高效液相色譜法測(cè)定樂(lè)山梔子熊果酸含量

1、高效液相色譜法測(cè)定樂(lè)山梔子熊果酸含量                作者：蒲清榮，唐燦，張彥燕，李云鵬，趙劍，劉智權(quán)【摘要】  目的為控制樂(lè)山梔子的質(zhì)量，建立高效液相色譜法測(cè)定樂(lè)山梔子中熊果酸含量的方法。方法采用高效液相色譜法，以熊果酸為化學(xué)對(duì)照品，固定相：UltimateTM C18鍵合硅膠柱(4.6 mm×250 mm,5 m)，流動(dòng)相：甲醇水冰醋酸三乙胺（90100.030.06），流速0.6 ml?min-1，溫度25

2、，波長(zhǎng)210 nm測(cè)定樂(lè)山梔子熊果酸含量。結(jié)果熊果酸在0.13.0 g范圍內(nèi)峰面積A與其質(zhì)量M呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其回歸方程為： A12 954.882 9452 850.960 3 M，r0.999 6，n7；3批樂(lè)山梔子中熊果酸的含量分別為（0.255 5±0.001 6）mg?g-1藥材，RSD0.622 1%，n4；（0.265 825±0.003 491）mg?g-1藥材，RSD1.313%，n4；（0.258 875±0.006 198）mg?g-1藥材，RSD2.394%，n4；精密度實(shí)驗(yàn)RSD1.754%，儀器精密度良好；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)RSD3.493

3、%,在3.5 h測(cè)定熊果酸的含量是穩(wěn)定的；重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)RSD0.905 1%，平均回收率101.9%。結(jié)論高效液相色譜法適合樂(lè)山梔子中熊果酸的含量測(cè)定，該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果穩(wěn)定，精密度、重現(xiàn)性、回收率較好，值得推廣。 【關(guān)鍵詞】  樂(lè)山梔子；熊果酸；含量測(cè)定；高效液相色譜法Abstract：ObjectiveTo establish the method of determining the cotent of ursolic acid in Fructus Gardeniae by HPLC.  MethodsHPLC was used to determine the c

4、ontent of Ursolic acid in Fructus Gardenice ursolic acid as the standard, Solid phase: UltimateTM C18 (4.6 mm×250 mm，5   m), Liquid phaseMethyiaicoholWaterAcetic acidTriethylaminum (90100.030.06), Flow rate：0.6ml?min-1，temperature：25,wavelength：210 nm.ResultsThe calibration curve was

5、linear in the range of 0.13.0g, and the return formula was A12954.882 9452 850.960 3 M, r=0.999 6,n7,  the contents of ursolic acid in Frctus Cardeniae were （0.255 5±0.0016）mg?g-1，RSD0.622 1%，n4；（0.265 825±0.003 491 ）mg?g-1，RSD1.313%，n4；（0.258 875±0.006 198）mg?g-1，RSD2.394%，n4, r

6、espectively. Precision RSD1.754%,stablity RSD%3.493，repeatability RSD0.9051%，recovery rate was 101.9%.ConclusionHPLC is suitable for the determination of ursolic acid in Fructus Gardeniae from Leshan city. This method is simple, the result is stable and has good repeatability,recovery and precision.

7、 It can be widely used for the quality control of Fructus Gardeniae.Key words：Fructus Gardeniae from Leshan city；  Ursolic acid;  Content determination；  HPLC    梔子為茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實(shí)，主產(chǎn)于浙江、四川、江西、重慶、湖北等省。梔子具有瀉火除煩、清熱、涼血解毒之功效，用于熱病心煩、黃疸、尿赤、血淋澀痛、血熱吐衄、目

8、赤腫痛、火毒瘡癰等證。根據(jù)現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，熊果酸為梔子重要有效成分，具有顯著而迅速降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶，消退黃疸，增進(jìn)食欲和恢復(fù)肝功能的作用，這在茵梔黃注射液、茵陳蒿湯等方劑中得到廣泛的應(yīng)用。梔子治療急性黃疸型肝炎、病毒性肝炎主要是通過(guò)其有效成分熊果酸實(shí)現(xiàn)的,熊果酸是梔子利膽退黃、抗病毒性肝炎的主要有效成分。梔子熊果酸還具有解熱降溫、抗炎、抗腫瘤等活性。有報(bào)道表明，梔子苷的生理活性有限，其利膽作用、保護(hù)肝損傷、降低轉(zhuǎn)氨酶方面均不及梔子中熊果酸明顯，而且梔子苷分子中雙鍵性質(zhì)活潑，不穩(wěn)定，易發(fā)生反應(yīng)。相比而言，梔子熊果酸受熱更穩(wěn)定，因此控制梔子熊果酸含量具有非常重要的質(zhì)量評(píng)價(jià)意義16。本研究通過(guò)高效液

9、相色譜法測(cè)定樂(lè)山梔子熊果酸含量，為建立樂(lè)山梔子質(zhì)量新標(biāo)準(zhǔn)提供參考。1 儀器與材料    SSI高效液相色譜儀；UltimateTM C18鍵合硅膠柱(4.6 mm×250 mm,5 m)；AS3120A Ultrasonic Cleaner；AP-01P真空泵；Haier BCD-176DA電冰箱；SHH V21型長(zhǎng)風(fēng)三用電熱恒溫水浴箱；ZK072型電熱真空干燥箱；RE-52B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；AS 701KDT Ultrasonic Cleaner；UV-9200型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)；FA1104W電子天平； Sh10A型水份快速測(cè)定儀；50目分樣篩；

10、Kodak Easy share Z7590數(shù)位相機(jī)；CASIO fx-4800p電子計(jì)算器；冰醋酸、甲醇、三乙胺為分析純，色譜純甲醇；熊果酸化學(xué)對(duì)照品（110742-200516,約20mg,供含量測(cè)定用）（中國(guó)藥品生物制品檢定所）、梔子產(chǎn)自四川樂(lè)山（經(jīng)課題組鑒定為茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實(shí)）。2 方法與結(jié)果2.1 色譜條件固定相：UltimateTM C18鍵合硅膠柱(4.6 mm×250 mm,5 m)；流動(dòng)相為甲醇水冰醋酸三乙胺（90100.030.06）；流速0.6 ml?min-1；溫度25；波長(zhǎng)210 nm7。2.2

11、 梔子熊果酸提取條件優(yōu)選以藥材粒徑、甲醇加入量、超聲提取時(shí)間、超聲提取次數(shù)4因素3水平，以熊果酸收率為指標(biāo)，選用L9（34）正交表優(yōu)選梔子熊果酸提取條件為：梔子藥材粉碎為50目粉末，加入甲醇量為藥材量的5倍，每次超聲提取60 min，超聲提取3次，可使熊果酸收得率達(dá)到最大，且經(jīng)濟(jì)合理，將另文報(bào)道。2.3 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制8精密稱取熊果酸化學(xué)對(duì)照品2.0 mg（60減壓干燥24 h），用無(wú)水甲醇定容于10 ml容量瓶中，即得0.2 mg?ml-1的熊果酸對(duì)照品溶液。熊果酸在0.13.0 g范圍內(nèi)峰面積A與其質(zhì)量M呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其回歸方程為：A12 954.882 9452 850.960

12、 3 M， r0.999 6，n7。2.4  精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取上述熊果酸對(duì)照品溶液10 l，其積分面積RSD1.754%，n5，表明該方法、該儀器測(cè)定熊果酸精密度符合要求。2.5  穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取上述熊果酸對(duì)照品溶液10 l，每隔30 min測(cè)定1次，其積分面積RSD3.493%，n5。表明熊果酸用該方法在該儀器上3.5 h內(nèi)測(cè)定結(jié)果較穩(wěn)定，符合要求。2.6  梔子熊果酸含量測(cè)定重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)照前面“2.2”項(xiàng)梔子熊果酸的提取工藝，測(cè)得梔子熊果酸含量RSD0.905 1%，表明該方法重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)符合要求。2.7  梔子熊果酸加樣回收率實(shí)驗(yàn)照前面“2.2”

13、項(xiàng)梔子熊果酸的提取工藝提取，取該溶液2 ml，加入上述熊果酸對(duì)照品溶液0.3 ml，平均加樣回收率為101.9%，表明該方法測(cè)定梔子熊果酸的加樣回收率符合要求。2.8  3批樂(lè)山梔子熊果酸含量測(cè)定按照“2.2”項(xiàng)的提取條件提取3批樂(lè)山梔子熊果酸，按照上述測(cè)定條件分別測(cè)定熊果酸含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表19。百事通3 討論    經(jīng)過(guò)采集樂(lè)山、云南、貴州、湖南、河南等地的梔子并測(cè)定熊果酸含量，發(fā)現(xiàn)樂(lè)山梔子含量最高，證實(shí)其確為質(zhì)量?jī)?yōu)良的正宗川梔子。    實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上述熊果酸對(duì)照品溶液積分面積為1.5×1052.5×

14、105，峰高為6×1037×103，理論塔板數(shù)約1.2×104時(shí)，峰高法計(jì)算結(jié)果與真實(shí)值的誤差為1.240%，積分面積計(jì)算結(jié)果與真實(shí)值的誤差為1.415%，表明峰高法比積分面積法更接近真實(shí)值，尤其適用于熊果酸峰與齊墩果酸及其衍生物峰未完全分開(kāi)時(shí)。考慮到樂(lè)山梔子中熊果酸峰與齊墩果酸及其衍生物峰完全分開(kāi)，而且峰高法計(jì)算結(jié)果與峰面積法計(jì)算結(jié)果無(wú)顯著性差異，出于習(xí)慣考慮，本文仍采用峰面積法測(cè)定樂(lè)山梔子熊果酸的含量。表1  樂(lè)山梔子熊果酸含量(略)    冰醋酸主要用于改善熊果酸與齊墩果酸及其衍生物圖譜分離度，由于冰醋酸具有揮發(fā)性，對(duì)

15、熊果酸與齊墩果酸及其衍生物圖譜分離度存在一定程度的波動(dòng)，通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，才得到較成功的圖譜。若改用不具有揮發(fā)性的磷酸，則能改善熊果酸與齊墩果酸及其衍生物圖譜分離度的波動(dòng)性，可能更容易成功，有待于進(jìn)一步研究。    熊果酸提取溫度最好在60以下，樣品溶液置于0冰箱中貯存，測(cè)定時(shí)分析室的溫度控制在25左右，以避免熊果酸分解對(duì)結(jié)果造成影響?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1李開(kāi)泉，陳武，熊筱娟，等. 烏索酸化學(xué)、藥理及臨床應(yīng)用進(jìn)展J.中成藥，2002,24(9)：709.2熊筱娟，陳蔚云，崔江龍，等. 烏索酸對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性肝損傷及膽汁的影響J.中藥材，2003,26(8)：578.3熊筱娟，陳蔚云，崔江龍，等. 烏索酸對(duì)大鼠膽汁的影響J.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2003,31(4)：54.4張靜，鄧濤，陳會(huì)敏，等. 熊果酸抑制胃癌細(xì)胞BGC-823增殖并誘導(dǎo)凋亡J.武江大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2005,26(3)：375.5張維文，黎銀燕，張貴平，等. 熊果酸誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡的實(shí)驗(yàn)研究J.中藥材，