Bcl2、Bax、Fas、FasL、穿孔素和粒酶B在移植腎急性排斥中的共同表達(dá)和意義

1、Bcl2、Bax、Fas、FasL、穿孔素和粒酶B在移植腎急性排斥中的共同表達(dá)和意義         11-01-10 14:48:00     編輯：studa20                  作者：丁小明，薛武軍，田普訓(xùn)，劉曉東【摘要】  目的 檢測Bcl2、Bax、Fas、FasL、穿孔素和粒酶B

2、 在移植腎急性排斥時的表達(dá)水平，探討其在急性排斥中的作用及可能的分子機(jī)制。方法 選取30例移植腎穿刺活檢標(biāo)本及18例正常供腎組織為研究對象，采用免疫組化方法檢測Bcl2、Bax、Fas、FasL、穿孔素和粒酶B 的表達(dá)情況。結(jié)果 根據(jù)Banff97病理診斷標(biāo)準(zhǔn)，急性排斥標(biāo)本30例，其中A 12例，B 11例，A 5例，B 2例；所有組織中均可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，急性排斥標(biāo)本中更為明顯；Bcl2在急性排斥標(biāo)本中的表達(dá)水平低于正常組織(P<0.05)，與急性排斥的病理變化呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；Bax在兩組的表達(dá)水平無差別(P>0.05)；Fas、FasL、穿孔素和粒酶B在急性排

3、斥組中的表達(dá)水平均高于對照組，并與急性排斥的病理變化呈正相關(guān)，以FasL和粒酶B 最為明顯(P<0.01)。結(jié)論 Bcl2在腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)減少提示急性排斥反應(yīng)的發(fā)生；Bax對于預(yù)測急性排斥反應(yīng)的意義不大；Bcl2、Fas、FasL、穿孔素和粒酶B的表達(dá)變化均與急性排斥反應(yīng)密切相關(guān)，尤以FasL和粒酶B明顯，可作為監(jiān)測移植腎形態(tài)學(xué)變化、功能狀態(tài)以及判斷預(yù)后的重要指標(biāo)。 【關(guān)鍵詞】  細(xì)胞凋亡；腎臟移植；急性排斥反應(yīng)ABSTRACT: Objective  To detect intragraft expression of apoptotic molecules

4、(Bcl2, Bax, Fas, FasL, Perforin and Granzyme B) during acute rejection of human renal allografts, and access the role in acute rejection. Methods  Thirty tissue specimens were obtained from biopsy. The specimens were classified on the basis of the Banff criteria. Immunohistochemistry was used f

5、or detecting the expression of apoptotic molecules in the renal grafts. Results  There were 30 acute rejection specimens: A (n=12), B(n=11), A(n=5), and B (n=2). Apoptotic cells were found in all the samples, and more obvious during acute rejection. In the acute rejection specimens, the express

6、ion of Bcl2 decreased (P<0.05). Bax was found in all the samples at a certain level, and there was no significance between the two groups (P>0.05). Fas, FasL, Perforin and Granzyme B were increased during acute rejection, and there was a correlation of the expression of FasL and Granzyme B wit

7、h histological changes (P<0.01). Conclusion  The decrease of Bcl2 of the grafts indicates that it was involved in acute renal rejection. Bax could not reflect the onset of acute renal rejection. FasL and Granzyme are useful for monitoring the histology and function of renal allografts.KEY WO

8、RDS: apoptosis; renal transplantation; acute rejection盡管近年來隨著器官保存、組織配型技術(shù)的發(fā)展，以及新型免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，腎移植患者的人腎短期存活率均獲得了很大的提高，但遠(yuǎn)期效果并沒有得到相應(yīng)的改善。急性排斥反應(yīng)是導(dǎo)致移植腎功能喪失的最主要的因素之一，但其分子機(jī)制目前尚未完全闡明。自從1995年Krams首次提出細(xì)胞凋亡是急性排斥反應(yīng)可能的機(jī)制后，凋亡相關(guān)分子在急性排斥中的作用成為國內(nèi)外學(xué)者的重要研究領(lǐng)域。凋亡相關(guān)分子在移植腎中的表達(dá)水平與急性排斥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展、治療效果及移植物的功能形態(tài)變化密切相關(guān)，研究這些分子的作用機(jī)制有利于進(jìn)

9、一步降低急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率，促進(jìn)臨床腎移植的發(fā)展。1  材料與方法1.1  研究對象及分組  實(shí)驗(yàn)組：1997年至2003年間腎移植術(shù)后兩周內(nèi)在本中心診斷為急性排斥反應(yīng)的移植腎穿刺標(biāo)本30例，其中男性18例，女性12例，年齡22-56歲，平均36歲；對照組：18例正常供腎作為對照。1.2  組織配型  ABO血型：血型相同者20例，血型相容者10例；群體反應(yīng)性抗體(PRA)：26例為陰性，另4例分別為15%、20%、30%，40%；淋巴細(xì)胞毒交叉配型試驗(yàn)：均為陰性(<10%)；HLA配型：HLA位點(diǎn)2個抗原錯配4例，HLA位點(diǎn)3個抗原錯

10、配16例，HLA位點(diǎn)4個抗原錯配8例，HLA位點(diǎn)5個抗原錯配2例。1.3  免疫抑制劑的應(yīng)用  術(shù)前1-2d口服環(huán)孢素A(CSA)4.5-5.0mg/(kg·d)加霉酚酸酯(MMF)1.5g/d；術(shù)前口服MMF 2.0g/d、強(qiáng)的松(Pred)80mg；移植術(shù)中及術(shù)后1-4d應(yīng)用甲基強(qiáng)的松龍250-750mg/d、環(huán)磷酰胺100-200mg/d沖擊治療。術(shù)后當(dāng)血肌酐降至265.2mol/L以下時開始口服CSA。術(shù)后第1天即開始口服MMF 1.5g/d，CSA起始量4.5-5mg/(kg·d)，強(qiáng)的松維持量10-20mg/d。1.4  急性排斥的

11、診斷和治療1.4.1  診斷標(biāo)準(zhǔn)  臨床上表現(xiàn)有尿量減少、體重增加、發(fā)熱、血壓升高、移植腎區(qū)腫大和壓痛；血尿素氮和肌酐持續(xù)升高，腎功能進(jìn)行性下降；B超檢查：移植腎體積增大，皮質(zhì)増厚，回聲增強(qiáng)，Doppler顯示移植腎血液供應(yīng)差、流速慢；同位素腎動態(tài)顯示移植腎核素?cái)z取及分泌、排泄相均較差；排除其他類型的排斥反應(yīng)；排除CSA的腎毒性；腎間質(zhì)及血管周圍大量單核細(xì)胞浸潤，腎小管周圍淋巴細(xì)胞聚集，有血管內(nèi)膜炎；移植腎病理診斷為急性排斥反應(yīng)。1.4.2  急性排斥反應(yīng)的治療  首先采用大劑量的甲基強(qiáng)的松龍、環(huán)磷酰胺沖擊治療2-3d。甲基強(qiáng)的松龍沖擊治療無效時改用抗C

12、D3單克隆抗體(OKT3)或者抗胸腺細(xì)胞免疫球蛋白(ATG)?？古懦庵委煏r間7-10d，待排斥反應(yīng)逆轉(zhuǎn)后恢復(fù)三聯(lián)免疫抑制方案。腎血管擴(kuò)張藥物的應(yīng)用：利尿合劑的使用：鹽酸多巴胺20mg、鹽酸酚妥拉明10mg、速尿20-80mg、654-2 10mg，加入50g/L(5%)葡萄糖注射液500mL中靜脈點(diǎn)滴，每日1-3次；鹽酸川穹嗪120mg加入50g/L(5%)葡萄糖注射液或生理鹽水250-500mL中靜脈點(diǎn)滴，每日1次。這兩種液體持續(xù)應(yīng)用至腎功能恢復(fù)正常。1.5  主要試劑  鼠抗人Bcl2單抗(IgG1)、鼠抗人Bax單抗(IgG2b)、兔抗人FAS多抗(IgG)、兔抗人F

13、ASL多抗(IgG)均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品；鼠抗人穿孔素單抗(IgG)為深圳晶美生物公司產(chǎn)品；鼠抗人粒酶B單抗(IgG2a)，免疫組化SP染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、中性樹膠均為北京中山生物技術(shù)公司產(chǎn)品。1.6  實(shí)驗(yàn)方法1.6.1  常規(guī)病理技術(shù)  移植腎穿刺標(biāo)本立即放入新鮮配制的10%(體積分?jǐn)?shù))甲醛溶液中固定，12h后梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察移植腎組織中主要的凋亡細(xì)胞類型。所有組織均先按Banff 97分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。1.6.2  免疫組化染色  嚴(yán)格按照SP染色試劑盒說明書進(jìn)行，實(shí)

14、驗(yàn)中每種指標(biāo)均設(shè)置陽性和空白對照(以PBS代替一抗)。免疫組化染色以出現(xiàn)明顯棕黃色即為陽性結(jié)果，若DAB顯色15min組織仍無著色則為陰性結(jié)果。所檢測蛋白表達(dá)半定量：50%以上的腎小管呈陽性表達(dá)；：25%-50%的腎小管呈陽性表達(dá)；+：25%以下的腎小管呈陽性表達(dá)。1.7  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  用Wilcoxon兩樣本比較法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Spearman等級相關(guān)分析。統(tǒng)計(jì)分析利用SPSS10.0軟件進(jìn)行，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2  結(jié)果2.1  Banff 97診斷分類1  急性排斥反應(yīng)組中，A(明顯的間質(zhì)浸潤，即25%以上實(shí)質(zhì)受累；中度小管炎病灶，即>4個單核細(xì)胞/每小管橫斷面或10個小管細(xì)胞)占40%，B(明顯的間質(zhì)浸潤；嚴(yán)重小管炎病灶，即>10個單核細(xì)胞/每小管橫斷面或10個小管細(xì)胞)36.6%，A(輕度到中度動脈內(nèi)膜炎)16.6%，B(嚴(yán)重動脈內(nèi)膜炎，管腔狹窄25%以上)6.6%。2.2  移植腎組織中的細(xì)胞凋亡  HE染色可見，凋亡細(xì)胞的核呈藍(lán)黑色，胞漿為淡紅色，單個散在地分布在組織中。表現(xiàn)為核染色質(zhì)致密濃縮，核碎裂等，可發(fā)現(xiàn)凋亡小體。依