(jié)合區(qū)及cAMP結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)沒有葡萄糖及cAMP濃度較高時(shí)，cAMP與CAP結(jié)合，這時(shí)CAP結(jié)合在乳糖啟動(dòng)序列附近的CAP位點(diǎn)，可刺激RNA轉(zhuǎn)錄活性，使之提高50倍；當(dāng)葡萄糖存在時(shí)，cAMP濃度降低，cAMP與CAP結(jié)合受阻，因此乳糖操縱子表達(dá)下降。 由此可見，對(duì)乳糖操縱子來(lái)說 CAP是正性調(diào)節(jié)因素，乳糖阻遏蛋白是負(fù)性調(diào)節(jié)因素。兩種調(diào)節(jié)機(jī)制根據(jù)存在的碳源性

18、質(zhì)及水平協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)乳糖操縱子的表達(dá)。 4?對(duì)調(diào)節(jié)機(jī)制的解釋 大腸桿菌根據(jù)碳源性質(zhì)選擇代謝方式。 倘若有葡萄糖存在時(shí)，細(xì)菌優(yōu)先選擇葡萄糖供應(yīng)能量。葡萄糖通過降低 cAMP濃度，阻礙cAMP與CAP結(jié)合而抑制乳糖操縱子轉(zhuǎn)錄，使細(xì)菌只能利用葡萄糖。 在沒有葡萄糖而只有乳糖的條件下，阻遏蛋白與 O序列解聚，CAP結(jié)合cAMP后與乳糖操縱子的CAP位點(diǎn)，激活轉(zhuǎn)錄，使得細(xì)菌利用乳糖作為能量來(lái)源。光鑷原理編輯基本原理編輯介電質(zhì)顆粒會(huì)吸引到光束聚焦點(diǎn)中心。作用于物體上力的大小與物體到光束中心的距離成正比，就像彈簧系統(tǒng)。光鑷可以通過高度聚焦激光束產(chǎn)生的力來(lái)操作納米或微米級(jí)的介電質(zhì)顆粒。高度聚焦激光束通常是通過使激

19、光通過顯微鏡物鏡得到的。聚焦后的激光光束最窄的部分（光束腰）會(huì)存在非常強(qiáng)的電場(chǎng)梯度。介電質(zhì)顆粒會(huì)被吸引至電場(chǎng)梯度最高的區(qū)域，也就是光束的中心。同時(shí)，電場(chǎng)還會(huì)在光束傳播方向上對(duì)顆粒產(chǎn)生力。這點(diǎn)可以通過動(dòng)量守恒來(lái)理解。光束中的介電質(zhì)顆粒會(huì)吸收并散射光子，于是就會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的動(dòng)量的變化。如果顆粒不在光束腰上，由于光場(chǎng)光強(qiáng)梯度（即不同區(qū)域的光強(qiáng)差異）的影響，顆粒各個(gè)方向上會(huì)受到不均勻的力將其拉向光強(qiáng)最強(qiáng)的區(qū)域，如右圖所示。 光鑷是非常精確的設(shè)備，可以將亞微米級(jí)的顆粒移動(dòng)亞納米級(jí)的距離。1 所以，光鑷常常被用于研究和操作DNA，蛋白質(zhì)，酶甚至是單個(gè)分子。在定量科學(xué)測(cè)量中，通常電介質(zhì)顆粒都會(huì)不移動(dòng)到離光束中

20、心很遠(yuǎn)的地方。當(dāng)顆粒與光束中心的距離很小時(shí)，顆粒受到的力與顆粒與光束中心的距離成正比。因此，其特性類似于普通的彈簧系統(tǒng)，遵守胡克定律.光鑷原理的細(xì)節(jié)編輯關(guān)于光鑷原理的解釋跟被作用顆粒的大小與使用激光波長(zhǎng)的關(guān)系有關(guān)。當(dāng)顆粒的大小比激光波長(zhǎng)大很多時(shí)，射線光學(xué)原理就可以解釋光鑷的原理。如果激光波長(zhǎng)比顆粒尺寸大得多時(shí)，顆粒就可以被當(dāng)做是在光場(chǎng)中的電偶極子。當(dāng)被作用物體的尺寸與激光波長(zhǎng)在同一數(shù)量級(jí)時(shí)，可以利用麥斯威爾方程組來(lái)解釋其原理。射線光學(xué)解釋編輯射線光學(xué)解釋（未聚焦激光）。當(dāng)顆粒偏離光束中心時(shí)（右圖），由于光束中心的光強(qiáng)較大，動(dòng)量的轉(zhuǎn)移造成對(duì)顆粒有一個(gè)指向光束中心的合力。當(dāng)顆粒處于光束中心時(shí)（左圖

21、），顆粒受到的橫向合力為零。但是未聚焦的激光會(huì)對(duì)顆粒造成沿著光線傳播方向的力。射線光學(xué)解釋（聚焦激光）。聚焦的激光除了可以將顆粒困在激光的中心軸上，還可以將它困在光軸上的特定位置：無(wú)論顆粒在激光聚焦點(diǎn)之前（左圖）或之后（右圖），動(dòng)量的傳遞都會(huì)對(duì)顆粒產(chǎn)生一個(gè)指向激光聚焦點(diǎn)的合力。因此，顆粒會(huì)被固定于聚焦點(diǎn)稍微偏后一點(diǎn)的位置。（稍微偏后是因?yàn)轭w粒會(huì)由于光的散射而受到沿著光傳播方向的力）當(dāng)被作用的目標(biāo)尺寸比激光波長(zhǎng)明顯大很多時(shí)，光學(xué)捕捉現(xiàn)象可以使用射線光學(xué)來(lái)解釋。如圖所示，激光中發(fā)出的光線進(jìn)入和離開顆粒時(shí)會(huì)發(fā)生折射。因此，光線離開顆粒時(shí)，其位置與其進(jìn)入顆粒時(shí)相反。由于光子本身帶有動(dòng)量，這種方向的變化

22、說明有動(dòng)量的轉(zhuǎn)移。根據(jù)牛頓第三運(yùn)動(dòng)定律，就會(huì)有一個(gè)大小相等，方向相反的動(dòng)量作用于該顆粒。通常人們利用高斯光束來(lái)進(jìn)行光學(xué)捕捉。在這種情況下，如果顆粒偏離光束中心，如圖右半部，由于光強(qiáng)較強(qiáng)的部分會(huì)比光強(qiáng)較弱的部分產(chǎn)生更大的動(dòng)量轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生更大的力，因此顆粒最后受到的合力是指向光束中心的。如果顆粒在光束的軸線上，進(jìn)入顆粒的光線會(huì)均勻地向周圍散射，造成顆粒在橫面上受到的合力為零。在這種情況下，顆粒受到的合力是沿著光線傳播方向的。軸向上，顆粒表面散射的產(chǎn)生的推力會(huì)與由于光場(chǎng)強(qiáng)度梯度產(chǎn)生的梯度力抵消，造成顆粒穩(wěn)定于軸線上束腰稍后一點(diǎn)的位置。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybrid

23、ization, FISH)是在20世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù),以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法,探針首先與某種介導(dǎo)分子(reporter molecule)結(jié)合,雜交后再通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接上熒光染料.FISH的基本原理是將DNA(或RNA)探針用特殊的核苷酸分子標(biāo)記,然后將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上,再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異性結(jié)合來(lái)檢測(cè)DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對(duì)定量分析.FISH具有安全、快速、靈敏度高、探針能長(zhǎng)期保存、能同時(shí)顯示多種顏色等優(yōu)點(diǎn),不但能

24、顯示中期分裂相,還能顯示于間期核.同時(shí)在熒光原位雜交基礎(chǔ)上又發(fā)展了多彩色熒光原位雜交技術(shù)和染色質(zhì)纖維熒光原位雜交技術(shù).。原理FISH(fluorescence in situ hybridization)技術(shù)是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)。它的基本原理是:如果被檢測(cè)的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報(bào)告分子如生物素、地高辛，可利用該報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測(cè)體系在鏡下對(duì)待測(cè)DNA進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析。實(shí)驗(yàn)流程：FISH樣本的制備

25、探針的制備探針標(biāo)記雜交（染色體顯帶）熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果分析。特點(diǎn)原位雜交的探針按標(biāo)記分子類型分為放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記。用同位素標(biāo)記的放射性探針優(yōu)勢(shì)在于對(duì)制備樣品的要求不高，可以通過延長(zhǎng)曝光時(shí)間加強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度，故較靈敏。缺點(diǎn)是探針不穩(wěn)定、自顯影時(shí)間長(zhǎng)、放射線的散射使得空間分辨率不高、及同位素操作較繁瑣等。采用熒光標(biāo)記系統(tǒng)則可克服這些不足，這就是FISH技術(shù)。FISH技術(shù)作為非放射性檢測(cè)體系，有以下特點(diǎn)。熒光漂白恢復(fù)技術(shù)熒光漂白恢復(fù)技術(shù)，研究膜蛋白和脂質(zhì)平移擴(kuò)散以及溶質(zhì)通過質(zhì)膜和在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的一種技術(shù)。包括三個(gè)步驟：熒光染料與膜成分交聯(lián)；激光照射猝滅（漂白）膜上部分熒光；檢測(cè)猝滅部位熒光再現(xiàn)速率（由于膜成分的流動(dòng)性）。熒光漂白后的