臍帶血基礎(chǔ)免疫物質(zhì)分析

1、臍帶血基礎(chǔ)免疫物質(zhì)分析    【摘要】  目的： 通過胎兒臍帶血免疫狀況的研究，為臍帶血有形和無形成分在免疫方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法： 應(yīng)用血液常規(guī)檢驗、試劑盒以及液體閃爍計數(shù)儀和流式細胞儀對白細胞分類、免疫球蛋白、細胞因子、臍血T細胞抗原表面標(biāo)志和臍血有核細胞NK活性進行測定。結(jié)果： 與成人外周血中免疫成分相比，胎兒臍帶血中IgA和IgE含量明顯減少，IgG無明顯改變；臍血漿中GCSF和GMCSFCSF和GMCSF等相關(guān)造血因子和原始的造血干細胞成分，雖然淋巴細胞的發(fā)育多處于幼稚期，但大量相關(guān)的免疫

2、細胞和細胞因子均可作為免疫治療的基礎(chǔ)物質(zhì)?！娟P(guān)鍵詞】  細胞因子類 免疫球蛋白類 血液 臍帶Abstract Objective: To study the immunity state of foetus cord blood, so as to provide theorty basis for the application of 

3、immunological substances from foetus cord blood in hematoplasma immunotherapy. Methods： Using blood routine test kits, liquid scintillation counter and flow cytometry to detect leukocyt

4、e classfication, immune globulin, T cell antigen surface marker and NK cell respectively. Results：IgA and IgE in cord blood were much less than in adult peripheral blood,

5、 but IgG was nearly the same as that in adult peripheral. GCSF and GMCSF in cord blood plasma were 11.37 and 15.81 times respectively of those in adult per

6、ipheral blood,while tumor necrosis factor (TNF) was a little bit lower, and heterophil granulocyte level was close to the lower limit in adult peripheral blood. Metagranulocyt

7、e and myelocyte levels were obviously lower than those in adult peripheral blood.Leukomonocyte level was about the same as that of adult.The counts of subpopulations CD3+,CD4+

8、,CD8+ of T cell in cord blood were significantly lower than those in adult peripheral blood while those of CD34+ and CD45RA were higher.NK cell killing activity was&

9、#160;slightly lower than that of adult blood. Conclusion： Relative hemopoiesis factors and native hematopoietic stem cell components, GCSF and GMCSF,  are abundant in cord blo

10、od and can be widely used in clinical immunotherapy, even though most T lymphocytes in cord blood are in naive stages of development.Key words tissue factor; cytokines；im

11、munoglobulins；blood；umbilical cord       臍血中的有形和無形成分與臍血的免疫活性密切相關(guān)，各種活性因子的存在對不同臍血細胞的發(fā)育和功能起重要的調(diào)節(jié)作用13。這些活性因子和免疫細胞既與臍血造血干細胞或祖細胞的成功移植密切相關(guān),也與臍血中的免疫成分在抗腫瘤中的廣泛應(yīng)用有關(guān)。有關(guān)臍血中的有形和無形免疫活性成分的檢測國內(nèi)報道很少，研究臍血中相關(guān)的基礎(chǔ)免疫物質(zhì)具有十分重要的意義。1  材料與方法1.1  胎兒臍帶血  

12、0; 采自產(chǎn)科健康成人孕婦的足月正常胎兒臍帶，胎兒娩出后立即用止血鉗夾住臍帶，一把止血鉗用臍帶圈套好，距臍輪1 cm 處夾住臍帶，另一把鉗與此相距2 cm，并立即剪斷臍帶。迅速選擇母體端臍帶血管鼓起處作為穿刺部位，常規(guī)消毒采血，肝素抗凝袋搜集，6 h內(nèi)應(yīng)用。1.2  免疫球蛋白檢測 用酶聯(lián)免疫吸附方法檢測，試劑盒購自美國EIBIO公司，檢測方法按試劑盒說明書操作。1.3  細胞因子檢測試劑盒GCSF、GMCSF、TNF購自北京吉比埃生物技術(shù)開發(fā)有限公司，檢測方法按試劑盒說明書操作。1.4

13、0; 白細胞分類推制厚薄適宜的血涂片，用瑞特染色法染片。油鏡下計數(shù)200個白細胞，按其形態(tài)特征進行分類，計數(shù)各類細胞所占百分比的平均值。1.5  臍血T細胞表面抗原標(biāo)志無菌抽取成人外周血2 ml,EDTA抗凝(每毫升加20 g/L EDTA溶液0.5 ml)，Hank's 液等倍稀釋，淋巴細胞分層液分離淋巴細胞(1 500 r/min，20 min)，收獲單個核細胞層，Hank's液洗3次(1 500 r/min，5 min)，用RPMI1

14、640完全培養(yǎng)液調(diào)制成濃度為1×106/ml細胞，RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)(100 ml/L胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺，100 U青霉素，50 g鏈霉素，20 g PHAP)。經(jīng)PHAP激活24 h后，收集上層細胞懸液備用。調(diào)整MNC濃度為1×107/ml于試管中，取細胞懸液100 l 分別加入CD3、CD4、CD8、CD34和CD45RA熒光標(biāo)記單克隆抗體各20 l，分別加入臍帶血有核細胞和外周血淋巴細胞100 l，室溫避光孵育30 min。

15、洗滌后制備MNC懸液(1×106/ml)。流式細胞儀檢測（FACS Vantage，美國BECKMAN COULTER公司）。每個樣品收集2 000個細胞。用FCM軟件分析，計算各標(biāo)記細胞的百分率，最后數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS統(tǒng)計軟件處理。1.6  臍血自然殺傷細胞（NK）活性測定    靶細胞的制備：取指數(shù)生長期的K562細胞，濃度為1×106/ml，加入3HTdR，20 mCi/L,37,5 CO2條件下培養(yǎng)4 h，收集細胞并調(diào)濃度為1×105/ml備

16、用。效應(yīng)細胞制備：制備臍血有核細胞，并種植于培養(yǎng)瓶內(nèi)4×107/20 ml，37 ,5 %CO2條件下培養(yǎng)72 h，收集細胞，并調(diào)濃度為1×107/ml備用。混合培養(yǎng)：取96孔培養(yǎng)板，加靶細胞懸液每孔100 l（細胞對照組除外），再加入效應(yīng)細胞懸液每孔100 l（靶細胞對照組除外），混合后培養(yǎng)18 h，收集后液體閃爍分析儀（美國PACKARD公司)測量。NK活性計算公式：臍帶血基礎(chǔ)免疫物質(zhì)分析NK細胞活性效應(yīng)細胞(cpm)-細胞對照組(cpm)靶細胞對照組cpm×100%2  

17、;結(jié)果2.1  免疫球蛋白    臍帶血與成人外周血中IgG沒有明顯差異，而臍帶血中IgA含量明顯少于成人外周血（P0.002），IgE也明顯減少（P0.01），見表1。表1  臍帶血和成人外周血中免疫球蛋白比較（略）注：(1)P0.002，(2)P0.01。2.2  免疫相關(guān)的細胞因子2.3  胎兒臍帶血白細胞分類    從表3中可以看出，中性粒細胞基本接近成人外周血的低值，而中、晚幼粒細胞明顯少于成人外周血，淋巴細胞數(shù)與成人外周血相

18、當(dāng)。表3  臍血和成人外周血中白細胞分類（略）2.4  T細胞抗原表面標(biāo)志從表4中可以看出臍血T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD34+細胞數(shù)不同于成人外周血，其中CD3+、CD4+和CD8+T細胞數(shù)低于外周血，而CD34+、CD45 RA細胞則高于外周血。表4  臍血和成人外周血T細胞抗原表面標(biāo)志（略）注：(1)P0.05，(2)P0.01，臍血與外周血比較。2.5  臍帶血NK活性     臍血細胞NK活性略低于成人外周血，與國外報道結(jié)果一致3

19、  討論    胎兒臍帶血中含有豐富的人體需要的有形成分和無形成分4，為了使這些有效成分科學(xué)、合理的利用，對臍帶血中免疫成分的進一步分析是非常必要的。本研究表明，臍帶血與成人外周血相比，IgG沒有明顯變化，而IgA含量卻明顯減少，IgE含量也明顯減少。進一步研究發(fā)現(xiàn)，臍血中除含有免疫球蛋白之外，還含有多種造血刺激因子，其中GCSF、GMCSF因子水平高于成人外周血，而TNF水平略低于成人外周血。豐富的造血刺激因子對于臍帶血在腫瘤的臨床治療具有重要意義。從有核細胞的分析結(jié)果可以看出，臍帶血中性粒細胞含量基本接近成人外周血的低值，而中、晚

20、幼粒細胞明顯少于成人外周血；淋巴細胞數(shù)與成人外周血含量相當(dāng)。T淋巴細胞的分析可以看出，臍血T細胞CD3+、CD4+、CD8+ 亞群細胞數(shù)低于成人外周血，CD4細胞數(shù)與成人外周血相似，CD4/CD8 比值高于成人,但CD8細胞數(shù)低于成人外周血；而CD34+細胞數(shù)明顯高于成人外周血中的含量，是成人外周血的7.28倍。臍帶血中CD45RA細胞則高于成人外周血，CD45RA細胞的增多顯示了臍帶血中免疫細胞的原始性，說明臍帶血中免疫細胞功能不成熟?？乖磉_和功能活性低下，臍血的這種相對低的免疫活性在一定程度上有助于移植后造血細胞功能的重建和減輕GVHD的發(fā)生。臍血NK的殺傷活性略低于

21、成人外周血，此點與Pranke P等報道基本相同5。NK是高度保守的具有非特異殺傷活性的一類免疫細胞,高表達的穿孔索可以介導(dǎo)細胞毒作用,可以在免疫治療上充分發(fā)揮作用。綜上所述，臍血中存在著大量的與免疫相關(guān)的有形和無形成分6，這些作為免疫治療的基礎(chǔ)可能為今后的臨床免疫治療展示出良好的應(yīng)用前景。【參考文獻】  1王利，劉德立. 白細胞介素-2對臍血CIK細胞體外增殖活性的影響J. 中華中醫(yī)學(xué)雜志，2005(4): 265-266.2劉廣金, 郭麗蓉, 喬振華.臍血免疫細胞特性的研究J. 白血病·淋巴瘤, 2002(3): 160-161.3顧東生,劉 斌,韓忠朝,等.臍帶血干細胞的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究J.生命科學(xué),2006(4):323-327.4蔡志揚, 錢寶華, 郭峰,等. 臍