cmpl在真性紅細(xì)胞增多癥患者骨髓CD34陽性細(xì)胞及血小板上的表達(dá)

1、cmpl在真性紅細(xì)胞增多癥患者骨髓CD34陽性細(xì)胞及血小板上的表達(dá)                           作者：白潔， 邵宗鴻， 施均， 賈海蓉， 孫娟【摘要】  本研究了解真性紅細(xì)胞增多癥(PV)患者血小板膜及骨髓CD34陽性細(xì)胞表面TPO受體（c?mpl）蛋白及骨髓造血細(xì)胞c?mpl mRNA表達(dá)情況。應(yīng)用雙色

2、流式細(xì)胞術(shù)檢測13例PV患者及15名正常對照者骨髓CD34陽性細(xì)胞表面c?mpl蛋白表達(dá)；應(yīng)用單色流式細(xì)胞術(shù)檢測15例PV患者及15名正常對照者血小板表面c?mpl蛋白表達(dá)；應(yīng)用RT?PCR方法檢查PV患者及正常對照者骨髓造血細(xì)胞c?mpl mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果表明： CD34陽性細(xì)胞c?mpl蛋白表達(dá)在PV患者為0.99±0.14，與正常對照（0.92±0.12）相比無差別（p>0.05）；血小板c?mpl蛋白表達(dá)在PV患者為20.33±4.84，與正常對照（23.50±3.64）相比無差別（p>0.05）；骨髓造血細(xì)胞c?mpl mR

3、NA與正常組相比也無明顯差別（p>0.05。） 結(jié)論： PV患者骨髓CD34陽性細(xì)胞、血小板膜c?mpl蛋白及骨髓造血細(xì)胞c?mpl的mRNA表達(dá)無明顯異常。 【關(guān)鍵詞】  真性紅細(xì)胞增多癥    Expressions of c?mpl Proteins on CD34+ Bone Marrow Cells and Platelets of the Patients with Polycythemia Vera       Abstract    The o

4、bjective of this study was to investigate the expressions of TPO receptor (c?mpl) proteins on CD34 positive  bone marrow cells (CD34+ BMCs),  platelets   and  the expression of c?mpl mRNA in bone marrow cells of the patients with polycythemia vera (PV). The expressions of c?

5、mpl proteins on CD34+ bone marrow hematopoietic cells  of 13 PV patients  and 15 normal controls were assessed by bicolor flow cytometry  and the expressions of c?mpl proteins on platelets of 15 PV patients and 15 normal controls were assessed by monocolor flow cytometry, and the expr

6、essions of c?mpl mRNA in bone marrow hematopoietic cells (BMHCs)  were assessed by RT?PCR.  The results showed that no difference was found between the expression of c?mpl proteins on CD34+  BMHCs   of PV patients（0.99±0.14） and that of normal controls （0.92±0.12）（

7、p>0.05）. There was no difference too between the expression of c?mpl protein on platelets in PV patients（20.33±4.84） and that in normal controls （23.50±3.64）（p>0.05）.  No diffe?rence between the expression of c?mpl mRNA in BMHCs  of PV patients and that in normal controls&#

8、160; was seen. In conclusion, the expressions of c?mpl proteins on CD34+ BMHCs,   platelets  and  c?mpl mRNA in BMHCs of PV patients were not obviously abnormal.    Key words    polycythemia vera;  platelet; bone marrow hematopoietic cell; CD34

9、positive;  c?mpl    J Exp Hematol 2007; 15(5):1061-1064    真性紅細(xì)胞增多癥（PV）屬骨髓性增殖性疾?。∕PD），是由多潛能造血干祖細(xì)胞發(fā)生突變而引起的，其造血干祖細(xì)胞存在高增殖性及低凋亡性1，2。近年來的大量研究證實，PV造血祖細(xì)胞對多種細(xì)胞因子高度敏感3-5，說明其造血細(xì)胞表面細(xì)胞因子受體或其信號傳導(dǎo)系統(tǒng)可能存在異常，因此其造血干祖細(xì)胞表面細(xì)胞因子受體及PV信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的研究有助于對其發(fā)病機(jī)制的了解。    PV患者紅系祖細(xì)胞在不加外

10、源性EPO時可以形成內(nèi)源性紅細(xì)胞集落（EEC）6-8，但多項研究證明PV患者EPO受體及EPO與配體的親和能力是正常的，未發(fā)現(xiàn)EPO受體基因的異常9。血小板生成素（TPO）是調(diào)節(jié)血小板生成的細(xì)胞因子，其構(gòu) 型上有一個153個氨基酸的結(jié)構(gòu)域與EPO相似。在體外TPO不但對巨核前體細(xì)胞而且對造血祖細(xì)胞的增殖分化均產(chǎn)生直接作用10，11。中國實驗血液學(xué)雜志  J Exp Hematol 2007; 15(5)cmpl在真性紅細(xì)胞增多癥患者骨髓CD34陽性細(xì)胞及血小板上的表達(dá)我們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測了15例PV患者及15名正常對照者血小板表面TPO受體（c?mpl）。應(yīng)用RT?PCR方法檢查P

11、V患者及對照骨髓造血細(xì)胞c?mpl mRNA表達(dá)情況，以闡明c?mpl在PV發(fā)病機(jī)制中的意義?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。    材料和方法    檢測對象    2002年1月至2003年10月在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院診治的PV患者15例，正常對照15名。全部患者的診斷及療效判定依據(jù)國內(nèi)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)12。15例PV患者中11例為初診未治療患者，2例單純放血治療，2例應(yīng)用羥基脲干擾素治療，平均治療時間為7個月，停藥2周以上且血象仍高于正常。15名正常對照，男9例，女6例，中位年齡47。15例PV患者的臨床和檢驗指標(biāo)見

12、表1。    試劑    淋巴細(xì)胞分離液Facoll?Paque(1.077 g/ml)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所生產(chǎn)；兔抗人c?mpl單克隆抗體由日本麒麟公司饋贈。FITC標(biāo)記羊抗兔IgG購自美國Southern Biotech公司；PE標(biāo)記的CD34、IgG1抗體試劑盒購自美國Becton Dickinson公司。RNA提取試劑（TRIZOLTM reagent）由Gibco公司生產(chǎn)；Taq plus聚合酶、c?mpl引物，參照文獻(xiàn)6設(shè)計，由上海生物工程有限公司合成；紫外分光光度計由美國Shimadzu公司生產(chǎn)；PCR擴(kuò)增儀由美

13、國FE?CETUS公司生產(chǎn)；紫外照相機(jī)購自日本Olympus公司；流式細(xì)胞儀(FACS) 由美國Becton Dickinson公司生產(chǎn)。    骨髓CD34陽性細(xì)胞表面c?mpl表達(dá)的檢測    取肝素抗凝新鮮骨髓200 l，將人AB型血清加入新鮮骨髓，孵育5分鐘，封閉非特異抗體。加入兔抗人c?mpl IgG, 4避光孵育30分鐘。用含0.5% BSA及0.6%檸檬酸鈉的PBS液洗滌2遍，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，4避光孵育30分鐘。加入PE標(biāo)記的CD34單克隆抗體，避光4孵育45分鐘。加入10溶血素孵育10分鐘，棄除溶血素，應(yīng)用

14、PBS洗滌2遍，加1的多聚甲醛固定，24小時內(nèi)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測。1×106骨髓細(xì)胞加入FITC/PE標(biāo)記的同型特異抗體同時孵育作為陰性對照。    血小板表面c?mpl表達(dá)的檢測    取3.8%的檸檬酸鈉抗凝的新鮮靜脈血5 ml，以1 600×g離心10分鐘，吸取取富含血小板的血漿，再以7 500×g離心12分鐘，將待測血小板用含0.5% BSA及0.6%檸檬酸鈉的PBS液洗滌2遍。取1×109血小板，再用含0.5% BSA及0.6%檸檬酸鈉的PBS液洗滌2遍，1小時內(nèi)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測。&

15、#160;   c?mpl表達(dá)的RT?PCR法檢測    ?。?-10）×106骨髓單個核細(xì)胞，應(yīng)用TRIZOL一步法抽提取總RNA后應(yīng)用紫外分光光度計測定其濃度和純度。C?mpl引物序列如下： c?mpl上游引物 5'?CCTACTGCTGCTAAAGTGGCAAT?3'； 下游引物 5'?CAATAGCTTAGTGGTAGGTAGGA ?3'。     PCR體系50 l，含待測DNA 2 l， 2.5 mmol/LdNTP 1 l, Taq plus聚合酶2

16、.5 U，10×緩沖液5 l, 10 mmol/l上游引物及下游引物各2.5 l，加無菌雙蒸水至50 l。使用PCR擴(kuò)增儀（FE?CETUS公司）擴(kuò)增。C?mpl的PCR條件參考文獻(xiàn)13為： 94預(yù)變性7分鐘，94變性45秒，52退火45秒，72延伸45秒，72再延伸5分鐘，共35個循環(huán)。取10 l擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5瓊脂糖凝膠電泳，電壓10 V/cm。應(yīng)用紫外照相機(jī)（日本Olympus公司）記錄結(jié)果。PCR的擴(kuò)增長度應(yīng)為548 bp(?actin)、368 bp(c?mpl)。    統(tǒng)計學(xué)方法    率的比較采用Pearso

17、n 卡方檢驗或Fisher精確概率法分析；均數(shù)比較采用t檢驗；皆用SPSS軟件處理。百事通     結(jié)    果    骨髓CD34陽性細(xì)胞表面c?mpl表達(dá)    骨髓CD34陽性細(xì)胞表面c?mpl表達(dá)在PV患者為0.99±0.14，與正常對照（0.92±0.12）相比無差別（p>0.05）(表2）。    血小板表面c?mpl表達(dá)    血小板表面c?mpl蛋白表達(dá)在PV患者為20.33

18、±4.84，與正常對照（23.50±3.64）相比無差別（p>0.05）（表2）。    c?mpl mRNA表達(dá)    骨髓造血細(xì)胞c?mpl mRNA 在PV患者檢出率為46.7%(7/15)與正常組40%(6/15)比較無明顯差別（附圖）。討    論    近年來人們重視到PV患者巨核細(xì)胞集落（CFU?MK）對TPO高度敏感。即PV的造血干、祖細(xì)胞（CD34+細(xì)胞）在沒有TPO條件下能夠形成CFU?MK。因此人們認(rèn)為TPO介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)異

19、?？赡芘cPV發(fā)病有關(guān)14。    有人報道敲除小鼠TPO受體（c?mpl）時，多潛能造血干細(xì)胞和髓系、紅系定向祖細(xì)胞數(shù)均減少。若小鼠c?mpl過度表達(dá)，可導(dǎo)致過度造血和骨髓纖維化。c?mpl異位表達(dá)可引起致命的紅細(xì)胞增多癥。應(yīng)用帶有截短的c?mpl基因的髓系增殖性白血病病毒(MPLV)可誘導(dǎo)大鼠紅細(xì)胞、血小板、粒細(xì)胞增多及脾大。在體外用MPLV轉(zhuǎn)染造血細(xì)胞，可使造血祖細(xì)胞不依賴于生長因子而形成紅細(xì)胞集落15。缺乏EPO受體的胚胎中，TPO可使紅細(xì)胞集落形成6，且可以阻止去EPO受體的紅系祖細(xì)胞凋亡16。    Dai等3，4報道，34

20、名PV患者血小板均缺失c?mpl，缺失c?mpl血小板與TPO共孵育，不能激活JAK2/TYK2，以至于STAT5不能進(jìn)行酪氨酸磷酸化。他們應(yīng)用C末端mpl抗血清證明了PV患者中c?mpl翻譯后加工過程受損。mpl胞漿外結(jié)構(gòu)域第4位點缺乏翻譯后糖化修飾，并認(rèn)為這與其細(xì)胞內(nèi)高爾基器運輸缺陷有關(guān)。    Muta等5應(yīng)用免疫雜交方法得出了不同的結(jié)論。他們發(fā)現(xiàn)，15名PV患者中有8名c?mpl表達(dá)水平減低，而7名表達(dá)正常。他們認(rèn)為c?mpl表達(dá)水平及其功能完整性在PV患者存在異質(zhì)性。    在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，CD34陽性細(xì)胞、血小板表面c

21、?mpl蛋白表達(dá)及骨髓造血細(xì)胞c?mpl mRNA表達(dá)在PV患者與正常對照者中均無差別。這表明PV患者高增殖和低?亡與c?mpl無關(guān)，可能與細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)系統(tǒng)共同通路有關(guān)。【參考文獻(xiàn)】  1白潔， 邵宗鴻， 劉鴻等. 真性紅細(xì)胞增多癥患者骨髓CD34陽性細(xì)胞?亡及增殖特征研究. 中華血液學(xué)雜志，2004；25：195-1972白潔， 邵宗鴻， 劉鴻等. 真性紅細(xì)胞增多癥患者骨髓CD34陽性細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá). 中華血液學(xué)雜志，2004；25：617-6203Dai CH, Krantza SB, Green WF, et al. Polycythemia vera . Burs

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