Arg9人抗HBsAg單鏈抗體 EGFP融合蛋白基因的構(gòu)建、表達(dá)及活性分析(1)

1、Arg9/人抗HBsAg單鏈抗體/ EGFP融合蛋白基因的構(gòu)建、表達(dá)及活性分析(1)】 目的： 構(gòu)建帶有轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域Arg9編碼序列的R9/ScFv14/EGFP融合基因，將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，并分析表達(dá)產(chǎn)物與HBsAg的結(jié)合活性. 方法： 設(shè)計引物，將Arg9的編碼序列引入單鏈抗體基因的5端，PCR擴(kuò)增后獲得帶有Arg9編碼序列的ScFv14基因，將PCR產(chǎn)物連入pMD18T載體，進(jìn)行序列測定. 將測序正確的ScFv14基因和R9/ScFv14基因分別與EGFP基因連接后轉(zhuǎn)化入原核表達(dá)載體pET32a，獲得ScFv14/EGFP和R9/ScFv14/EGFP兩種融合基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化

2、大腸桿菌BL21(DE3)LysS，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDSPAGE分析，并用間接ELISA方法檢測其與HBsAg的親和活性. 結(jié)果： 經(jīng)酶切鑒定及測序證實ScFv14/EGFP融合基因和R9/ScFv14/EGFP融合基因序列完全正確.SDSPAGE分析表明兩種融合基因在大腸桿菌BL21中成功獲得表達(dá)，表達(dá)量分別占菌體總蛋白的20% 和25%.間接ELISA檢測證實所表達(dá)的ScFv14/EGFP融合蛋白和R9/ScFv14/EGFP融合蛋白均具有HBsAg結(jié)合活性. 結(jié)論： 成功構(gòu)建了帶有轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域Arg9編碼序列的R9/ScFv14/EGFP融合基因，并在大腸桿菌BL21中

3、成功表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物ScFv14/EGFP和R9/ScFv14/EGFP均具有與抗原HBsAg特異性結(jié)合的活性.【關(guān)鍵詞】 肝炎，乙型；肝炎表面抗原，乙型；ScFv；Arg90引言單鏈抗體（ScFv）是抗體重鏈可變區(qū)(VH)與輕鏈可變區(qū)(VL)通過一段連接肽(linker)連接而成的一種小分子抗體.其分子質(zhì)量僅為完整抗體的1/6，不僅能較好地保持抗原結(jié)合能力，并且具有分子質(zhì)量小、穿透力強、半衰期短、免疫原性低、制備流程簡單等特點，更有利于體內(nèi)應(yīng)用1-3. 綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP) 是從水母中分離出來的一種發(fā)光蛋白,可在A450 nm490 nm

4、的藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，使用普通熒光顯微鏡即可進(jìn)行觀察.是近年來細(xì)胞生物領(lǐng)域中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記性蛋白質(zhì)之一.EGFP為一種突變型GFP，所產(chǎn)生的熒光比野生型GFP增強，可作為標(biāo)簽用于檢測目的蛋白及指示目的蛋白的定位. ScFv與效應(yīng)分子組成的融合蛋白能否高效地內(nèi)化入細(xì)胞對于其生物學(xué)功能的發(fā)揮具有非常關(guān)鍵的作用. Arg9是一個九聚精氨酸的短肽序列，是蛋白轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域（PTDs）的一種，它能夠?qū)⑴c之融合的蛋白攜帶入細(xì)胞內(nèi)4. 我們將抗HBsAg的單鏈抗體（ScFv14）基因5與EGFP基因融合，并將Arg9編碼序列融合到ScFv14/EGFP基因的5端，構(gòu)建帶有轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域Arg9的R9/ScF

5、v14/EGFP融合蛋白基因，將它們在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對表達(dá)產(chǎn)物的親和活性進(jìn)行了分析.1材料和方法1.1材料含有編碼人抗HBsAg單鏈抗體ScFv14基因的載體pUC19ScFv14、大腸桿菌E.coli.DH5株和原核表達(dá)載體pET32a（第四軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室構(gòu)建5并保存）；EGFP融合蛋白表達(dá)載體pEGFPN3（Clontech公司）；DNA Marker, T4 DNA Ligase, pMD18T vector和限制性內(nèi)切酶BamH, EcoR, Not（TaKaRa公司）；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒（上海華舜公司）；Werstern blot 顯影液（P

6、ierce公司）.1.2方法1.2.1引物的設(shè)計與合成根據(jù)ScFv14基因序列，設(shè)計引物擴(kuò)增ScFv14基因，并設(shè)計引物將Arg9的編碼序列引入ScFv14基因的5端，引物序列如下：14F 5 TTTGAATTCATGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC 3；14R9F 5 TTTGAATTCATGAGACGCAGGAGACGCAGGCGGAGACGGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC 3； L3 5 TTTGGATCCTCGATTGATTTCCACCTTGGT 3. 其中劃線部分為九聚精氨酸的編碼序列.1.2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定以pUC19ScFv14為模板，分別以14F，L3

7、和14R9F，L3為引物擴(kuò)增ScFv14基因和R9/ScFv14基因.反應(yīng)條件：95 35 s， 55 45 s，72 1 min，共進(jìn)行25個循環(huán).產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,膠回收試劑盒回收. 回收產(chǎn)物分別連入pMD18T載體,轉(zhuǎn)化E.coli.DH5宿主菌，挑取單克隆,提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，陽性克隆命名為pMD18TScFv14和pMD18TR9/ScFv14，送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司測序.將測序正確的pMD18TScFv14和pMD18TR9/ScFv14用限制性內(nèi)切酶EcoR和BamH進(jìn)行酶切，得到ScFv14和R9/ScFv14基因片段，將pEGFPN3用BamH和Not

8、酶切，得到EGFP基因片段.分別將ScFv14和R9/ScFv14基因與EGFP基因在16條件下連接4 h后，再連入經(jīng)EcoR和Not酶切的表達(dá)載體pET32a中，轉(zhuǎn)化E.coli.DH5后，篩選陽性克隆酶切鑒定.鑒定正確的質(zhì)粒分別命名為pET32aScFv14/EGFP和pET32aR9/ScFv14/EGFP.1.2.3融合基因的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定將pET32aScFv14/EGFP和pET32aR9/ScFv14/EGFP質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入E .coli.BL21，挑取單克隆菌落接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，220 r/min， 37培養(yǎng)過夜，次日以1100轉(zhuǎn)接，在220 r/min, 3

9、7條件下振蕩培養(yǎng)至A600 nm=0.40.6,加入IPTG至終濃度為1 mmol/L,誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h，取1 mL誘導(dǎo)菌液離心，收集菌體，進(jìn)行SDSPAGE分析.另取5 mL誘導(dǎo)菌液離心，收集菌體，以0.2 mol/L的TrisHCl(pH=8.0)重懸，超聲裂解后，離心取上清，沉淀用0.2 mol/L TrisHCl(pH=7.4)重懸，取上清和沉淀進(jìn)行SDSPAGE分析.作者：薛茜，溫偉紅，孟艷玲，張勇，張巍，王濤，張瑞，楊安鋼 【關(guān)鍵詞】肝炎,乙型；肝炎表面抗原,乙型；ScFv；Arg9【Abs 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請

10、不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。1.2.4重組融合蛋白的Western blot分析將誘導(dǎo)菌進(jìn)行SDSPAGE 分離蛋白質(zhì)，用半干式電轉(zhuǎn)儀將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC）上，經(jīng)50 g/L的脫脂奶粉封閉1 h，用鼠抗EGFP mAb（11000稀釋），4孵育過夜，用TBST洗膜6次，每次5 min,再加入辣根過氧化酶HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，室溫孵育1 h, 用TBST洗膜6次，每次5 min,按顯影液說明加入顯影液，用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測.1.2.5融合蛋白親和活性的ELISA檢測用5 mg/L HBsAg包被ELIS

11、A板,每孔100 L, 4過夜. 加入不同稀釋度的細(xì)菌裂解上清,每孔100 L, 37孵育1 h. 設(shè)空白和陰性對照. 洗滌后,加入鼠抗EGFP mAb（11000稀釋）,37孵育1 h. 洗滌后再加入辣根過氧化酶HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG, 37孵育1 h. 最后各孔加入新鮮配制的ABTS顯色液100 L, 37孵育30 min,終止反應(yīng).以酶標(biāo)儀測定各孔A410 nm值.2結(jié)果2.1目的基因擴(kuò)增和酶切鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳證實分別擴(kuò)增出大小約為750 bp和780 bp的條帶(圖1A) .測序結(jié)果證實擴(kuò)增的ScFv14和R9/ScFv14基因完全正確. 用EcoR和B

12、amH雙酶切鑒定，得到大小約為750 bp和780 bp的條帶，與預(yù)期長度相符（圖1B）.2.2原核表達(dá)載體的酶切鑒定重組載體pET32aScFv14/EGFP和pET32aR9/ScFv14/EGFP用限制性內(nèi)切酶EcoR和BamH雙酶切ScFv14和R9/ScFv14基因，分別得到大小約為750 bp和780 bp的條帶；用EcoR和Not雙酶切融合蛋白基因，分別得到大小約為1490 bp和1520 bp的條帶,與預(yù)期長度相符（圖2）.2.3重組融合蛋白表達(dá)的鑒定和分析SDSPAGE分析顯示，與未誘導(dǎo)菌相比，兩種誘導(dǎo)菌在Mr約為73 ku處均有一特異性蛋白條帶，同預(yù)期的大小相符.經(jīng)凝膠成像

13、系統(tǒng)掃描顯示，它們的表達(dá)量分別約占菌體總蛋白的 20%和25%（圖3）. 取IPTG誘導(dǎo)后的菌液進(jìn)行超聲裂解，分別取其裂解上清和沉淀進(jìn)行SDSPAGE分析，電泳結(jié)果顯示兩種目的蛋白均主存在于誘導(dǎo)菌的裂解上清中（圖4）.2.4重組融合蛋白的Western blot分析在Mr約為73 ku處有一特異性蛋白條帶(圖5)，與SDSPAGE分析結(jié)果相符，說明該誘導(dǎo)蛋白為目的蛋白.2.5融合蛋白親和活性的ELISA檢測間接ELISA檢測結(jié)果顯示表達(dá)的兩種ScFv14/EGFP融合蛋白均能與HBsAg抗原特異性結(jié)合 (圖6), 二者相比，R9/ScFv14/EGFP 與HBsAg的親和力稍大于ScFv14/

14、EGFP與HBsAg，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）. 2，4: 未誘導(dǎo)的pET32a和pET32aR9/ScFv14/EGFP的全菌蛋白質(zhì)； 3，5： IPTG 誘導(dǎo)的pET32a和pET32aR9/ScFv14/EGFP的全菌蛋白質(zhì). B1: marker； 2，4: 未誘導(dǎo)的pET32a和pET32aScFv14/EGFP的全菌蛋白質(zhì)； 3，5： IPTG 誘導(dǎo)的pET32a和pET32aScFv14/EGFP的全菌蛋白質(zhì).3討論天然Fv片段中VH和VL為非共價性結(jié)合，是抗體分子中保留抗原結(jié)合部位的最小功能片段.將VH和VL用一個小肽(linker)連接起來，即單鏈抗體. 單鏈抗體易與

15、效應(yīng)分子相連，與其他蛋白融合，可得到具有多種生物學(xué)功能的融合蛋白.近年來，以單鏈抗體為導(dǎo)向物的免疫融合蛋白在抗腫瘤、抗病毒等的治療和診斷方面展現(xiàn)了廣闊的前景，引起了人們的廣泛關(guān)注.由單鏈抗體與毒素、酶、細(xì)胞因子等的基因相連的免疫融合蛋白，可以結(jié)合到特定的靶部位，高效的發(fā)揮生物學(xué)功能6-7 .蛋白轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域（PTDs）是一類能夠介導(dǎo)與之融合的蛋白內(nèi)化入細(xì)胞的短肽.它們作為內(nèi)化的工具被廣泛應(yīng)用，它不僅可以使多肽、多聚核苷酸、極小微粒進(jìn)入細(xì)胞，甚至可以在體內(nèi)介導(dǎo)蛋白質(zhì)的內(nèi)化8 . Futaki等9發(fā)現(xiàn)多種富含精氨酸的肽都具有轉(zhuǎn)膜作用.在比較了不同長度的多聚精氨酸對內(nèi)化效率的影響之后，他們發(fā)現(xiàn)八聚精氨

16、酸（Arg8）的內(nèi)化效果最好 . Wender等10發(fā)現(xiàn)Arg9具有更高效的內(nèi)化作用.我們采用轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域Arg9來增強融合蛋白的轉(zhuǎn)膜功能，以期使產(chǎn)物具有更高的內(nèi)化效率.我們構(gòu)建了帶有轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域Arg9的R9/ScFv14/EGFP融合基因表達(dá)載體，并將該表達(dá)載體在E .coli.BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDSPAGE分析表明融合蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)，并且主在大腸桿菌的上清中表達(dá)，這就避免了變性復(fù)性的復(fù)雜過程，直接就可以獲得具有生物學(xué)功能的活性蛋白.間接ELISA檢測也證實融合有Arg9的ScFv14/EGFP融合蛋白與不帶有Arg9的ScFv14/EGFP融合蛋白對HBsAg具有相近的親和

17、活性.這為進(jìn)一步研究Arg9對免疫融合蛋白內(nèi)化的促進(jìn)作用以及為乙型病毒性肝炎的靶向治療研究提供了實驗基礎(chǔ).【參考文獻(xiàn)】1 Kasuya K, Boyer JL, Tan Y, et al. Passive immunotherapy for anthrax toxin mediated by an adenovirus expressing an antiprotective antigen singlechain antibody J. Mol Ther, 2005,11(2):237-244.2 Neve RM, Nielsen UB, Kirpotin DB, et al. Biolog

18、ical effects of antiErbB2 single chain antibodies selected for internalizing function J. Biochem Biophys Res Commun, 2001,280(1):274-279.3 Rosana B, Michel M, Jules Mattes. Intracellular accumulation of the antiCD20 antibody 1F5 in Blymphoma cells J. Clin Cancer Res, 2002,8(8):2701-2713.4 Hea D, Yan

19、gb H, Lina Q, et al. Arg9peptide facilitates the internalization of an antiCEA immunotoxin and potentiates its specific cytotoxicity to target cells J. Int J Biochem Cell Biol, 2005,37(1):192-205.5 Wen WH, Zhao J, Yu CJ, et al. Construction of singlechain Fv Gene of AntiHBsAg and its expression in C

20、OS7 cells J . Chin J Cell Mol Immunol, 2003,19（2）:163-167.6 Schnell R, Vitetta E, Schindler J, et al. Treatment of refractory Hodgkins lymphoma patients with an antiCD25 ricin Achain immunotoxin J. Leukemia, 2000,14(13):129-135.7 Doronina SO, Toki BE, Torgov MY, et al. Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy J. Nat Biotechnol, 2003,21(7):778-784.8 Mai JC, Shen H, Watkins SC, et al. Efficiency of protein transduction is