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文檔簡介

1、食品安全國家標(biāo)準食品中苯并(a)芘的測定xxxx-xx-xx實施xxxx-xx-xx發(fā)布中華人民共和國衛(wèi)生部 發(fā)布中華人民共和國衛(wèi)生部 發(fā)布1.1.1.1 2010-06-01實施2010-××-××發(fā)布 前 言本標(biāo)準代替GB/T 5009.27-2003食品中苯并(a)芘的測定及GB/T 22509-2008動植物油脂 苯并(a)芘的測定 反相高效液相色譜法。本標(biāo)準與GB/T 5009.27-2003相比,主要變化如下:對原標(biāo)準的結(jié)構(gòu)進行了修改,增加了第三法,即GB/T 22509-2008;增加了安全防護方面的內(nèi)容;增加了標(biāo)準溶液的貯存期限;更改了試

2、樣的名稱;修改了層析柱的尺寸,并與第三法一致。明確了第一法與第二法的最低檢出濃度;本標(biāo)準與GB/T 22509-2008相比,主要變化如下:對原標(biāo)準的結(jié)構(gòu)進行了修改,增加了第一法與第二法,即GB/T 5009.27-2003;修改了配制標(biāo)準貯備溶液的溶劑,使其與第一法一致;明確了配制標(biāo)準曲線溶液的方法;規(guī)定了玻璃小瓶需要配有聚四氟乙烯內(nèi)襯的密封蓋子;色譜參考條件中增加了常規(guī)的C18反相色譜柱;修改了分析結(jié)果的計算公式。食品安全國家標(biāo)準食品中苯并(a)芘的測定1 范圍本標(biāo)準規(guī)定了食品中苯并(a)芘的測定方法。本標(biāo)準第一法與第二法適用于食品中苯并(a)芘的測定,第三法適用于動植物油脂中苯并(a)芘

3、的測定;第一法與第二法屬于儀器分析法,適于精確測定,第二法屬于目視熒光法,適用于沒有熒光分光光度計的實驗室進行概略定量。第一法 熒光分光光度法2 原理試樣中苯并(a)芘經(jīng)有機溶劑提取,或皂化后提取,提取液經(jīng)液液分配或柱層析凈化,然后在乙?;癁V紙上分離,因苯并(a)芘在紫外光照射下呈藍紫色熒光斑點,將分離后有苯并(a)芘的濾紙部分剪下,用溶劑浸出后,用熒光分光光度計檢測熒光強度,通過與標(biāo)準比較進行定量。3 試劑和材料除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。3.1 試劑3.1.1 苯(C6H6):重蒸餾。3.1.2 環(huán)己烷(C6H12或石油醚,沸程30 60 )

4、:重蒸餾。3.1.3 二甲基甲酰胺(C3H7NO)或二甲基亞砜(C2H6OS)。3.1.4 無水乙醇(C2H6O):重蒸餾。3.1.5 乙醇:體積分數(shù)為95%。3.1.6 無水硫酸鈉(Na2SO4)。3.1.7 氫氧化鉀(KOH)。3.1.8 丙酮(C3H6O):重蒸餾。3.2 試劑配制3.2.1 展開劑:乙醇+二氯甲烷=2+1(體積分數(shù))。3.2.2 層析用硅鎂型吸附劑(又稱弗羅里硅土,60目100目):將硅鎂型吸附劑經(jīng)水洗四次(每次用水量為吸附劑質(zhì)量的4倍)于垂融漏斗上抽濾干后,再以等量的甲醇洗(甲醇與吸附劑量克數(shù)相等),抽濾干后,吸附劑鋪于干凈瓷盤上,在130 烘箱中干燥5 h后,裝瓶貯

5、存于干燥器內(nèi),臨用前加5%的水減活,混勻并平衡4 h以上,最好放置過夜。3.2.3 層析用氧化鋁(中性,100目200目):120活化4h,儲藏于干燥器內(nèi)備用。3.2.4 乙?;癁V紙:將中速層析用濾紙裁成20 cm×4 cm的條狀,逐條放入盛有乙?;旌弦旱?00 mL燒杯中,使濾紙充分地接觸溶液,保持溶液溫度在21 以上,時時攪拌,反應(yīng)6 h,再放置過夜。取出濾紙條,在通風(fēng)櫥內(nèi)吹干,再放入無水乙醇中浸泡4 h,取出后放在墊有濾紙的干凈白瓷盤上,在室溫下風(fēng)干壓平,蓋上白瓷盤蓋備用,一次可處理濾紙15條18條。3.3 苯并(a)芘標(biāo)準品(C20H12):CAS編號:50-32-8,純度

6、不低于99.0%。警告苯并(a)芘是一種已知的致癌物質(zhì),測定時應(yīng)特別注意安全防護。測定應(yīng)在通風(fēng)柜中進行并戴乳膠手套,盡量減少暴露。如已污染了皮膚,可以用10次氯酸鈉水溶液浸泡和洗刷。這是由于次氯酸鈉在水中能夠釋放新生態(tài)氧,其具有強烈的氧化性,可以破壞苯并(a)芘,經(jīng)反復(fù)洗凈的皮膚可以在紫外光下觀察皮膚上有無藍紫色斑點,直洗到藍色斑點消失為止。3.4 苯并(a)芘標(biāo)準溶液配制3.4.1 苯并(a)芘貯備液(100 g /mL):精密稱取10.0 mg苯并(a)芘,用苯溶解后移入100 mL棕色容量瓶中,并稀釋至刻度。4 避光保存,至少6個月內(nèi)穩(wěn)定。3.4.2 苯并(a)芘工作液(1 g /mL)

7、:吸取1.00 ml苯并(a)芘貯備液置于100 ml容量瓶中,用苯稀釋至刻度,4 避光保存,可保存1個月。3.4.3 苯并(a)芘標(biāo)準工作液(0.1 g /mL):吸取1 mL苯并(a)芘標(biāo)準工作溶液(1 g /mL)置于10 mL容量瓶中,用苯稀釋至刻度,4 避光保存,臨用前配制。4 儀器和設(shè)備4.1 索氏提取器:容量為250 mL。4.2 玻璃層析柱(參見附錄A):配有燒結(jié)玻璃墊和聚四氟乙烯旋塞。4.3 層析缸:200×100 mm。4.4 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:配有帶0.5 ml尾管的濃縮瓶。4.5 紫外光燈:帶有波長為365 nm或254 nm的濾光片。4.6 回流皂化裝置:錐形瓶磨

8、口處連接冷凝管。4.7 組織搗碎機。4.8 熒光分光光度計。5 分析步驟5.1 試樣提取5.1.1 稻谷、小麥等糧食稱取40.0 g60.0 g粉碎過的試樣,裝入濾紙筒內(nèi),用70 mL環(huán)己烷潤濕試樣,接收瓶內(nèi)裝6 g8 g氫氧化鉀、100 mL乙醇及60 mL80 mL環(huán)己烷,然后將索氏提取器接好,于90 水浴上回流提取6 h8 h,將皂化液趁熱倒入500 mL分液漏斗中,并將濾紙筒中的環(huán)己烷也從支管中倒入分液漏斗,用50 mL乙醇分兩次洗接收瓶,將洗液合并于分液漏斗。加入100 mL水,振搖提取3 min,靜置分層(約需20 min),下層液放入第二分液漏斗,往其中加入70 mL環(huán)己烷再振搖

9、提取一次,待分層后棄去下層液,將環(huán)己烷層合并于第一分液漏斗中,并用6 mL8 mL環(huán)己烷淋洗第二分液漏斗,洗液合并。用水洗滌合并后的環(huán)己烷提取液三次,每次100 mL,三次水洗液合并于原來的第二分液漏斗中,用環(huán)己烷提取兩次,每次30 mL,振搖0.5 min,分層后棄去水層液,收集環(huán)己烷液并入第一分液漏斗中,于50 60 水浴上,減壓濃縮至40 mL,加適量無水硫酸鈉脫水。5.1.2 脂肪、油和乳化脂肪制品稱取20.0 g25.0 g試樣,用100 mL環(huán)己烷分次洗入250 mL分液漏斗中,以環(huán)己烷飽和過的二甲基甲酰胺提取三次,每次40 mL,振搖1 min,合并二甲基甲酰胺提取液,用40 m

10、L經(jīng)二甲基甲酰胺飽和過的環(huán)己烷提取一次,棄去環(huán)己烷液層。二甲基甲酰胺提取液合并于預(yù)先裝有240 mL硫酸鈉溶液(20 g/L)的500 mL分液漏斗中,混勻,靜置數(shù)分鐘后,用環(huán)己烷提取兩次,每次100 mL,振搖3 min,環(huán)己烷提取液合并于第一個500 mL分液漏斗。也可用二甲基亞砜代替二甲基甲酰胺。用40 50 溫水洗滌環(huán)己烷提取液兩次,每次100 mL,振搖0.5 min,分層后棄去水層液,收集環(huán)己烷層,于50 60 水浴上減壓濃縮至40 mL,加適量無水硫酸鈉脫水。5.1.3 熏烤肉類及熏烤水產(chǎn)品等肉、魚及其制品稱取50.0 g60.0 g切碎混勻的試樣,再用無水硫酸鈉攪拌(試樣與無水

11、硫酸鈉的比例為1:1或1:2,如水分過多則需在60 左右先將試樣烘干),裝入濾紙筒內(nèi),然后將索氏提取器接好,加入100 mL環(huán)己烷于90 水浴上回流提取6 h8 h,然后將提取液倒入250 mL分液漏斗中,再用6 mL8 mL環(huán)己烷淋洗濾紙筒,洗液合并于250 mL分液漏斗中,以下按5.1.2自以“環(huán)己烷飽和過的二甲基甲酰胺提取三次”依法操作。5.1.4 蔬菜稱取100.0 g洗凈、晾干的可食部分的蔬菜,切碎放入組織搗碎機內(nèi),加150 mL丙酮,搗碎2 min。在小漏斗上加少許脫脂棉過濾,濾液移入500 mL分液漏斗中,殘渣用50 mL丙酮分數(shù)次洗滌,洗液與濾液合并,加100 mL水和100

12、mL環(huán)己烷,振搖提取2 min,靜置分層,環(huán)己烷層轉(zhuǎn)入另一500 mL分液漏斗中,水層再用100 mL環(huán)己烷分兩次提取,環(huán)己烷提取液合并于第一個分液漏斗中,再用250 mL水,分兩次振搖、洗滌,收集環(huán)己烷于50 60 水浴上減壓濃縮至25 mL,加適量無水硫酸鈉脫水。5.1.5 飲料如飲料中含二氧化碳,先在溫水浴上加溫除去。吸取50.0 mL100.0 mL試樣于500 mL分液漏斗中,加2 g氯化鈉溶解,加50 mL環(huán)己烷振搖1 min,靜置分層,水層分于第二個分液漏斗中,再用50 mL環(huán)己烷提取一次,合并環(huán)己烷提取液,每次用100 mL水振搖、洗滌兩次,收集環(huán)己烷于50 60 水浴上減壓濃

13、縮至25 mL,加適量無水硫酸鈉脫水。5.1.6 糕點類稱取50.0 g60.0 g磨碎試樣,裝于濾紙筒內(nèi),以下按5.1.1自“用70 mL環(huán)己烷濕潤試樣”起依法操作。在5.1.1、5.1.35.1.6各項操作中,均可用石油醚代替環(huán)己烷,但需將石油醚提取液蒸發(fā)至近干,殘渣用25 mL環(huán)己烷溶解。5.2 凈化于玻璃層析柱下端填入少許玻璃棉,先裝入5 cm6 cm高的氧化鋁,輕輕敲管壁使氧化鋁層填實、無空隙,頂面平齊,再同樣裝入5 cm6 cm高的硅鎂型吸附劑,上面再裝入5 cm6 cm高的無水硫酸鈉,用30 mL環(huán)己烷淋洗裝好的層析柱,待環(huán)己烷液面流下至無水硫酸鈉層時關(guān)閉活塞。將試樣環(huán)己烷提取液

14、倒入層析柱中,打開活塞,調(diào)節(jié)流速為1 mL/min,必要時可用適當(dāng)方法加壓,待環(huán)己烷液面下降至無水硫酸鈉層時,用30 mL苯洗脫,此時應(yīng)在紫外光燈下觀察,以藍紫色熒光物質(zhì)完全從氧化鋁層洗下為止,如30 mL苯不足時,可適當(dāng)增加苯量。收集苯液于帶尾管的濃縮瓶中,在50 60 水浴上減壓濃縮至0.1 mL0.5 mL(可根據(jù)試樣中苯并(a)芘含量而定,應(yīng)注意不可蒸干)。5.3 分離5.3.1 展開:在乙?;癁V紙條上的一端2 cm處,用鉛筆劃一橫線為起始線,吸取一定量凈化后的濃縮液,點于濾紙條上,用電吹風(fēng)從紙條背面吹冷風(fēng),使溶劑揮散,同時點20 L苯并(a)芘的標(biāo)準工作液(1 g /mL),點樣斑點

15、的直徑不超過3 mm。層析缸內(nèi)盛有展開劑,把濾紙條下端浸入展開劑約1 cm,蓋住蓋板,待溶劑前沿擴散至約20 cm時取出,用鉛筆記下前沿位置,陰干。展開后比移值Rf應(yīng)在0.1以下為好,否則分離程度差。5.3.2 溶解:在365 nm或254 nm紫外光燈下觀察展開后的濾紙條,用鉛筆劃出標(biāo)準苯并(a)芘及與其同一位置的試樣的藍紫色斑點,剪下此斑點分別放入小比色管中,各加4mL苯加蓋,插入50 60 水浴中不時振搖,浸泡15 min。5.4 測定將試樣及標(biāo)準斑點的苯浸出液移入熒光分光光度計的石英杯中,以365 nm為激發(fā)光波長,在365 nm460 nm波長范圍進行熒光掃描,所得熒光光譜與標(biāo)準苯并

16、(a)芘的熒光光譜比較定性。在試樣分析的同時做試劑空白,包括處理試樣所用的全部試劑同樣操作,分別讀取試樣、標(biāo)準及試劑空白于波長406 nm、411nm、401nm處的熒光強度,按基線法由式(1)計算所得的數(shù)值,為定量計算的熒光強度。 (1)6 分析結(jié)果的表述試樣中苯并(a)芘含量按公式(2)計算:(2)式中:X 試樣中苯并(a)芘的含量,單位為微克每千克(g/kg);S苯并(a)芘標(biāo)準斑點的質(zhì)量,單位為微克(g);F標(biāo)準的斑點浸出液熒光強度,單位為毫米(mm);F1試樣斑點浸出液熒光強度,單位為毫米(mm);F2試劑空白浸出液熒光強度,單位為毫米(mm);V1試樣濃縮液體積,單位為毫升(mL)

17、;V2點樣體積,單位為毫升(mL);m試樣質(zhì)量,單位為克(g)。以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示,結(jié)果保留23位有效數(shù)字(或小數(shù)點后1位)。7 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20 %。8 其他本方法最低檢出濃度為0.1 g/kg。第二法 目測比色法9 原理試樣經(jīng)提取、凈化后于乙?;癁V紙上層析分離苯并(a)芘,分離出的苯并(a)芘斑點,在波長365 nm的紫外燈下觀察,與標(biāo)準斑點進行目測比色概略定量。10 試劑同3.13.4。11 儀器同4.14.8。12 分析步驟12.1 試樣提取按5.1的方法操作。12.2 凈化按5.2的方法操作

18、。12.3 測定吸取5、10、15、20或50 L試樣濃縮液(可根據(jù)試樣中苯并(a)芘含量而定)及10、20 L苯并(a)芘標(biāo)準使用液(0.1 g /mL),點于同一條乙?;癁V紙上,按展開,取出陰干。于暗室紫外燈下目測比較,找出相當(dāng)于標(biāo)準斑點熒光強度的試樣濃縮液體積,如試樣含量太高,可稀釋后再重點,盡量使試樣濃度在兩個標(biāo)準斑點之間。13 結(jié)果計算試樣中苯并(a)芘的含量按式(3)進行計算:(3)式中:X 試樣中苯并(a)芘的含量,單位為微克每千克(g/kg);m2 試樣斑點相當(dāng)苯并(a)芘的質(zhì)量,單位為微克(g);V1 試樣濃縮總體積,單位為毫升(mL)。V2 點樣體積,單位為毫升(mL);m

19、1 試樣質(zhì)量,單位為克(g)。以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示,結(jié)果保留23位有效數(shù)字(或小數(shù)點后1位)。14 其他本方法最低檢出濃度為1 g/kg。第三法 反相高效液相色譜法15 原理樣品經(jīng)溶劑溶解,通過氧化鋁柱吸附,用洗脫試劑洗脫苯并(a)芘,用反相高效液相色譜分離,熒光檢測器檢測,根據(jù)色譜峰的保留時間定性,外標(biāo)法定量。16 試劑和材料除特殊要求外,所用試劑為分析純試劑,水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。當(dāng)使用推薦試劑以外的分析純試劑時,應(yīng)全部進行空白試驗并報告空白分析的結(jié)果。16.1 試劑16.1.1 石油醚(沸程3060)或正己烷(C6H12):每升加4 g氫氧化

20、鉀顆粒重蒸。16.1.2 乙腈(CH3CN):色譜純。16.1.3 四氫呋喃(C4H8O):色譜純。16.1.4 其他同3.1。16.2 試劑配制16.2.1 乙腈四氫呋喃混合溶液:90 mL乙腈與10 mL四氫呋喃的混和溶液。16.2.2 層析用氧化鋁(中性,100目200目):Brockmann活度級(參見附錄B),由活度為級的中性氧化鋁減活制備而成。將90 g經(jīng)450 灼燒12 h的氧化鋁放入密閉容器中降至室溫,加入10 mL水。劇烈搖動容器15 min,靜置平衡24 h,室溫下密閉避光保存。由于不同品牌氧化鋁活性存在差異,建議對質(zhì)控樣品進行測試,使氧化鋁活性滿足苯并(a)芘的回收率要求

21、。建議應(yīng)做相應(yīng)的樣品回收實驗驗證氧化鋁活性。16.3 標(biāo)準品同3.3。16.4 標(biāo)準溶液配制16.4.1 苯并(a)芘中間液(100 ng/mL、10 ng/mL):吸取1.0 mL苯并(a)芘標(biāo)準工作溶液(3.4.2)置于1 0 mL容量瓶中,用乙腈四氫呋喃混合溶液稀釋至刻度,混勻,得到濃度為100 ng/mL的苯并(a)芘中間液。相同方法把此工作液再稀釋10倍,得到濃度為10 ng/mL的工作液,4 避光保存,臨用前配制。16.4.2 標(biāo)準曲線工作液:分別吸取10 ng/mL標(biāo)準中間液0.4 ml、0.8 ml、4.0 ml于1 0 mL容量瓶中,吸取100 ng/mL標(biāo)準中間液2.0 m

22、l、4.0 ml于1 0 mL容量瓶中,用乙腈四氫呋喃混合溶液稀釋至刻度,混勻,該標(biāo)準系列濃度分別為0.4 ng/mL、0.8 ng/mL、4 ng/mL、20ng/mL、40ng/mL,臨用前配制。17 儀器和設(shè)備17.1 高效液相色譜儀,帶有熒光檢測器。17.2 玻璃小瓶:約1-2 mL,蓋子內(nèi)襯有聚四氟乙烯。17.3 其他同4.14.8。18 分析步驟18.1 樣品的凈化用玻璃燒杯稱取約0.4 g試樣,精確到1 mg,用2 mL石油醚溶液稀釋。向?qū)游鲋屑尤胍话敫叨鹊氖兔选?焖俜Q取22 g氧化鋁(16.2.2)于小燒杯中,立即轉(zhuǎn)移到層析柱中,輕輕敲打?qū)游鲋?,使氧化鋁均勻沉淀。再裝入一層

23、約30 mm高的無水硫酸鈉。打開層析柱底部的旋塞,石油醚流出至無水硫酸鈉的頂部,關(guān)閉旋塞。在層析柱出口端放置一個20 mL的量筒。向?qū)游鲋幸迫霕悠啡芤?,? mL石油醚清洗層析柱內(nèi)壁。向?qū)游鲋尤?0 mL石油醚洗脫,流速為1 mL/min,洗脫液放滿20 mL量筒后,棄去。換用圓底燒瓶收集其余洗脫液。將收集的洗脫液在65 的水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至0.5 mL1.0 mL,轉(zhuǎn)移至一個預(yù)先稱量的玻璃小瓶中。玻璃小瓶置于35 的水浴中繼續(xù)蒸發(fā),并用氮氣吹至近干(氮氣流量大約為25 mL/min)。用石油醚清洗圓底燒瓶兩次,每次1 mL,將清洗液轉(zhuǎn)移至玻璃樣品中,繼續(xù)在35 及氮氣條件下蒸發(fā)至干。稱量玻

24、璃小瓶的質(zhì)量(精確到0.1 mg),計算瓶內(nèi)殘渣的質(zhì)量,旋緊瓶蓋,4 儲存?zhèn)溆谩T?8.2各項操作中,均可用正己烷代替石油醚。18.2 儀器參考條件色譜柱:多環(huán)芳烴專用色譜柱或C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 µm);流動相:乙腈+水=880+120(體積比);流速:1.0 mL/min;熒光檢測器:發(fā)射波長406 nm(狹縫10 nm),激發(fā)波長384 nm(狹縫10 nm)。進樣量:10 µL;18.3 標(biāo)準曲線的制作將標(biāo)準系列工作液依次按上述推薦色譜條件上機測定,記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準曲線,色譜圖參見附錄C。

25、18.4 試樣溶液的測定向裝有待測試樣的玻璃小瓶中注入0.1 mL的乙腈四氫呋喃混合溶液,渦旋溶解殘渣(保證試樣液溶解的殘渣不能超過1.5 mg,若超過1.5 mg,需用四氫呋喃稀釋或重新進行凈化)。將10 µL的試樣液注入液相色譜儀進行測定。使用標(biāo)準曲線,對苯并(a)芘含量在0.1 µg/kg10 µg/kg的樣品進行定量,苯并(a)芘含量在10 µg/kg50 µg/kg的樣品應(yīng)該稀釋后進樣或減少進樣體積。19 分析結(jié)果的表述試樣中苯并(a)芘含量按公式(4)計算: (4)式中:X 試樣中苯并(a)芘的含量,單位為微克每千克(g/kg);c

26、 從標(biāo)準工作曲線得到的待測液中苯并(a)芘的濃度,單位為納克每微升(ng/mL);V 待測液體積,單位為微升(mL);m樣品質(zhì)量,單位為克(g)。以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示,結(jié)果保留23位有效數(shù)字(或小數(shù)點后1位)。20 精密度本標(biāo)準的精密度數(shù)據(jù)是根據(jù)GB/T6379.2的規(guī)定確定的,重復(fù)性和再現(xiàn)性的置信區(qū)間以95%來計算。20.1 重復(fù)性在重復(fù)性條件下,獲得的兩次獨立測試結(jié)果的絕對差值不得超過重復(fù)性限r(nóng),動植物油脂中苯并(a)芘的含量范圍及重復(fù)性方程見表1。如果差值超過重復(fù)性限,應(yīng)舍棄試驗結(jié)果并重新完成兩次單個試驗的測定。20.2 再現(xiàn)性在再現(xiàn)性條件下,獲得的兩次獨立測試結(jié)果的絕對差值不得超過再現(xiàn)性限R,動植物油脂中苯并(a)芘的含量范圍及再現(xiàn)性方程見表1。表1重復(fù)性限和再現(xiàn)性限方程油脂類別含量范圍(µg/kg)重復(fù)性限r(nóng)再現(xiàn)性限R植物油0.550.0r = 0.0843 m+0.313R= 0.10

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